CN105409620A - 应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法 - Google Patents

应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法 Download PDF

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唐美琼
闵丹丹
李刚
李林轩
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
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    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01G22/00—Cultivation of specific crops or plants not otherwise provided for

Abstract

本发明公开了一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，包括以下步骤：将根瘤菌菌液分布于山豆根植株的根系周围，之后将山豆根植株于日间25～30℃、夜间20～25℃、光强2500～3500lx条件下培养160～190天，其中，在培养过程中添加Fahraeus无氮营养液，本发明通过人工给山豆根接种根瘤菌，可以明显促进山豆根根瘤的形成，植株的有效成分含量大幅度增加，提高了药材质量，其原因可能是生物碱是含氮化合物，氮素的供给利用在山豆根生物碱的生物合成和积累中起重要作用。

Description

应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法
技术领域
本发明涉及一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法。更具体地说，本发明涉及一种应用根瘤菌可有效提高山豆根有效药用成分含量的方法。
背景技术
山豆根为豆科植物越南槐(SophoratonkinensisGagnep.)的干燥根和根茎，主产广西，又名广豆根。具有清火解毒、消肿止痛等功效；其有效成分以苦参碱和氧化苦参碱为主，具有抗炎、抗心律失常、抗肿瘤等生物活性。野生山豆根地域分布狭窄，零星生长于石山区石缝之中，野生资源已濒临枯竭，近年来科技人员已对山豆根的人工繁殖栽培进行研究，并取得了一定的成果。在山豆根的栽培生产中，如果能利用豆科植物与根瘤菌的共生固氮效应满足植物对氮素的需求，对提高药材的质量及发展可持续农业、保护生态环境都有重要意义。但目前对豆科药材的生物固氮及其结瘤固氮对药材质量影响等相关研究甚少，对山豆根的研究更是罕见，开发利用山豆根根瘤菌资源、提高山豆根原料药材的质量已经成了市场迫切请求。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，本发明通过人工给山豆根接种根瘤菌，可以明显促进山豆根根瘤的形成，植株的有效成分含量大幅度增加，提高了药材质量，其原因可能是生物碱是含氮化合物，氮素的供给利用在山豆根生物碱的生物合成和积累中起重要作用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，包括以下步骤：
将根瘤菌菌液分布于山豆根植株的根系周围，之后将山豆根植株于日间25～30℃、夜间20～25℃、光强2500～3500lx条件下培养160～190天，其中，在培养过程中添加Fahraeus无氮营养液。
优选的是，所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的制作过程如下：
步骤一、破碎经表面灭菌处理的山豆根根瘤，取其汁液，用所述汁液在加有0.02～0.03g/L刚果红的YMA固体培养基上划线，25～30℃恒温培养至菌落出现，连续培养，获得根瘤菌菌株；
步骤二、将根瘤菌菌株接种到YMA液体培养基中，得根瘤菌菌液。
优选的是，所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述山豆根植株经以下步骤培育得到：
选取体积比为1:1的水洗河沙和蛭石为培育基质，115～125℃高压灭菌0.5～1.5h；
将山豆根种子于55～65℃水中浸泡至吸胀，自然冷却，用体积浓度为75％的乙醇和质量分数为0.1％的氯化汞进行表面消毒，在所述培育基质中25～30℃培养至发芽后，移栽，得待接种的山豆根植株，其中，花盆经过以下处理：用质量分数为5％的高锰酸钾溶液浸泡5～6h后洗净。
优选的是，所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述步骤一中山豆根根瘤的表面灭菌处理，具体为：挑选新鲜、饱满、个大的山豆根根瘤，在无菌的条件下，体积浓度为95％的乙醇侵泡0.5～1.5min，无菌水冲洗2～4次，质量分数为0.1％的氯化汞侵泡2～4min，无菌水冲洗3～5次。
优选的是，所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的用量为一棵山豆根植株1～4mL。
优选的是，所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，培养时间为180天。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过人工给山豆根接种根瘤菌，可以明显促进山豆根根瘤的形成，植株的有效成分含量大幅度增加，提高了药材质量，其原因可能是生物碱是含氮化合物，氮素的供给利用在山豆根生物碱的生物合成和积累中起重要作用；
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中的山豆根根瘤菌的生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实施例1>
一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，包括以下步骤：
将根瘤菌菌液分布于山豆根植株的根系周围，之后将山豆根植株于日间25℃、夜间20℃、光强2500lx条件下培养160天，其中，在培养过程中添加Fahraeus无氮营养液。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的制作过程如下：
步骤一、破碎经表面灭菌处理的山豆根根瘤，取其汁液，用所述汁液在加有0.02g/L刚果红的YMA固体培养基上划线，25℃恒温培养至菌落出现，连续培养，获得根瘤菌菌株；
步骤二、将根瘤菌菌株接种到YMA液体培养基中，得根瘤菌菌液。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述山豆根植株经以下步骤培育得到：
选取体积比为1:1的水洗河沙和蛭石为培育基质，115℃高压灭菌0.5h；
将山豆根种子于55℃水中浸泡至吸胀，自然冷却，用体积浓度为75％的乙醇和质量分数为0.1％的氯化汞进行表面消毒，在所述培育基质中25℃培养至发芽后，移栽，得待接种的山豆根植株，其中，花盆经过以下处理：用质量分数为5％的高锰酸钾溶液浸泡5h后洗净。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述步骤一中山豆根根瘤的表面灭菌处理，具体为：挑选新鲜、饱满、个大的山豆根根瘤，在无菌的条件下，体积浓度为95％的乙醇侵泡0.5min，无菌水冲洗2次，质量分数为0.1％的氯化汞侵泡2min，无菌水冲洗3次。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的用量为一棵山豆根植株1mL。
<实施例2>
一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，包括以下步骤：
将根瘤菌菌液分布于山豆根植株的根系周围，之后将山豆根植株于日间28℃、夜间23℃、光强3000lx条件下培养180天，其中，在培养过程中添加Fahraeus无氮营养液。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的制作过程如下：
步骤一、破碎经表面灭菌处理的山豆根根瘤，取其汁液，用所述汁液在加有0.025g/L刚果红的YMA固体培养基上划线，28℃恒温培养至菌落出现，连续培养，获得根瘤菌菌株；
步骤二、将根瘤菌菌株接种到YMA液体培养基中，得根瘤菌菌液。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述山豆根植株经以下步骤培育得到：
选取体积比为1:1的水洗河沙和蛭石为培育基质，120℃高压灭菌1h；
将山豆根种子于60℃水中浸泡至吸胀，自然冷却，用体积浓度为75％的乙醇和质量分数为0.1％的氯化汞进行表面消毒，在所述培育基质中28℃培养至发芽后，移栽，得待接种的山豆根植株，其中，花盆经过以下处理：用质量分数为5％的高锰酸钾溶液浸泡5.5h后洗净。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述步骤一中山豆根根瘤的表面灭菌处理，具体为：挑选新鲜、饱满、个大的山豆根根瘤，在无菌的条件下，体积浓度为95％的乙醇侵泡1min，无菌水冲洗3次，质量分数为0.1％的氯化汞侵泡3min，无菌水冲洗4次。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的用量为一棵山豆根植株3mL。
<实施例3>
一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，包括以下步骤：
将根瘤菌菌液分布于山豆根植株的根系周围，之后将山豆根植株于日间30℃、夜间25℃、光强3500lx条件下培养190天，其中，在培养过程中添加Fahraeus无氮营养液。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的制作过程如下：
步骤一、破碎经表面灭菌处理的山豆根根瘤，取其汁液，用所述汁液在加有0.03g/L刚果红的YMA固体培养基上划线，30℃恒温培养至菌落出现，连续培养，获得根瘤菌菌株；
步骤二、将根瘤菌菌株接种到YMA液体培养基中，得根瘤菌菌液。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述山豆根植株经以下步骤培育得到：
选取体积比为1:1的水洗河沙和蛭石为培育基质，125℃高压灭菌1.5h；
将山豆根种子于65℃水中浸泡至吸胀，自然冷却，用体积浓度为75％的乙醇和质量分数为0.1％的氯化汞进行表面消毒，在所述培育基质中30℃培养至发芽后，移栽，得待接种的山豆根植株，其中，花盆经过以下处理：用质量分数为5％的高锰酸钾溶液浸泡6h后洗净。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述步骤一中山豆根根瘤的表面灭菌处理，具体为：挑选新鲜、饱满、个大的山豆根根瘤，在无菌的条件下，体积浓度为95％的乙醇侵泡1.5min，无菌水冲洗4次，质量分数为0.1％的氯化汞侵泡4min，无菌水冲洗5次。
所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，所述根瘤菌菌液的用量为一棵山豆根植株4mL。
1.1根瘤菌的采集及分离纯化
分别在广西药用植物园、隆安县、靖西县栽培的山豆根根系上采集新鲜、饱满、个大的根瘤，放入装有无水氯化钙的具塞试管内带回实验室进行分离纯化。自来水冲洗干净采集的根瘤，在无菌的条件下，体积浓度为95％的乙醇侵泡1min，无菌水冲洗3次，质量分数为0.1％的氯化汞侵泡3min，无菌水冲洗4次，然后置于灭菌的研钵中，用无菌玻棒挤压、破碎根瘤，取汁液在加有0.025g/L刚果红的YMA固体培养基上划线，28℃恒温培养至菌落出现，挑选典型单菌落连续培养，获得根瘤菌菌株YY、LA1、LA2、JX2、JX3。
表1山豆根根瘤采集地点及所得菌株
1.2生长特性测定革兰氏染色参照《常见细菌系统鉴定手册》按常规方法进行。生长曲线测定：将根瘤菌接种到用YMA液体培养基中，接种后每隔4h用紫外可见分光光度计在600mn波长处测定各参试菌株培养液的光密度，以培养时间为横坐标，光密度值为纵坐标绘制生长曲线。BTB反应:将菌种接种于含0.1％溴麝香草酚蓝的YMA培养基上，在28℃培养6～10d，观察颜色变化。
1.3生理生化特性测定以YMA液体培养基为基本培养基。温度试验设置共设8个单一温度和一个耐高温处理，单一温度分别为4，10，15，20，25，30，35，40℃，耐高温处理先放在60℃处理10分钟，再置28℃摇床中培养；酸碱度影响试验设置pH值为4，5，6，7，8，9，10，11，12共9个梯度；耐盐性试验设置NaCl终浓度为0.1％，0.5％，1.0％，2.0％，3.0％共5个梯度；抗生素抗性试验，添加不同种类不同浓度的抗生素至YMA液体培养基中；碳源和氮源利用实验，以去掉碳源的White培养基为基础培养基，分别加入各种碳源或氮源，使终浓度为1％(W/Y),调节pH至7.0。灭菌后接入供试菌株，以YMA液体培养基为阳性对照，不加任何碳源为阴性对照，28℃摇床中、200r·min-1培养5d后，显微镜下检测根瘤菌的生长状况。
以上试验均设置3次重复。
1.4回接试验培养基质为1:1体积混合的水洗河沙和蛭石，121℃高压灭菌1h。山豆根种子来源于广西药用植物园科研基地。山豆根种子60℃左右热水中侵泡，并让其自然冷却，吸胀后分别用体积浓度为75％的乙醇和质量分数为0.1％的氯化汞进行表面消毒，在无菌的水洗河沙中28℃培养至发芽后选取长势一致的植株移栽至花盆中。花盆用5％浓度的高锰酸钾侵泡5～6h后清洗干净。
供试菌株分别接种到山豆根幼苗根系上作为接种处理，以不接种根瘤菌为对照处理(CK)，共6个处理，每个处理种植3盆，每盆15株。接种方法：移栽山豆根幼苗后，用移液枪吸取相应的根瘤菌菌液2mL注于幼苗根系周围，CK处理用等量的无菌水代替。将植株置于日间28℃、夜间22℃、光强3000lx的无菌光照培养室内培养。用Fahraeus无氮营养液补充营养元素和水分。培养180d后取出植株清洗，统计山豆根幼苗根瘤数量。
1.5苦参碱与氧化苦参碱的含量测定
测定方法参照2010年《中国药典》。采用苦参碱和氧化苦参碱对照品作为实验对照。按照药典山豆根测定的方法制备供试液。称取山豆根药材0.5g，精密加入20ml混合溶液(三氯甲烷-甲醇-浓氨水40:10:1)密塞，称重，放置30min，超声处理(功率250W，频率40kHZ)30min，再次称重用混合溶液补重，摇匀，过滤，精密量取取续滤液10ml，40℃减压回收(使用旋转蒸发仪)至溶剂全部挥尽，残渣加入适量甲醇(色谱纯)溶解，转移至容量瓶中甲醇定容至10ml，摇匀，用0.22um微孔滤膜过滤。另取苦参碱对照品和氧化苦参碱对照品适量，加入液相流动相(乙腈-异丙醇-3％磷酸溶液80:5:15)，使得苦参碱含量为20ug/ml，氧化苦参碱含量为150ug/ml。仪器：高效液相色谱仪VarianJC2X058；色谱柱：PhenomenexLuna5uNH2100A，150*4.6mm；柱温：25℃；流动相：乙腈-异丙醇-3％磷酸溶液80:5:15；检测波长210nm；液相时间16min。
采用SPSS16.0进行数据统计与分析。
2结果与分析
2.1山豆根根瘤菌的生长特性
山豆根根瘤菌在YMA固体培养基上经28℃培养3～5d能形成良好的典型菌落。其菌落圆形，透明粘稠，表面光滑，有光泽，边缘整齐，中心稍有突起。按菌落大小可分为2种类型，其中YY、LA2、JX3菌落直径为0.6～0.8㎝，LA1和JX2菌落直接0.2～0.4㎝。BTB反应试验表明，参试的山豆根菌株代谢产酸；革兰氏染色均反应为阴性。生长曲线如图1所示，测定结果表明：各菌株在培养0～4h为迟缓期，4～24h为对数生长期，24h后进入稳定生长期。由此可见，我们分离到的根瘤菌具有快生型根瘤菌的一般特征[9]，初步判定其为快生型根瘤菌。
2.2山豆根根瘤菌的生理生化特性
2.2.1温度对山豆根根瘤菌生长的影响山豆根根瘤菌对不同温度的反应较为一致，对低温的忍耐能力较差，在30℃左右生长良好。各菌株对异常温度的耐受性有一定的差异，来自同一产地的不同根瘤菌株对高温的耐受性也存在着差异，其中YY、LA1和JX2能耐受短时60℃的高温(见表2)。
表2不同温度对山豆根根瘤菌生长的影响
注：“+”表示生长，“–”表示不生长。下同。
2.2.2pH对山豆根根瘤菌生长的影响一般过酸过碱的环境条件不利于根瘤菌的生长。山豆根根瘤菌对酸碱的反应较为一致，在pH6.0～10.0均能生长，其中LA1、JX2、JX3在pH11的条件下仍能生长(表3)。试验结果表明，山豆根根瘤菌对酸性环境较为敏感，pH低于6.0菌株不能再生长，但具有较丰富的耐碱种质资源。
表3pH值对山豆根根瘤菌生长的影响
2.2.3NaCl对山豆根根瘤菌生长的影响
试验表明，山豆根根瘤菌在无盐条件下能生长，随着NaCl浓度的增加，菌株生长受到抑制，当NaCl浓度达到1％时，菌株不能生长。
表4不同浓度的NaCl对山豆根根瘤菌生长的影响
2.2.4山豆根根瘤菌对几种抗生素的耐受性对抗生素的敏感性是根瘤菌的重要生理生化特性，可以作为分类的一项指标。测定结果表明(表5)，山豆根根瘤菌株对Km和Gm的耐受性最差，在低含量(5μg/ml)下均不能生长；对Cb表现出抗性，在较高含量(300μg/ml)下仍能够生长；在100μg/ml的Cm和10μg/ml的Nm中都能够生长。此外，菌株间对不同或同一抗生素不同浓度的抗性差异较大，即使是来自同一地域的菌株之间也有部分差异。如来自靖西的菌JX2和JX3对Amp敏感，相反另外两株来自则隆安的LA1和LA2对Amp(600μg/ml)仍表现出抗性，而分离自广西药用植物园的YY菌株能忍耐100μg/ml的Amp。
表5山豆根根瘤菌对抗生素的抗性
2.2.4碳源和氮源利用根瘤菌一般能较好的利用单糖和双糖，而快生型根瘤菌能利用麦芽糖、乳糖、蔗糖等双糖。本试验所有菌株对9种供试碳源利用的结果见表6。由表可知，山豆根根瘤菌均能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、果糖、乳糖，但不能利用醋酸钠、甘氨酸和肌醇。
本试验共检测了供试菌株对5种氮源的利用情况，其结果见表6。所有的菌株都能利用蛋白胨和硫酸铵；不能利用半胱氨酸。除YY外，其余菌株均能利用硝酸钾,而且YY和LA1不能利用甘氨酸。这说明，大部分的供试根瘤菌可以利用无机氮源作为其生长所需氮源。表6结果表明，来源不同的山豆根根瘤菌对供试碳源、氮源的利用能力比较一致。
表6山豆根根瘤菌的碳源、氮源利用情况
2.3根瘤菌对山豆根幼苗有效成分的影响
接种根瘤菌能使山豆根幼苗结瘤，不同根瘤菌处理的植株苦参碱和氧化苦参碱含量是不同的(见表7)。接种根瘤菌的处理，其苦参碱和氧化苦参碱含量均比对照有所增加，其中接种来自靖西菌株的植株含量显著高于对照及其他处理。可见，接种根瘤菌有利于根瘤形成，再通过根瘤进行生物固氮来积累氮素，从而促进植株有效成分的积累。
表7根瘤菌对山豆根幼苗有效成分含量的影响
3讨论
药材原料质量是药材生产亟待解决的问题，许多学者也在探索解决、评价药材质量的方法。山豆根人工驯化获得成功之后，人们更多的是总结了山豆根人工栽培的一些技术措施，但是在栽培生产中药农为了追求产量而多施重施氮肥，造成病虫害加重、农残升高、硝酸盐含量超标等问题，严重影响药材质量，这是目前山豆根可持续生产中不可忽视的问题。生物固氮是豆科植物的一个重要特性，通过生物固氮可以利用自然界的N2改善植株的氮素营养状况，从而避免盲目施氮肥造成对山豆根等豆科药材质量的不良影响。因此，筛选出具有优良特性的土著根瘤菌菌株对进一步在生产上进行接种应用是十分有利的。本试验从山豆根根瘤中获得5株根瘤菌，它们均具有快生型根瘤菌生长特征和生理生化特征。
杨亚珍等发现不同地理来源、同一地理来源、甚至同一植株不同甘草根瘤菌菌株个别指标方面存在差异；黄荣绍等发现不同生态环境下采集的鸡骨草根瘤菌在生物学特性方面具有较大的差异。本试验结果与之有相似之处，来源相同或来源不同的山豆根根瘤菌对高温忍耐能力、酸碱环境的适应性、抗生素的敏感性等方面存在差异，但对酸碱环境的适应性及碳源的利用比较一致，推测这可能与不同的菌株含有的一些特殊基因有关。通过回接试验发现，人工接种根瘤菌明显促进山豆根根瘤的形成，植株的有效成分含量大幅度增加，其原因可能是生物碱是含氮化合物，氮素的供给利用在山豆根生物碱的生物合成和积累中起重要作用。但不同来源的山豆根菌株之间对有效成分积累的影响不同，这是否与采集地的生态环境有关，尚待进一步研究。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (6)

1.一种应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将根瘤菌菌液分布于山豆根植株的根系周围，之后将山豆根植株于日间25～30℃、夜间20～25℃、光强2500～3500lx条件下培养160～190天，其中，在培养过程中添加Fahraeus无氮营养液。
2.如权利要求1所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，其特征在于，所述根瘤菌菌液的制作过程如下：
步骤一、破碎经表面灭菌处理的山豆根根瘤，取其汁液，用所述汁液在加有0.02～0.03g/L刚果红的YMA固体培养基上划线，25～30℃恒温培养至菌落出现，连续培养，获得根瘤菌菌株；
步骤二、将根瘤菌菌株接种到YMA液体培养基中，得根瘤菌菌液。
3.如权利要求1所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，其特征在于，所述山豆根植株经以下步骤培育得到：
选取体积比为1:1的水洗河沙和蛭石为培育基质，115～125℃高压灭菌0.5～1.5h；
将山豆根种子于55～65℃水中浸泡至吸胀，自然冷却，用体积浓度为75％的乙醇和质量分数为0.1％的氯化汞进行表面消毒，在所述培育基质中25～30℃培养至发芽后，移栽，得待接种的山豆根植株，其中，花盆经过以下处理：用质量分数为5％的高锰酸钾溶液浸泡5～6h后洗净。
4.如权利要求2所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，其特征在于，所述步骤一中山豆根根瘤的表面灭菌处理，具体为：挑选新鲜、饱满、个大的山豆根根瘤，在无菌的条件下，体积浓度为95％的乙醇侵泡0.5～1.5min，无菌水冲洗2～4次，质量分数为0.1％的氯化汞侵泡2～4min，无菌水冲洗3～5次。
5.如权利要求1所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，其特征在于，所述根瘤菌菌液的用量为一棵山豆根植株1～4mL。
6.如权利要求1所述的应用根瘤菌提高山豆根有效药用成分含量的方法，其特征在于，培养时间为180天。
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