CN105400869B - 一种运用pcr引物检测长芒苋的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用PCR技术检测植物及植物产品中长芒苋(Amaranthus palmeri)的方法，属于有毒有害杂草检测领域。本发明设计合成了长芒苋的特异性引物，用于对长芒苋基因组DNA的特异检测。本发明建立了一种快速简便、特异性强、准确可靠的长芒苋的分子检测方法，一个工作日内完成整个检测。

Description

一种运用PCR引物检测长芒苋的方法
技术领域
本发明涉及使用PCR技术检测植物及植物产品中长芒苋(Amaranthus palmeriS.Watson)的方法，属于有毒有害杂草检测领域。
背景技术
苋属(Amaranthus)隶属苋科(Amaranthaceae)，为一年或两年生雌雄同株或异株草本植物，世界上共有苋属植物近70种(包括栽培品种)。苋属里雌雄同株种类分布广泛，适生温带、暖温带、亚热带及热带地区，是生物量最大分布最广泛的杂草类群之一。雌雄异株种类主要分布于北美，19世纪初随着人类贸易活动陆续在欧洲出现。苋属杂草给生态系统和农业生产造成一定的危害。自1985年雌雄异株种类(长芒苋A.palmeri)在中国首次发现以来，我们又在山东、辽宁、福建、江苏等口岸进境的货物种子中检测到长芒苋、西部苋(A.rudis)、糙果苋(A.tuberculatus)、反枝苋(A.retroflexus)、绿穗苋(A.hybridus)、刺苋(A.spinosus)、白苋(A.albus)等苋属杂草种子，其中检疫性杂草长芒苋、西部苋、糙果苋在新生境具极强的适生能力与入侵性，具有较高的危害风险。
鉴于我国粮谷进口量大，几乎每批均有苋属杂草种子检出。而苋属种子小型，长约1mm，形态特征相近，难以区分，口岸鉴定工作缺乏基本技术资料。除国内印丽萍(1997)、郭琼霞(1998)等对苋属与藜属部分种类的种子，及国外Kowal(1954)、Klopper和Robel(1989)、Esparza-Sandoval等(1996)、Costea(1997)等人对苋属种子外部形态进行的微形态研究外，中国苋属杂草种子形态学鉴定资料很少。
长芒苋为重要的异株苋亚属检疫性杂草，该种为一年生草本。高0.8-2m(原产地可高达3m)。茎直立，粗壮，具棱角，黄绿色，具绿色条纹，有时变淡红褐色，无毛或上部被稀疏柔毛，分枝斜升。叶无毛，叶片卵形至菱状卵形，茎上部叶呈披针形，长(2-)5-8cm，宽(0.5-)2-4cm，先端钝、急尖或微凹，常具小突尖；基部楔形，略下延，边缘全缘。穗状花序生于茎顶和侧枝顶部，直立或俯垂，长(7-)10-25cm，宽1-1.2cm，下部花序也见团簇状。苞片长4-6cm，雄花中脉伸出呈芒刺状，雄花花被片5，内侧花被片长2.5-3mm，钝状至微凹，外侧花被片长3.5-4mm，渐尖，具显著伸出的中脉；雄蕊5；雌花苞片更坚硬，雌花花被片5，略外展，不等长，最外一片具宽阔中脉，倒披针形，长3-4mm，先端急尖，其余花被片匙形，长2-2.5mm，先端截形至微凹，有时呈啮齿状；花柱2(3)。胞果近球形，长1.5-2mm，果皮膜质，周裂。种子近圆形或宽椭圆形，直径长1-1.2mm，深红褐色，具光泽。
长芒苋尚未有准确、快速的检测鉴定方法，为此，本文将在前人研究基础上，对长芒苋进行分子检测研究，为口岸长芒苋检测、鉴定工作提供技术支持。
发明内容
本发明收集国内目前已入侵我国的检疫性杂草长芒苋及其20种苋属种子(见表1)，建立了快速简便、特异性强、准确可靠的长芒苋分子检测方法，能将长芒苋准确鉴定出来。该方法检测快速，方法可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。
具体技术方案如下：
本发明目的是提供一种检测长芒苋基因组DNA的PCR方法，它包括如下步骤：
(1)植物基因组DNA的提取；
(2)长芒苋的特异引物，序列如下：
PALF：TGGTACAGGTAGGGA AGA
PALR：ACATAAAATATTACAAATCGACGCA
该引物用于长芒苋基因组DNA特异性检测，扩增片段约为262bp。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了快速简便、特异性强、准确可靠的长芒苋分子检测方法，能将长芒苋与苋属其他种区别开来。该方法检测快速，方法可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1：长芒苋基因组DNA特异引物的扩增
图2：长芒苋基因组DNA特异引物的扩增
具体实施方式
实施例1：植物材料基因组DNA的提取
本实验苋属种子源于天津出入境检验检疫局动植食中心植检实验室。共计21种，相关信息见表1。
表1供试材料代码、拉丁名、中文名及收集年份
使用消毒镊子挑取植物种子，将每颗苋属种子放入1.5mL
离心管，每管加入0.03g石英砂，液氮研磨，按照QIAGEN公司生产的DNA提取试剂盒提取DNA，并将DNA溶于100μL 1×TE缓冲液中，置于-20℃保存。
实施例2：特异引物的设计
人工合成长芒苋的特异引物，引物序列如下：
PALF：TGGTACAGGTAGGGA AGA
PALR：ACATAAAATATTACAAATCGACGCA
实施例3：长芒苋特异引物的PCR扩增
1.反应混合液的配制
反应体系配置见表2。
表2糙果苋特异性扩增体系
2.PCR反应程序
预变性：94℃，3min
变性：94℃，30s
退火：57℃，30s
延伸：68℃，30s
循环数：40个
延伸：68℃，5min
2.3结果分析
对21个实验材料的基因组DNA进行特异性引物PALF/PALR的扩增，以添加无菌水为模板作为阴性对照。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色均能观察到特定目的大小带，通用引物扩增的片段应约为262bp，只有长芒苋显示特定大小的目的带(见图1和图2中2泳道)，A.aernicola,A.tuberculatus,A.rudis,A.greggii,A.fimbriatus,A.deflexus,A.standleyanus,A.tamaulipensis,A.paniculatus,A.crispus,A.polygonoides,A.powellii,A.quitensis,A.Hybridus,A.viridis,A.albus,A.blitoides,A.blitum,A.wrightii和阴性对照无相应产物(见图1中3～18泳道和图2中3～8泳道，图1中3～18泳道分别为A.aernicola,A.tuberculatus,A.rudis,A.greggii,A.fimbriatus,A.deflexus,A.standleyanus,A.tamaulipensis,A.paniculatus,A.crispus,A.polygonoides,A.powellii,A.quitensis,A.hybridus和阴性对照，图2中3～8泳道分别是A.viridis,A.albus,A.blitoides,A.blitum,A.wrightii和阴性对照)，图1和图2中1泳道为2000bpDNA marker。

Claims (3)

1.一种运用PCR引物检测长芒苋的方法，其特征在于，自行设计的长芒苋PCR特异性引物对，序列如下：
PALF：TGG TAC AGG TAG GGA AGA
PALR：ACA TAA AAT ATT ACA AAT CGA CGC A
扩增片段为262bp，用于长芒苋基因组DNA特异性扩增检测。
2.权利要求1所述的一种运用PCR引物检测长芒苋的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)植物基因组DNA的提取；
(2)建立长芒苋基因组DNA的PCR扩增体系，按照反应程序进行扩增；
(3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测。
3.权利要求1中所述检测长芒苋的特异PCR引物对或权利要求2所述的检测长芒苋的方法在特异检测长芒苋上的应用。
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