CN105400811A - 以基因组岛为基础的整合载体pLMO033及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以基因组岛为基础的整合载体pLMO033及其制备方法和应用；所述整合载体pLMO033携带有int/att元件；所述制备方法包括构建中间过渡型质粒pLMO032的步骤和改造所得中间过渡型质粒pLMO032获得整合载体pLMO033的步骤；所述应用具体指在超嗜热古菌中进行基因单拷贝回补或外源基因表达的应用。本发明提供的整合载体能够在大肠杆菌内复制，在超嗜热古菌P.yayanosii？A1菌株中高效的进行位点特异性整合并能稳定遗传，该载体可作为超嗜热古菌的基因回补载体应用于基因功能鉴定研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种整合型载体的制备方法和应用，具体是涉及一种以基因组岛为基础的整合载体pLMO033及其制备方法和应用。
背景技术
Thermococcales是一类广泛分布在地热环境，如热泉、火山和深海热液口的超嗜热古菌，位于16SrRNA基因系统进化树的根部，被认为是研究地球早期生命现象和生物进化的良好材料。由于受其高温、厌氧生长特性的影响，开发相应的遗传工具用于分子遗传学的研究一直比较滞后。现有的遗传操作工具主要表现为基因敲除工具及自主复制型穿梭载体，这些在Thermococcales中的一些成员如Thermococcuskodakarensis,Thermococcusbarophilus,Pyrococcusabysii,Pyrococcusfuriosus和Pyrococcusyayanosii中已有相关报道，但是仍然缺乏位点特异性的整合型载体。P.yayanosiiCH1是第一株分离自深海热液口的超嗜热嗜压厌氧古菌。针对其兼性嗜压突变株P.yayanosiiA1已经开发出基因敲除系统用于其遗传研究，但是尚缺乏有效的位点特异性单拷贝整合载体用于基因回补或基因表达。因此，开发出有效的位点特异性整合载体十分必要。
基因组岛被认为是一种整合接合元件(ICEs)，在许多微生物基因组中都有发现，通过水平基因转移的方式从外界获得额外基因是基因组岛形成的重要形式。基因组岛通常位于tRNA的3’末端，两端具有相同或相近的DR序列。在细菌中，一些基因组岛可以自发的从核心染色体上发生整合或删除，而DR序列可能是基因组岛整合或删除的热点区域。而在超嗜热古菌中，尚没有关于基因组岛移动性及利用基因组岛开发遗传工具的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种可应用超嗜热古菌的、具有高效位点特异性整合能力的载体pLMO033；本发明还提供了制备上述整合载体pLMO033的方法和其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种整合载体pLMO033，所述整合载体包含来自于可移动型基因组岛int/att元件。
优选地，所述可移动型基因组岛int/att元件来自于超嗜热古菌P.yayanosiiA1的可移动型基因组岛PYG1。
进一步优选地，所述整合载体的碱基序列如SEQIDNO.1所示。
第二方面，本发明提供一种整合载体pLMO033的制备方法，包括如下步骤：
克隆基因组岛中int/att元件，将所述元件插入到自杀载体pLMO03中，得中间过渡型质粒pLMO032；
移除所述中间过渡型质粒pLMO032的非必需基因，得改造的线性化质粒；
构建多克隆位点，并其插入所述线性化质粒中切除非必需基因的区域，即得整合载体pLMO033。
优选地，所述int/att元件的序列长度为1263bp，碱基序列如SEQIDNO.2所示。
优选地，所述插入具体采用T4DNA连接酶。
优选地，所述多克隆位点为以下组合中的一种或多种：PstⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、SciI、BssHⅡ、Bpu10Ⅰ、PmeⅠ。
优选地，所述非必需基因具体包括乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶基因。
优选地，所述自杀载体pLMO03包含氨苄抗性基因及其启动子、融合了谷氨酸脱氢酶强启动子的β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶基因以及pTS535复制区域。
进一步优选地，所述pTS535复制区域、氨苄抗性基因及其启动子均来源于大肠杆菌pUC118质粒；
所述融合了谷氨酸脱氢酶强启动子的β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶基因中，所述β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶基因来源于超嗜热古菌P.yayanosii，过表达该基因可赋予该超嗜热古菌对辛伐他汀的抗性，所述谷氨酸脱氢酶强启动子来源于超嗜热古菌P.furiosus。
优选地，所述制备方法还包括对所得整合载体pLMO033进行验证的步骤。
优选地，所述验证具体包括将所述pLMO033整合载体在E.coliDH5α中进行质粒扩增并酶切验证，然后将其转入超嗜热古菌P.yayanosiiA1验证其成功整合。
第三方面，本发明提供一种所述整合载体pLMO033在超嗜热古菌中进行基因单拷贝回补、引入外源基因的应用。
本发明构建的以超嗜热古菌P.yayanosii基因组岛为基础的整合载体携带有int/att元件，可以在int基因的作用下特异性的识别基因组中att位点并发生整合。同时该载体携带有高温可用的辛伐他汀抗性标记基因，使在高温下对其进行抗性筛选成为可能。由于该载体能够在大肠杆菌中复制，但是无法在古菌中复制，因此只有整合到宿主染色体的载体才能够赋予宿主抗生素抗性，这也增加了对整合子的筛选效率。高效的位点特异性整合载体作为基因回补及引入外源基因的工具，丰富了超嗜热古菌遗传工具的种类，有助于对该类菌株进行功能基因组学研究。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)在超嗜热古菌P.yayanosiiA1中，该整合载体pLMO033不能复制，只能以单拷贝的形式存在于基因组中；
(2)在超嗜热古菌P.yayanosiiA1中，该整合载体pLMO033可以高效的位点特异性的整合在基因组中att位点；
(3)整合载体pLMO033可用于超嗜热古菌P.yayanosiiA1的基因回补及引入外源基因，鉴定基因功能，作为遗传操作系统不可或缺的一个部分；
(4)该整合载体pLMO033在没有辛伐他汀作为筛选标记的前提下，连续传代20次鉴定，依然可以稳定地整合在基因组上；
(5)该整合载体pLMO033含有多个多克隆位点，可以插入各种不同基因进行基因功能研究。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是pLMO033载体构建说明图；
图2是pLMO033载体构建int/att元件电泳图；
其中，M为1kbDNAladder；int/att为int/att元件；所用DNA模板为P.yayanosiiA1基因组DNA；
图3是pLMO032改造后连接MSC验证结果图；
其中，M为1kbDNAladder；1为MCS连接验证；
图4是pLMO033载体整合验证结果图；
其中，M为1kbDNAladder；P1P21为验证整合位点左边界；P20P22为验证整合位点右边界；所用DNA模板为转化了pLMO033整合载体的P.yayanosiiA1转化子；
图5是pLMO033载体稳定性验证结果图；
其中，M为1kbDNAladder；P1P21为验证整合位点左边界；P20P22为验证整合位点右边界；
图6是利用pLMO033载体回补基因后生长曲线结果图；
其中，A1为野生型菌株，A1040为基因突变菌株，A1040C为基因回补菌株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明所涉菌株均为公知菌株，公开情况具体如下：
超嗜热古菌P.yayanosii已公开于文献：《Pyrococcusyayanosiisp.nov.,anobligatepiezophilichyperthermophilicarchaeonisolatedfromadeep-seahydrothermalvent》,2011中公开；
超嗜热古菌P.furiosus已公开于文献：《Pyrococcusfuriosussp.nov.representsanovelgenusofmarineheterotrophicarchaebacteriagrowingoptimallyat100℃》,1986中公开；
A1040突变株已公开于文献：《GenetictoolsforthepiezophilichyperthermophilicarchaeonPyrococcusyayanosii》,2015；
超嗜热古菌P.yayanosiiA1已公开于文献：所述P.yayanosiiA1菌株已经发表于《GenetictoolsforthepiezophilichyperthermophilicarchaeonPyrococcusyayanosii》,2015；
自杀载体pLMO03已经公开于文献：《GenetictoolsforthepiezophilichyperthermophilicarchaeonPyrococcusyayanosii》,2015。
实施例1、int/att元件的插入构成过渡质粒pLMO032
PCR扩增基因组岛中int/att序列1263bp(如图1和2所示)(本实例所涉扩增基因组岛int/att序列的扩增条件、扩增体系等为本领域公知技术)，所述int/att碱基序列如SEQIDNO.2所示。由于引物5’端带有SpeI酶切位点，则可以通过SpeI对PCR产物及自杀载体pLMO03分别进行SpeI单酶切，对线性化后的质粒进行去磷酸化后，通过T4DNA连接酶将上述酶切后的PCR产物和线性化质粒连接，构建成中间过渡型质粒pLMO032；
其中，所述自杀载体pLMO03包含氨苄抗性基因及其启动子、融合了谷氨酸脱氢酶强启动子的β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶基因以及pTS535复制区域；所述pTS535复制区域、氨苄抗性基因及其启动子均来源于大肠杆菌pUC118质粒；所述融合了谷氨酸脱氢酶强启动子的β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶基因中，所述β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶基因来源于超嗜热古菌P.yayanosii，所述谷氨酸脱氢酶强启动子来源于超嗜热古菌P.furiosus。
实施例2、构建整合载体pLMO033
在已获得过渡型质粒的基础上进行进一步修饰，过程如下：
(1)对过渡型质粒pLMO032进行改造，切除非必需基因pyrF。自杀型质粒pLMO03中携带的pyrF基因可以作为同源重组过程中营养缺陷型菌株的负筛选标记，而在整合型载体中不需要此基因功能，为了减小载体大小，将其进行移除。经过限制性酶切位点分析，在该基因两端分别含有酶切位点PstI和SalI，通过两个限制性内切酶作用将该基因移除，剩下一个被改造的线性化质粒。
(2)多克隆位点的构建：本实施例合成了一个多克隆位点MSC，该多克隆位点主要包括如下几个：PstⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、SciI、BssHⅡ、Bpu10Ⅰ、PmeⅠ(如图1所示)；
(3)、通过T4连接酶将其插入到移除了pyrF基因的区域(如图3所示)，载体构建过程中用到的引物如表1所示；
(4)、将构建好的pLMO033整合载体在E.coliDH5α中进行质粒扩增并酶切验证质粒已经构建正确。pLMO033整合载体序列如表2所示。将构建好的pLMO033整合载体转化至超嗜热古菌P.yayanosiiA1中，通过对该整合载体整合位点分析，进行整合能力的验证，所用引物见表1。
表1整合载体pLMO033构建及鉴定的引物序列
表2整合载体pLMO033序列说明
实施例3、实施效果
整合载体pLMO033具有穿梭载体的特性，可以在大肠杆菌E.coliDH5α中复制，获得大量质粒。将获得的pLMO033整合载体转化至超嗜热古菌P.yayanosiiA1中，经过辛伐他汀抗性筛选阳性克隆子，提取总DNA进行PCR验证。通过对该整合载体整合位点分析，进行整合能力的验证，验证结果如图4所示。对鉴定为阳性的克隆子在不含抗性的培养基中进行连续传代培养，传代20次后仍然可以稳定遗传，验证结果如图5所示。
在P.yayanosiiA1中，该整合载体pLMO033可用做基因回补载体。将融合了谷氨酸脱氢酶强启动子的amiE基因连接至整合载体pLMO033多克隆位点MSCI中的BglII酶切位点；转化构建好的重组质粒至A1040突变株中(所述A1040突变株已经发表于《GenetictoolsforthepiezophilichyperthermophilicarchaeonPyrococcusyayanosii》,2015)，图6为图6是利用pLMO033载体回补基因后生长曲线结果图；其中，A1为野生型菌株，A1040为基因突变菌株，A1040C为基因回补菌株。由图6可知，通过分析野生株、突变株、及基因回补菌株的生长曲线，野生株与基因回补菌株生长趋势接近一致且均明显好于突变株，最终生物量与突变株相比也表现出明显差异，表明整合型载体pLMO033可以作为一种超嗜热古菌P.yayanosiiA1基因回补载体进行应用。
综上所述，本发明的整合载体pLMO033能够在大肠杆菌内复制，在超嗜热古菌P.yayanosiiA1菌株中高效的进行位点特异性整合并能稳定遗传，该载体可作为超嗜热古菌的基因回补载体应用于基因功能鉴定研究。本发明涉及的整合载体pLMO033具有诸多效果：在超嗜热古菌P.yayanosiiA1中，该整合载体pLMO033不能复制，只能以单拷贝的形式存在于基因组中；在超嗜热古菌P.yayanosiiA1中，该整合载体pLMO033可以高效的位点特异性的整合在基因组中att位点；整合载体pLMO033可用于超嗜热古菌P.yayanosiiA1的基因回补及引入外源基因，鉴定基因功能，作为遗传操作系统不可或缺的一个部分；该整合载体pLMO033在没有辛伐他汀作为筛选标记的前提下，连续传代20次鉴定，依然可以稳定地整合在基因组上；该整合载体pLMO033含有多个多克隆位点，可以插入各种不同基因进行基因功能研究。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种整合载体pLMO033，其特征在于，所述整合载体包含来自于可移动型基因组岛int/att元件。
2.根据权利要求1所述的整合载体pLMO033，其特征在于，所述可移动型基因组岛int/att元件来自于超嗜热古菌P.yayanosiiA1的可移动型基因组岛PYG1。
3.根据权利要求1或2所述的整合载体pLMO033，其特征在于，所述整合载体的碱基序列如SEQIDNO.1所示。
4.一种权利要求1所述的整合载体pLMO033的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
克隆基因组岛中int/att元件，将所述元件插入到自杀载体pLMO03中，得中间过渡型质粒pLMO032；
移除所述中间过渡型质粒pLMO032的非必需基因，得改造的线性化质粒；
构建多克隆位点，并其插入所述线性化质粒的切除非必需基因的区域，即得整合载体pLMO033。
5.根据权利要求4所述的整合载体pLMO033的制备方法，其特征在于，所述int/att元件的碱基序列如SEQIDNO.2所示。
6.根据权利要求4所述的整合载体pLMO033的制备方法，其特征在于，所述多克隆位点为以下组合中的一种或多种：PstⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、SciI、BssHⅡ、Bpu10Ⅰ、PmeⅠ。
7.根据权利要求4所述的整合载体pLMO033的制备方法，其特征在于，所述非必需基因具体包括乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶基因。
8.根据权利要求4所述的整合载体pLMO033的制备方法，其特征在于，所述自杀载体pLMO03包含氨苄抗性基因及其启动子、融合了谷氨酸脱氢酶强启动子的β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a还原酶基因以及pTS535复制区域。
9.根据权利要求4至8任一项所述的整合载体pLMO033的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对所得整合载体pLMO033进行验证的步骤。
10.一种根据权利要求1或2所述的整合载体pLMO033在超嗜热古菌中进行基因单拷贝回补、引入外源基因的应用。
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