CN105400719B - 一株能转化重金属的贪铜菌属菌株及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一株能转化重金属的贪铜菌属菌株及其应用。该菌株名称为贪铜杆菌(Cupriavidus metallidurans)Paddy‑2，于2015年6月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11028。该菌株在硝酸盐环境中对亚铁有较强的氧化能力并能对亚铁氧化成矿，其可用于土壤的改良；该菌株对砷也具有较强的还原作用，在无硝酸盐和亚铁离子的条件下，其对砷的还原作用更强，可用于修复砷污染土壤。
Description
技术领域
本发明属于新菌种筛选技术及环境微生物技术领域，特别涉及一株能转化重金属的贪铜菌属菌株及其应用。
背景技术
铁是红壤中最为重要的氧化还原活性元素，而氧化铁是土壤中重要的活性矿物，主要含铁矿物包括针铁矿、赤铁矿、纤铁矿、水铁矿、黄铁矿和施威特曼石等多种形态，其主要以游离态的氧化铁包裹在土壤颗粒表面，具有较高的地球化学活性，对土壤中各元素的地球化学性质有着重要的影响。在厌氧条件下，铁元素在铁还原菌或铁氧化菌作用下产生溶解态Fe(II)以及含Fe(II)的矿物，这些含铁矿物带有表面电荷、具有巨大的比表面积与强烈的反应活性，是土壤和沉积环境中重要的吸附剂、氧化/还原剂和催化剂，直接影响土壤养分的利用效率以及重金属、有机污染物的行为归趋。
厌氧条件下的Fe(II)氧化成矿过程不仅对现代环境中铁、氮等元素的地球化学循环起着重要作用，且影响着重金属的迁移与转化。Fe(II)氧化过程与硝酸盐还原、厌氧反硝化及厌氧氨氧化等过程密切相关，硝酸盐依赖型亚铁氧化菌驱动Fe(II)氧化耦合硝酸盐还原过程影响着氮元素的循环。微生物作用下Fe(II)催化氧化形成铁氧化物的过程直接影响重金属的环境地球化学行为，如Fe(II)在形成铁氧化物(主要为Fe(III)羟基氧化物、Fe(III)氢氧化物及Fe(II)氧化物)的同时能够吸附溶液中的砷，从而固定重金属离子，另一方面，砷与铁氧化物发生共沉淀效应，进一步降低重金属离子的流动性。
参与Fe(II)氧化代谢过程的微生物主要有光合型微生物、硝酸盐或者高氯酸盐呼吸微生物。土壤中硝酸盐具有较高的氧化电位，并且在土壤中含量较高，是研究较多的参与铁的生物地球化学过程的电子受体。现已分离并鉴定的硝酸盐依赖型亚铁氧化菌主要来至淡水湖、沉积物、稻田等生境。稻田重金属污染物砷与铁氧化物的表面吸附是一个重要的环境过程，且在水稻土中普遍存在。虽然已有报道表明硝酸盐依赖型亚铁氧化菌在促进Fe(II)氧化成矿的同时，能显著降低水稻土中砷的活性。但目前为止，对于水稻土中硝酸盐依赖型亚铁氧化菌是如何发挥成矿的作用，以及整个微生物亚铁氧化过程对砷的迁移转化机制仍不明确。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株能转化重金属的贪铜菌属菌株。
本发明的另一目的在于提供所述能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一株能转化重金属的贪铜菌属菌株，名称为贪铜杆菌(Cupriavidus metallidurans)Paddy-2，于2015年6月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11028。
所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用，是将其氧化亚铁和微生物成矿、以及还原砷。
所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株在氧化亚铁和微生物成矿时，需在硝酸盐存在条件下，将所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株作用氧化亚铁。
所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株在还原砷时，优选为先去除硝酸盐以及亚铁，再将所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株作用砷酸盐。
所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株优选为用于改良土壤以及用于修复砷污染土壤。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供了一株能转化重金属的贪铜菌属菌株，该菌株在硝酸盐环境中对亚铁有较强的氧化能力并能对亚铁氧化成矿，其可用于土壤的改良；该菌株对砷也具有较强的还原作用，在无硝酸盐和亚铁离子的条件下，其对砷的还原作用更强。
附图说明
图1是本发明菌株的透射电镜照片图。
图2是本发明菌株的16S rRNA基因系统发育树图。
图3是本发明菌株亚铁氧化的实验结果图。
图4是本发明菌株对亚铁氧化成矿的作用结果图；其中，图(A)和图(B)为两张代表性的图。
图5是本发明菌株对砷的还原作用结果图；其中，图(1)是菌株+硝酸盐+砷酸盐+亚铁，图(2)是菌株+硝酸盐+砷酸盐，图(3)是菌株+砷酸盐，图(4)是菌株+砷酸盐+亚铁，图(2)、(3)和(4)中的曲线标识与图(1)相同。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：硝酸盐依赖亚铁氧化菌Paddy-2的富集和分离。
富集是称取广东省的水稻土壤样品接种到液体分离培养基中，每升液体分离培养基的组成是：20mM哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)缓冲液、5.14mM NaCl、1.03mM KH2PO4、2.03mMMgCl2、0.68mM CaCl2、10.0ml微量元素和10.0ml维生素溶液，并添加有5mM FeCl2·4H2O、10mM NaNO3及5mM CH3COONa(溶剂为去离子水)，pH调节至7.0，其中，维生素溶液是每升中含2.0mg生物素、2.0mg叶酸、VB610.0mg维生素、5.0mg硫胺素、5.0mg核黄素、5.0mg烟酸、5.0mg泛酸钙、0.1mg维生素B12、5.0mg对氨基苯甲酸、5.0mg硫辛酸，去离子水定容至1L；微量元素溶液是每升中含1.5g氨三乙酸、3.0g MgSO4·7H2O、0.5g MnSO4·H2O、1.0g NaCl、0.1gFeSO4·7H2O、0.1g CoCl2·6H2O、0.1g CaCl2、0.1g ZnSO4·7H2O、0.01g CuSO4·5H2O、0.01gAlK(SO4)2·12H2O、0.01g H3BO3、0.01g Na2MoO4·2H2O，去离子水定容至1L。
往已接种的富集培养液中充高纯混合气(N2/CO2＝80/20，体积比)30分钟，鼓气完毕后盖橡胶盖加铝盖密封，置于厌氧工作站30℃静置培养。培养7天后，以10％(v/v)的接种量转移至另一新鲜的培养基中，上述操作反复三次。最后，在厌氧培养中，将培养液涂布至琼脂培养基(15g琼脂，5mM FeCl2·4H2O、10mM NaNO3及5mM CH3COONa)上，30℃静置培养。
筛选平板上呈褐色或者褐绿色的为可进行亚铁氧化的菌落，挑取菌落，转移至新鲜的液体培养基中进行分离培养，得到纯菌株，将其命名为Cupriavidus metalliduransstrain Paddy-2，于2015年6月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11028。
菌株Paddy-2的形态特征如下：透射电子显微镜结果(图1)显示菌株有周生鞭毛，棒状，宽约0.5-1μm，长约2-3μm；菌落为棕色，凸起，边缘呈圆形，直径约2mm。
菌株Paddy-2的生理生化特征如下：为革兰氏阴性菌；该菌具兼性厌氧生长能力，在厌氧条件下，能利用葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、乙醇或甲酸作为碳源，在硝酸盐环境中能够氧化亚铁。
菌株Paddy-2的16S rRNA基因序列特征：提取发明菌株的总DNA，以提取的DNA为模板，以通用引物27F和1492R扩增菌的16S rRNA基因，回收扩增产物后进行测序，其16S rRNA基因的序列如下所示：
TAGGCGCTGCTTACCATGCAGTCGAACGGCAGCGCGGACTTCGGTCTGGCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTACCCTGTTGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGTGGGGGACCGCAAGGCCTCACGCAGCAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCGCGCTGGTTAATACCTGGCGTGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAATTGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTGCGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTGACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTTCTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATACCACACC。
将得到的序列与Genebank上的相关16S rRNA序列进行比对。与Genebank公开的相应菌株序列用Cluster X方法进行比对。基于1000个重复的抽样分析，使用MEGA 5.0按邻接法构建系统树。构建得到的16S rRNA系统发育树如图2所示。
实施例2：菌株Paddy-2的铁氧化过程。
采用的液体培养基配方：每升液体培养基中含20mM PIPES缓冲液、5.14mM NaCl、1.03mM KH2PO4、2.03mM MgCl2、0.68mM CaCl2、5mM CH3COONa、维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液成分同实施例1)，溶剂为去离子水。
从保存菌株Paddy-2的斜面挑取菌苔接种至液体培养基中，于30℃、180rpm摇床活化菌体18小时，使细菌数量达到指数生长期。4℃、6000rpm离心10min，去上清液，用20mMPIPES缓冲液重新悬浮，重复上述操作2次，将沉淀的菌悬体浮于液体培养基中，制成菌悬液。
接种细菌悬浮液于液体培养基中，同时设置三个处理，分别为①菌株+亚铁；②菌株+硝酸盐+亚铁；③硝酸盐+亚铁，其中硝酸盐(NaNO3)和亚铁(FeCl2·4H2O)的初始浓度分别为10mM和5mM，鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20，体积比)30分钟，鼓气完毕后盖橡胶盖加铝盖密封，于30℃静置厌氧培养箱中培养。
每隔1天取混合均匀的1ml培养液于4ml 0.5mol L-1HCl溶液中180转/分振荡1.5小时，再过滤，采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(II)显色，采用紫外分光光度计在510nm处测定Fe(II)的含量，并以不加菌的培养液为对照，验证菌株的亚铁氧化能力。
试验结果如图3所示，结果表明菌株不能直接氧化亚铁，只有在耦合硝酸盐还原的条件下才能氧化亚铁；不接种菌株的对照体系亚铁含量也没有变化，说明菌株在硝酸盐环境中对亚铁有较强的氧化能力，亚铁被氧化不是由于自身的化学氧化。
实施例3：菌株Paddy-2对亚铁氧化成矿的作用过程。
液体培养基的配制及菌悬液的制作同实施例2。
根据实施例2的结果，只有在硝酸盐存在的条件下，菌株才表现出亚铁氧化的能力。接种细菌悬浮液于液体培养基中，实验处理为菌株+硝酸盐+亚铁，并以不加菌的培养液为对照，考察菌株对亚铁氧化成矿的作用。
亚铁氧化形成的沉淀物在厌氧条件下用磷酸缓冲液(10mM，pH 7.0)洗涤两次，冷冻干燥，测试。利用透射电镜(TEM)观察形成的沉淀物与菌株的依附关系。
试验结果如图4所示，结果表明菌株在氧化亚铁的同时，在细胞的表面生成了无定型铁氧化物。亚铁氧化形成的氧化物沉淀聚集并包裹菌株。
实施例4：菌株Paddy-2的砷还原作用过程。
液体培养基的配制及菌悬液的制作同实施例2。
接种细菌悬浮液于液体培养基中，同时设置四个处理，分别为①菌株+硝酸盐+砷酸盐+亚铁；②菌株+硝酸盐+砷酸盐；③菌株+砷酸盐；④菌+砷酸盐+亚铁，其中硝酸盐(NaNO3)、亚铁(FeCl2·4H2O)及砷酸盐(砷酸盐为砷酸钠)的初始浓度分别为10mM、5mM、8-10μM，鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20，体积比)30分钟，鼓气完毕后盖橡胶盖加铝盖密封，于30℃静置厌氧培养培养。
每隔1天取混合均匀的2ml培养液过滤，注入0.5ml 5mmol L-1HCl中保存，采用AFS-2202E原子荧光光度计测定，验证菌株的砷还原能力。
不同条件下，菌株对砷的还原作用实验结果如图5所示，菌株对砷具有较强的还原能力，而在添加硝酸盐的体系中，只有少量的砷被还原，表明硝酸盐和砷在被还原的过程中存在竞争关系，在相同条件下，硝酸盐首先被菌株还原。在添加亚铁和砷的体系中，检测到的三价砷含量明显小于被去除的五价砷，说明亚铁对砷还原有一定的抑制作用的同时，生成的铁氧化物能够将五价砷固定，降低其潜在风险。在不添加亚铁的体系中，反应11天后，砷完全被还原；添加亚铁的体系中，反应11天后最多40％左右的砷被还原，表明亚铁对菌株还原砷具有一定的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株能转化重金属的贪铜菌属菌株，其特征在于：其名称为贪铜杆菌（Cupriavidus metallidurans） Paddy-2，于2015年6月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11028。
2.权利要求1所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用，其特征在于：是将其氧化亚铁和微生物成矿以及还原砷。
3.根据权利要求2所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用，其特征在于：所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株在氧化亚铁和微生物成矿时，需在硝酸盐存在条件下，将所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株作用氧化亚铁。
4.根据权利要求2所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株的应用，其特征在于：所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株在还原砷时，为先去除硝酸盐以及亚铁，再将所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株作用砷酸盐。
5.权利要求1所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株在改良土壤中的应用。
6.根据权利要求1所述的能转化重金属的贪铜菌属菌株在改良土壤中的应用，其特征在于：所述的改良土壤为修复砷污染土壤。
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