CN105392804B - 采用修饰的环糊精的蛋白质检测 - Google Patents

采用修饰的环糊精的蛋白质检测 Download PDF

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Abstract

提供采用共价连接至至少一种标记物的环糊精来检测蛋白质的方法。所述环糊精可通过将所述蛋白质的芳族氨基酸侧链掩蔽在其疏水腔中而与所述蛋白质相联。在使所述蛋白质与所述环糊精接触之后，标记物可直接检测，或可与试剂发生化学相互作用以形成可检测的产物。所述标记物可包含吲哚部分，其在暴露至紫外光下时能够与卤素取代的有机化合物反应，由此能够发荧光。或者，所述标记物可包含生物素部分，其能够结合至结合伴侣，例如亲和素或其变化形式，以形成可检测的分子复合物。

Description

采用修饰的环糊精的蛋白质检测
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年8月9日提交的名为“采用修饰的环糊精的蛋白质检测(PROTEINDETECTION USING MODIFIED CYCLODEXTRINS)”的美国临时申请号61/864,388的优先权，其全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
用于人类疾病治疗的许多现代疗法利用或靶向蛋白质。为了开发此类疗法，医师和科研人员需要了解人体内各种环境中所表达蛋白质的氨基酸序列、结构以及丰度，以及这些蛋白质之间的相互作用。研究和处理蛋白质的一个关键方面是检测。可采用多种技术，体内或体外检测蛋白质，用于分析或制备蛋白质样品的目的。这些技术中的许多涉及使蛋白质与可检测的结合伴侣接触。
电泳凝胶中蛋白质的检测通常采用有色的或荧光蛋白质染料(例如考马斯亮蓝或SYPRO Ruby)来进行。这些染料能够以很大程度上不受限于氨基酸序列的方式非共价地结合至蛋白质，并且可在采用特定波长的光照射之时被观察到。蛋白质染料允许强力且灵敏的检测，但会妨碍供于下游应用的生物样品的快速处理。在检测之前向凝胶施加染料的过程(染色)可能会耗费数小时。在检测之后移去染料(脱色)也同样耗时，当制备性地使用凝胶时，该过程是获得纯化蛋白质所必需的。染色和脱色涉及凝胶的搅动(agitation)，凝胶在水性缓冲液中长时间的浸没，以及对该缓冲液的频繁更换。在这些过程中，一些蛋白质(尤其是低分子量且亲水性的蛋白质)会从凝胶扩散出去，并进入缓冲液，由此丢失而无法被后续分析。因此，蛋白质染料的采用，以及伴随的凝胶处理，可能会减少在电泳之后可被鉴定的蛋白质的数量。
或者，可通过使蛋白质接触卤素取代的有机化合物，并使所述蛋白质暴露至紫外光，来使该蛋白质变得可检测。如Edwards等在美国专利号US 7,569,103B2(2009年8月4日)和US 8,007,646 B2(2011年8月30日)以及他处所公开的那样，该过程会导致色氨酸的吲哚部分和卤素取代的有机化合物之间的紫外光诱导的反应。反应的色氨酸残基被共价修饰并发荧光，其在用于诱导反应的相同波长下激发并在可见光范围内发光。所述反应，以及用于进行所述反应并检测其产物的相关试剂、装置和方法，有时以名称‘Stain-FreeTM’(生物辐射实验室股份有限公司)表示。
可在凝胶电泳之前或之后使蛋白质与卤素取代的有机化合物接触并反应。如果所述卤素取代的有机化合物是凝胶的组成部分，则接触可在电泳过程中原位进行。相较于采用蛋白质染料，采用共价修饰的色氨酸荧光进行蛋白质检测通常更为方便和经济，并且不限于涉及电泳凝胶的应用。例如，可使蛋白质与卤素取代的有机化合物接触，反应，并在其悬浮于溶液中或沉积在印迹膜上时进行检测。
通过非共价地结合环糊精，色氨酸和其它芳族氨基酸侧链可被保护不受共价修饰，这由Del Valle(E.M.M.Del Valle，Process Biochemistry 39，1033-1046，2004)和Serno等(T.Serno等，Advanced Drug Delivery Reviews 63，1086-1106，2011)综述性描述。环糊精是包含由α-(1,4)键接合的若干个(通常是6、7或8个)吡喃葡萄糖单位的环状寡糖。在环糊精分子中，所述吡喃葡萄糖单位形成锥环形结构，其中央具有疏水腔。在与环糊精接触，芳族氨基酸侧链可插入该腔，由此变得与其它化学相互作用隔离。环糊精已被用作，例如，基于蛋白质的药物的赋形剂，并且可通过限制涉及芳族氨基酸的蛋白质-蛋白质相互作用来防止蛋白质聚集。
除了标准α-、β-和γ-环糊精之外，已经表征了具有取代的吡喃葡萄糖单位的环糊精种类。在大多数情况中，取代基连接至第2、3和6位，所述取代基包括烷基、羟烷基和羧烷基基团。共价连接至一个或多个氨基酸的环糊精也已被合成(参见例如，等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.2，723-730，1995)。
环糊精是能非共价地结合较小分子以形成超分子复合物的一类环状有机分子。所述环状分子在主体-客体(host-guest)化学中作为“主体”(参见例如，H.-J.Schneider和A.K.Yatsimirsky刊于Chem.Soc.Rev.，37，263-277，2008的综述)，并且包含中央腔，以通过氢键连接、离子键、范德华相互作用和/或疏水相互作用来容纳一个或多个具有合适尺寸的“客体”分子。所述环状分子可以是重复单位的寡聚物或聚合物，并且可被称为大环。环状有机主体分子的其它示例包括葫芦脲(cucurbituril)，其由通过亚甲桥连接的甘脲单体组成。已显示葫芦[8]脲以1:1的化学计量学关系结合甲基紫精，并且同时在其腔中容纳甲基紫精和氨基酸。此外，葫芦[8]脲显示对芳族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的结合特异性(参见P.Rajgariah和A.R.Urbach，J.Incl.Phenom.Macrocycl.Chem.62，251-254，2008)。而其它环状有机主体分子还包括柱芳烃、杯芳烃和冠醚。
发明内容
本文提供方法、组合物、电泳凝胶和试剂盒。
提供了检测蛋白质的方法。所述方法包括：使所述蛋白质与环糊精接触，所述环糊精共价连接至至少一种标记物；使所述蛋白质与试剂接触；引起所述试剂与所述至少一种标记物之间的化学相互作用以形成产物；和检测所述产物，由此检测所述蛋白质。
在所述方法的一个实施方式中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或γ-环糊精。在另一个实施方式中，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。而在另一个实施方式中，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、3、4、5、6、7、8、12、14、16、18、21或24个。
在所述方法的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些实施方式的一些中，所述至少一种标记物包含色氨酸残基或多肽。在所述标记物包含吲哚部分的其它实施方式中，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
在所述方法的一些实施方式中，所述试剂是卤素取代的有机化合物。在一个此类实施方式中，所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙醇。
在一些实施方式中，所述方法的引起步骤涉及使所述蛋白质暴露至紫外光，并且所述产物包含取代的吲哚部分。在一个此类实施方式中，所述取代的吲哚部分与未取代的吲哚部分的分子量相差28、44或58Da。在另一个此类实施方式中，所述取代的吲哚部分包含甲酰基、羧酸、羟基乙酮，或丙醇基团。
在所述方法的一些实施方式中，检测所述产物包括检测发射光。
在所述方法的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含生物素部分。在一些实施方式中，所述试剂包含如下蛋白质中的一种：亲和素、链霉亲和素和中性亲和素。在一些实施方式中，所述化学相互作用是结合相互作用，并且所述产物是生物素和所述试剂的非共价分子复合物。
在一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：对所述蛋白质进行凝胶电泳，并且在电泳凝胶中检测所述蛋白质。在这些实施方式的一些中，在凝胶电泳之前，使所述蛋白质与环糊精和所述试剂接触。在一个此类实施方式中，所述环糊精和试剂悬浮于缓冲液中，并且所述接触步骤包括使所述蛋白质与该缓冲液接触。在其它实施方式中，在凝胶电泳之后，使所述蛋白质与环糊精和所述试剂接触。在这些其它实施方式中的一种中，所述环糊精和试剂悬浮于缓冲液中，并且使电泳凝胶与所述缓冲液接触，由此允许环糊精和试剂扩散进入所述电泳凝胶，并使所述蛋白质与所述环糊精和试剂接触。在其它实施方式中，所述环糊精或试剂是所述电泳凝胶的组成部分，并且在对所述蛋白质进行凝胶电泳时使所述蛋白质与所述环糊精或所述试剂接触。
在对所述蛋白质进行凝胶电泳之后，所述方法可包括：将所述蛋白质转移出所述电泳凝胶并转移至印迹膜上，并检测所述印迹膜上的蛋白质。该方法的一个实施方式还包括从所述蛋白质移除所述环糊精、试剂，或产物。在所述方法的其它实施方式中，所述蛋白质包含亲和标签或抗体结合表位，并且，检测所述印迹膜上的蛋白质包括使所述印迹膜与所述亲和标签或抗体结合表位的结合伴侣接触。所述亲和标签或抗体结合表位可包含色氨酸残基，并且在一个此类实施方式中，所述亲和标签是Strep-标签。
本文还提供一种组合物，其包含：共价连接至至少一种标记物的环糊精；和试剂，所述试剂能够与所述至少一种标记物发生化学相互作用，由此使所述标记物可检测。
在所述组合物的一个实施方式中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或γ-环糊精。在另一个实施方式中，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
在所述组合物一些实施方式中，所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些实施方式的一些中，所述至少一种标记物包含色氨酸残基或多肽。在所述至少一种标记物包含吲哚部分的其它实施方式中，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
在一些实施方式中，组合物中的所述试剂是卤素取代的有机化合物。在一个此类实施方式中，所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙醇。
在所述组合物的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含生物素部分。在一些实施方式中，所述试剂包含如下蛋白质中的一种：亲和素、链霉亲和素和中性亲和素。
在所述组合物的其它实施方式中，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、3、4、5、6、7、8、12、14、16、18、21或24个。
本文还提供电泳凝胶。在一些实施方式中，所述电泳凝胶包含上述组合物。
在其它实施方式中，所述电泳凝胶包含环糊精，所述环糊精共价连接至至少一种标记物。在一个此类实施方式中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或γ-环糊精。在另一个此类实施方式中，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
在所述电泳凝胶的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些实施方式的一些中，所述至少一种标记物包含色氨酸残基或多肽。在所述至少一种标记物包含吲哚部分的其它实施方式中，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
在所述电泳凝胶的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含生物素部分。
在所述电泳凝胶的一些实施方式中，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、3、4、5、6、7、8、12、14、16、18、21或24个。
本文还提供一种试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含上述组合物。在这些实施方式的一些中，所述试剂盒还包含电泳凝胶，其中所述组合物是所述电泳凝胶的组成部分。
在一些实施方式中，所述试剂盒包含如上所述的电泳凝胶。
在一些实施方式中，所述试剂盒包含环糊精和试剂，所述环糊精共价连接至至少一种标记物，所述试剂能与所述至少一种标记物发生化学相互作用，由此使所述标记物可检测。在一个此类实施方式中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或γ-环糊精。在另一个此类实施方式中，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
在所述试剂盒的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些实施方式的一些中，所述至少一种标记物包含色氨酸残基或多肽。
在所述至少一种标记物包含吲哚部分的其它实施方式中，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
在一些实施方式中，所述试剂盒中的所述试剂是卤素取代的有机化合物。在一个此类实施方式中，所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙醇。
在所述试剂盒的一些实施方式中，所述至少一种标记物包含生物素部分。在一些实施方式中，所述试剂包含如下蛋白质中的一种：亲和素、链霉亲和素和中性亲和素。
在所述试剂盒的一些实施方式中，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、3、4、5、6、7、8、12、14、16、18、21或24个。
当所述试剂盒包含环糊精和试剂时，在一些实施方式中，所述试剂盒还包含电泳凝胶，其中所述环糊精是所述电泳凝胶的组成部分。在其它实施方式中，所述试剂盒还包含电泳凝胶，其中所述试剂是所述电泳凝胶的组成部分。在一个此类实施方式中，所述环糊精也是所述电泳凝胶的组成部分。
当所述试剂盒包含环糊精和试剂时，在一些实施方式中，所述试剂盒还包含水性缓冲液，其中所述环糊精是所述水性缓冲液的组成部分。在一个此类实施方式中，所述水性缓冲液是利姆里(Laemmli)缓冲液。
还提供一种组合物，其包含共价连接至至少一个取代的吲哚部分的环糊精。在所述组合物的一个实施方式中，所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精或γ-环糊精。在另一个实施方式中，所述至少一个取代的吲哚部分共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。而在另一个实施方式中，所述取代的吲哚部分与未取代的吲哚部分的分子量相差28、44或58Da。而在另一个实施方式中，所述取代的吲哚部分包含甲酰基、羧酸、羟基乙酮，或丙醇基团。在其它实施方式中，所述取代的吲哚部分是未取代的吲哚部分与卤素取代的有机化合物的紫外光诱导的反应的产物。在一个此类其它实施方式中，所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙醇。而在所述组合物的另一个实施方式中，每个环糊精的取代的吲哚部分的平均数量是至少1、2、3、4、5、6、7、8、12、14、16、18、21或24个。
本文还提供电泳凝胶，其中所述凝胶包含共价连接至至少一个取代的吲哚部分的环糊精的组合物，如该组合物的任何实施方式所述。本文还提供一种试剂盒，其包含该组合物。所述试剂盒的一些实施方式还包含电泳凝胶，其中所述组合物是所述电泳凝胶的组成部分。此外，提供一种试剂盒，其包含上述电泳凝胶，其中所述凝胶包含共价连接至至少一个取代的吲哚部分的环糊精的组合物。
还提供检测蛋白质的另一种方法。所述方法包括：使蛋白质与共价连接至至少一个取代的吲哚部分的环糊精的组合物接触；使所述蛋白质暴露至紫外光；和检测荧光发射，由此检测所述蛋白质。
在一些实施方式中，所述方法还涉及对所述蛋白质进行凝胶电泳，和在电泳凝胶中检测所述蛋白质。在一些实施方式中，在凝胶电泳之前，使所述蛋白质与所述组合物接触。在一个此类实施方式中，所述组合物悬浮在缓冲液中，并且所述接触步骤包括使所述蛋白质与所述缓冲液接触。在其它实施方式中，在凝胶电泳之后，使所述蛋白质与所述组合物接触。在一个此类实施方式中，所述组合物悬浮在缓冲液中，并且使电泳凝胶与所述缓冲液接触，由此允许所述组合物扩散进入所述电泳凝胶，并使所述蛋白质与所述组合物接触。在其它实施方式中，所述组合物是所述电泳凝胶的组成部分，并且在对所述蛋白质进行凝胶电泳时使所述蛋白质与所述组合物接触。
在涉及对所述蛋白质进行凝胶电泳的所述方法的一些实施方式中，所述方法还包括如下步骤：将所述蛋白质转移出所述电泳凝胶并转移至印迹膜上，和检测所述印迹膜上的蛋白质。在一个此类实施方式中，所述方法还包括从所述蛋白质移除所述组合物。在所述方法的其它此类实施方式中，所述蛋白质包含亲和标签或抗体结合表位，并且检测涉及使所述印迹膜与所述亲和标签或抗体结合表位的结合伴侣接触。在这些实施方式的一些中，所述亲和标签或抗体结合表位包含色氨酸残基。在一个实施方式中，所述亲和标签是Strep-标签。
附图简要说明
图1显示本发明的一些实施方式中出现的现象：带有色氨酸标记的环糊精与卤素取代的有机化合物(例如三氯乙醇)的紫外光诱导的反应，反应之后带有色氨酸标记的环糊精的紫外激发和荧光发射，蛋白质的色氨酸残基在环糊精的腔中的掩蔽(sequestration)，和该掩蔽的色氨酸残基受保护以免于紫外光诱导的反应。
图2显示在包含0.5％v/v三氯乙醇(TCE)和不同浓度的甲基-β-环糊精(MBCD；0、2.5和25mM)的溶液中孵育凝胶之后，SDS-PAGE凝胶中蛋白质的荧光发射。
图3显示图2的SDS-PAGE凝胶的泳道中的约200,000Da条带的定量。
图4显示在凝胶于包含MBCD和不同浓度的TCE(0.5、0.47和0.25％v/v)的溶液中孵育之后，该SDS-PAGE凝胶中蛋白质的荧光发射。
发明详述
引言
发明人吃惊地确定，蛋白质可采用带标记的环糊精来检测。所述检测可不利用待检测的蛋白质的氨基酸侧链的共价修饰，而是使其结合环糊精来进行。本文中所用的术语“带标记的环糊精”包含共价连接至标记物的环糊精分子。所述标记物可包含一个或多个吲哚部分，其与标准免染(stain-free)技术中的色氨酸残基类似，能够在暴露至紫外光之下时与卤素取代的有机化合物反应。因此，在使蛋白质与带标记的环糊精接触之后，该环糊精修饰的蛋白质可利用荧光检测(图1)。相较于标准免染技术，利用带吲哚标记的环糊精可提供更灵敏的蛋白质检测，因为除色氨酸残基以外，环糊精能够结合至苯丙氨酸和酪氨酸残基，并且各环糊精分子能携带多个吲哚部分。更广泛地，如下所述，环糊精能共价连接至能与试剂相互作用以形成可检测的产物的任何标记物。所述产物可在所述蛋白质与所述带标记的环糊精接触之前或之后形成。本文提供方法、组合物、试剂盒和电泳凝胶，用于利用带标记的环糊精来检测蛋白质。
方法
在一些实施方式中，所述方法涉及使蛋白质与共价连接至至少一种标记物的环糊精接触。任何环糊精可用于这些方法，包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精和γ-环糊精。环糊精的其它类型和衍生物是本领域已知的(参见例如T.Serno等，AdvancedDrug Delivery Reviews 63，1086-1106，2011)。除了所述标记物以外，也优选向所述环糊精引入化学修饰，以提高所述方法的性能。所述修饰能易化标记物的连接或检测，或者引起环糊精与例如感兴趣蛋白质的更牢固的结合。在一些实施方式中，选择能够通过如下方式结合至所述蛋白质的环糊精，该环糊精能将芳族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸)的侧链容纳在其中央腔内，并在检测过程中保持与所述蛋白质相联。
应认识到，除环糊精外，本发明方法可经调整以用于其他环状有机主体分子，只要这些分子能够非共价地结合蛋白质的选定氨基酸残基，并且连接至可检测的标记物即可。主体分子的作用通常是连接待检测的蛋白质和用于检测的标记物，和允许进行特异性检测，且无需蛋白质的共价修饰。所述方法的各种实施方式所需的调整将取决于对主体分子的选择，用于将标记物连接至主体分子的化学作用，用于检测的条件，感兴趣的靶标蛋白质的属性，以及其它考量因素。
任何标记物均可被用于本文所述的方法，前提是所述标记物能够与试剂发生化学相互作用以形成可检测的产物，如下所述。在一些实施方式中，所述标记物包含吲哚部分，其一旦暴露至紫外光下就能与卤素取代的有机化合物反应，以形成发荧光的产物。所述吲哚部分可以是连接至环糊精的色氨酸残基的部分，作为单一氨基酸或作为多肽中多种氨基酸残基之一。或者，所述吲哚部分能够在没有构建色氨酸残基所需的额外原子的情况下连接至环糊精，或可以是不包含色氨酸残基的化学结构的部分。即，包含吲哚部分的标记物不必包含色氨酸残基。出于使合成简易或其它原因，可选择将吲哚连接至环糊精的化学结构。较长的接头结构(例如，在环糊精和吲哚之间插入1、2、3、4个或更多甘氨酸残基)会阻碍吲哚插入环糊精的中央腔。
可按需实现一个或多个标记物与环糊精的共价连接。例如，可采用所述的DCC化学法(参见例如等，Tetrahedron Lett.34，2457-2460，1993，和等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.2，723-730，1995)，将基于氨基酸的标记物(包含一种或多种氨基酸，例如寡肽形式)连接至单-氨基酸-取代的β-或γ-环糊精。本文中，所述连接的位置是一个吡喃葡萄糖单位的6位。在未修饰的环糊精中，反应性伯羟基基团在该位置处接合至吡喃葡萄糖环。可选择性活化伯羟基以引入氨基基团供于进一步反应，或可与标记物直接反应。
还可采用碳水化合物化学的策略来控制每个环糊精连接的标记物的数量。除了6位的伯羟基以外，各吡喃葡萄糖单位在2位和3位处包含两个仲羟基基团。因此，靶向羟基基团的标记反应可导致异质的产物混合物，其中每个环糊精分子的标记物数量符合统计分布。该分布的平均值或形态可通过改变反应条件来调节。在一些实施方式中，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、3、4、5、6、7、8、12、14、16、18、21或24个。在一些实施方式中，每个吡喃葡萄糖单位，或在特定的吡喃葡萄糖单位上的标记物的平均数量是1、2或3个。更严谨反应条件(例如更低温度，更短反应时间或更低的标记物化学计量)将会导致各环糊精分子上连接的标记物的平均数更少。在一些情况中，这将导致向吡喃葡萄糖6位的伯羟基选择性添加标记物。处于这些位置的标记物通过分子内掩蔽进入环糊精的中央腔的趋势可能较小，并且因此可能更偏向于使该中央腔留下以供于分子间结合。也可通过如下方式获得更均匀的产物混合物：在标记反应或在该反应后纯化所述混合物之前，例如采用酸不稳定的甲硅烷基基团，将所述羟基基团中的一些封闭。纯化可采用标准液相色谱进行，例如如下文献综述，《现代液相色谱入门》(Introduction to Modern Liquid Chromatography)，第三版，纽约：威力出版社，2010。对于疏水标记物，例如吲哚部分或色氨酸残基，反应或纯化方案希望使环糊精腔内掩蔽的未连接的标记物的现象减少。
可按需使感兴趣蛋白质与带标记的环糊精接触。例如，接触可这样发生：通过将包含一种组分(蛋白质或环糊精)的溶液和包含另一种组分(环糊精或蛋白质)的溶液混合，在溶液中同时具有两种组分(即，所述蛋白质和所述环糊精)时发生接触。或者，接触也可这样发生：当一种组分位于表面上或基质内时，通过使包含另一组分的溶液经过所述表面或通过所述基质来发生接触。其它接触方法对本领域技术人员而言是显而易见的。下文中将讨论，接触可与所述蛋白质的凝胶电泳联合进行。在一些情况中，与使蛋白质与带标记的环糊精接触相关联的实验条件有益于蛋白质的任何暴露的芳族残基与环糊精的腔之间的结合。
在一些实施方式中，所述方法包括使所述蛋白质与试剂接触。该接触也可按需采用该试剂的任何制剂或组合物来进行。可在使蛋白质与带标记的环糊精接触之前或之后，或者同时，使所述蛋白质与所述试剂接触。所述试剂和带标记的环糊精可以是相同组合物的部分，例如，悬浮在相同溶液中。然而，因为检测取决于所述试剂和所述环糊精上的标记物之间的化学相互作用，所述蛋白质与所述试剂的接触应不造成所述环糊精从所述蛋白质脱离，或者应不妨碍所述环糊精和蛋白质结合。为了避免此类结果，在一些实施方式中，在蛋白质与带标记的环糊精接触之后，使所述蛋白质与所述试剂接触。
所述试剂可以是任何化学或分子实体，包括但不限于有机小分子，无机分子或离子组合物，或生物大分子，例如脂质、碳水化合物、核酸或蛋白质。所述试剂可具有任何电荷、pKa、pKb、pI，或分子量，并且能够以任何物质形态出现。出于本发明目的，使蛋白质与试剂接触可使所述蛋白质处于变化的化学环境中，例如通过改变其中悬浮有所述蛋白质的缓冲液的pH或组成。因此，所述试剂也可以是一种溶液或其组分，例如氢氧根离子、水合氢离子，或缓冲液。
可选择能够与共价连接至所述环糊精的一种或多种具体标记物发生化学相互作用的试剂。本文中所用的术语“化学相互作用”应宽泛地理解为涵盖能够导致形成可检测的产物的任何相互作用。化学相互作用可包括，例如，两种或更多种物质之间的静电或空间介导的关联，包括蛋白质与底物，以及任何辅助因子的结合。化学相互作用还可涉及导致物质之间的离子键、共价键或氢键的形成或断裂的反应。在所述标记物和试剂之间的化学相互作用中，额外物质(例如反应物、催化剂或溶剂分子)可能会参与，并且可能是形成产物所必需的。所述化学相互作用可以是自发的，并且可以简单地通过使所述标记物、试剂和任何其它物质彼此接触来发生，或者可能需要输入能量，例如，热、辐射或电流形式的能量。
在所述标记物包含吲哚部分的一些实施方式中，所述试剂是卤素取代的有机化合物。可采用能够与所述吲哚部分反应以形成发荧光的产物的任何卤素取代的有机化合物。特别感兴趣的卤素取代有机化合物是三卤代化合物，尤其是三氯化合物和分子量为200或更低的那些。三卤代脂肪醇、三卤代脂肪酸、三卤代脂肪胺和三卤代链烷均有用。特定的示例有：氯仿、三氯乙酸、三氯乙酸酯、三氯乙醇，和3-溴-1-丙醇。可分开或联合采用卤素取代的有机化合物，例如两种或三种此类化合物以大致相等的摩尔比例组合。
所述吲哚部分和卤素取代的有机化合物之间的反应，即，化学相互作用，可通过将这两种反应物暴露至紫外光来引起。可通过在蛋白质已经与带吲哚标记的环糊精和卤素取代的有机化合物接触之后，使所述蛋白质暴露至紫外光来进行，从而所述环糊精结合至所述蛋白质，并且所述卤素取代的有机化合物保留在所述蛋白质的化学环境内。可用的波长一般会包括落在约200nm-约400nm范围内的那些。约三十秒-约三十分钟，或更有效地，约一分钟-约十分钟的暴露时间，通常将提供合适的结果。所述暴露可在室温(70-75°F)下进行，但也可采用较高和较低的温度，前提是这类温度下不发生其它或不需要的反应，不发生相变，且反应以经济上可行的反应速率发生。辐照可通过透射法、落射照明法或其它方式实现。
紫外光诱导源自卤素取代的有机化合物的有机基团加成到吲哚环，产生取代的吲哚部分作为该反应的产物。由此，相较于其反应前的状态，该吲哚部分会发生质量的增加，并且该增加取决于所述卤素取代的有机化合物的性质。例如，当所述化合物是氯仿时，每个吲哚部分的质量增加28Da，当所述化合物是三氯乙醇时，增加44或58Da，当所述化合物是三氯乙酸酯时，增加44Da，且当所述化合物是3-溴-1-丙醇时，增加58Da。这些质量对应于吲哚环上甲酰基(+28Da)、羧酸(+44Da)、羟基乙酮(+58Da)，或丙醇(+58Da)基团的增加(参见例如Edwards等，Photochemistry&Photobiology 75:362-368，2002，和Ladner等，ProteinScience 16:1204-1213，2007)。在与O2反应后，吲哚部分的质量也可增加32Da，所述反应是在紫外辐照下发生的过程，并且不需要卤素取代的有机化合物的参与。对于蛋白质的色氨酸残基的类似的共价修饰可在这些残基不受环糊精掩蔽的时候发生。
由所述标记物的反应获得的取代的吲哚部分在进一步暴露至紫外光下时发荧光，并且在可见光范围内发光。可利用相同的紫外光源或光的波长来诱导所述反应并激发产物。因此，蛋白质可通过如下方式检测：当其结合至环糊精(所述环糊精进而共价连接至取代的吲哚部分)时，使其暴露至紫外光。检测可通过成像来实现，例如通过利用摄影或通过电子传感器，如光电二极管，电荷耦合器件(CCD)检测器或互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器。数字结果可通过常规成像软件分析。所述反应发生之后，可出于检测发射的目的，将激发光的辐照用于初始检测或用于重复检测。或者，所述蛋白质可用一次给予的紫外光照射，以同时诱导反应并激发产物，并且可在该给予过程中的任何时间进行荧光再发射光的检测。
可利用蛋白质与卤素取代的有机化合物的接触和向紫外光的暴露来检测没有环糊精存在时的蛋白质。例如，如共同转让，同期待审的美国专利申请第13/870,710号所述，Stain-Free化学可用于共价修饰复杂蛋白质样品中的色氨酸残基(例如，包含1,000或更多不同蛋白质的样品)并使这些样品中的蛋白质发荧光。然后，经检测的荧光允许进行总蛋白质定量。在蛋白质之间，每个蛋白质分子的色氨酸残基的数量可能具有差异，从而，一些蛋白质会比其它蛋白质产生更多荧光。然而，这些差异在该复杂样品中是经遮蔽(masked)或经平均化的，从而所测荧光总量与蛋白质的总量(例如质量或摩尔数)强相关。具有相当的蛋白质总量的不同的复杂样品能够产生相当水平的荧光，即便所述样品包含不同的蛋白质组分时也是如此。
在本发明方法中，环糊精也可用于进行Stain-Free总蛋白质定量，这部分归因于带吲哚标记的环糊精与蛋白质中色氨酸残基的结合。如上所述，一些环糊精能够结合至酪氨酸和苯丙氨酸残基，以及色氨酸残基。也可制备环糊精，使得平均有多于一个吲哚标记物共价连接至各环糊精分子。因此，相较于具有相同氨基酸序列的裸蛋白质分子，环糊精修饰的蛋白质分子能够对于周围溶液呈现更多数量的反应性吲哚部分。在将蛋白质样品暴露至卤素取代的有机化合物和紫外光下时，相较于裸分子，经修饰的蛋白质分子能够产生同样多的、甚至于更多的荧光。出于该原因，本发明方法允许进行高灵敏的蛋白质检测，并且可用于对蛋白质总量小的复杂蛋白质样品进行总蛋白质定量。
在本文所述的方法的其它实施方式中，所述标记物可包含生物素部分。生物素是以高亲和性结合至亲和素和相关蛋白质(例如链霉亲和素和中性亲和素)的小分子。本文中，该结合是所述方法的化学相互作用，所述试剂是结合的蛋白质(例如亲和素)，并且所述可检测的产物是生物素和所述试剂之间的分子复合物。所述分子复合物可通过本领域已知的方法检测，例如通过将放射性或荧光标签置于所述试剂上，或通过将抗体引向该复合物。生物素-亲和素仅仅是可被用于本发明方法的标记物-试剂配对的一个示例。标记物的选择仅限于将该标记物连接至合适的环糊精的实用性，以及将该带标记的环糊精和试剂联用以检测感兴趣蛋白质的实用性。其它可能的标记物包括金属离子(其能够与螯合剂相互作用)和特定的氨基酸序列(例如，亲和标签和表位，其能够与特定蛋白质结合伴侣相互作用)。
在一些实施方式中，所述环糊精被连接至多肽。所述多肽可作为标记物，或包含标记物，所述标记物共价连接至环糊精。例如，所述多肽可包含色氨酸残基。或者，所述多肽可与所述标记物分开。例如，所述多肽可连接至环糊精的一个吡喃葡萄糖单位，而吲哚部分可连接至另一个吡喃葡萄糖单位。该多肽的化学性质取决于其氨基酸序列，并且可选择该序列以调节环糊精的溶解度。主要包含亲水性残基的多肽，例如，能够提高环糊精在水性溶液中的溶解度，而主要包含疏水性残基的多肽则会降低该溶解度。归因于其溶解度，在有利条件下，该多肽能够促进与其相连的环糊精和感兴趣蛋白质的结合。连接至环糊精的亲水性多肽能够促进该环糊精和分泌的蛋白质在水性缓冲液中结合。类似地，连接至环糊精的疏水多肽能够促进该环糊精与包埋在膜结构(例如，脂双层)中的疏水蛋白质的结合，这可能是通过允许该环糊精渗入该结构来实现的。必要时，可设计所述氨基酸序列以模拟感兴趣蛋白质的整体表面静电学或环糊精能够结合的靶标芳族侧链附近的表面静电学。所述多肽可具有任何氨基酸残基数量或序列，并且能够按需连接至所述环糊精。
由所述标记物与所述试剂的化学相互作用所得的可检测的产物可以是允许检测感兴趣蛋白质的任何化学或物理形式。所述产物可以是标记物的修饰形式，例如取代的吲哚部分，或所述标记物与试剂之间的分子复合物，如同生物素和亲和素的情况。在这些示例中，标记物与试剂之间的化学相互作用能够有效地使所述标记物可被检测。此时，所述标记物被纳入所述产物，并且在所述产物形成之后，该产物共价连接至所述环糊精。或者，所述标记物与试剂之间的化学相互作用能够产生不与所述环糊精或蛋白质连接的产物。例如，所述标记物可以是催化剂，并且所述试剂可以是可切割的底物。所述标记物能催化所述试剂的切割，由此产生可检测的(例如有色的)产物，其在催化之后不与所述带标记的环糊精或蛋白质保持相联，并且能够扩散出去。除了该扩散以外，所述产物可用于例如在电泳凝胶或印迹膜上检测蛋白质，因为所述蛋白质与所述产物发生的位点共定位。用于产生并检测不直接连接至所述带标记的环糊精或感兴趣蛋白质的产物的其它策略也是可行的。
在一些实施方式中，本发明方法包括对所述蛋白质进行凝胶电泳，和在电泳凝胶中检测所述蛋白质。任何电泳凝胶可用于这些目的。例如，所述凝胶可具有任何尺寸，具有任何数量的泳道，以及通过手工或通过机器(浇制)制备。在一些实施方式中，所述凝胶包含聚丙烯酰胺，其可以任何百分比或浓度存在，包括具有多于一个浓度(例如凝胶的浓缩胶和分离胶部分)或具有浓度梯度。所述凝胶还可包含变性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)，以及缓冲试剂，例如三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、甘氨酸或N-三(羟甲基)甲基甘氨酸。电泳凝胶，尤其是用于分离复杂蛋白质样品的凝胶的其它常见构成成分将是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施方式中，所述凝胶包含添加剂，所述添加剂允许蛋白质比不存在这些添加剂的情形中更快并且以更高的可施加电势迁移通过所述凝胶。所述添加剂还可通过防止条带重复来改善蛋白质的分离，所述条带重复可能归因于凝胶与其支持平板之间的不希望的相互作用或间隙(参见例如美国专利号7,056,426)。所述添加剂的示例包括聚(乙烯醇)、琼脂糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(丙二醇)/聚(乙二醇)共聚物，以及线性聚丙烯酰胺。包含这些添加剂中的一种或多种的电泳凝胶能以名称‘TGX’获自生物辐射实验室股份有限公司(Bio-Rad)。
可采用任何所需的技术，并采用任何可用的物质或装置进行所述电泳凝胶的跑胶。在标准实践中，使所述凝胶与包含电解质的缓冲液接触，并置于两个电极之间，然后向电极之间施加电流。跑胶，或电泳，使蛋白质在凝胶中迁移，并且基于分子量、尺寸或电荷而逐渐彼此分开。电泳也可将蛋白质与污染物分开，所述污染物可能已经随所述蛋白质被加载至凝胶上。施加电流时，所述污染物可能无法进入凝胶，可能从该凝胶扩散进入周围缓冲液，或可能比感兴趣蛋白质更慢或更快地通过所述凝胶。为了方便，如果需要，可将分子量标志物随蛋白质样品加载进入凝胶，以允许操作者在迁移过程中或迁移之后追踪样品中蛋白质的位置。例如，如下出版物中有关于凝胶电泳技术的综述：Sambrook和Russell，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版)，纽约：冷泉港实验室出版社，2001。
一般而言，可使感兴趣蛋白质与带标记的环糊精和试剂接触，然而希望且可行地在对所述蛋白质进行凝胶电泳时进行。在一些实施方式中，例如，在跑胶之后，可将该凝胶浸没在所述带标记的环糊精、试剂或两者的溶液中。溶液中溶剂的选择、带标记的环糊精或试剂的浓度可广泛变化，并可易于根据最终产生的信号强度来优化。可采用能够使所述带标记的环糊精或试剂溶解的任何溶剂或溶剂组合。在许多情况下，水或水和低分子量醇(如甲醇、乙醇或异丙醇)的混合物就足够了。凝胶在该溶液中延长的孵育或搅动允许所述带标记的环糊精和/或试剂扩散进入该凝胶，并进而与其中悬浮的蛋白质接触。此处，孵育或搅动的时长可基于经验最优化，应记住，较长的时长也会使凝胶中的蛋白质发生更为大幅的扩散，并从凝胶扩散进入溶液。
浸没之后，可漂洗该凝胶以去除过剩的带标记的环糊精或试剂。如果溶液包含这两种要素之一(带标记的环糊精或试剂)而非同时包含两者，则采用包含另一种要素的溶液重复该方法。一旦蛋白质已与两种要素接触，所述试剂会引发与连接至环糊精的标记物的化学相互作用，从而可检测所得产物，如上所述。
在其它实施方式中，所述带标记的环糊精和/或试剂在浇制凝胶时添加至该凝胶，从而所述带标记的环糊精和/或试剂是所述凝胶的组成部分。因此，蛋白质在电泳过程中与所述带标记的环糊精或试剂接触。当所述试剂是卤素取代的有机化合物时，凝胶中采用约0.2％-约2.0％的卤素取代的化合物，而在许多情况中，约0.1％-约0.5％(以体积计)，一般能够获得有效且高效的结果。如果蛋白质必需接触的两种要素(带标记的环糊精或试剂)中仅有一种初始时存在于凝胶中，则可通过在电泳之后将该凝胶浸没在合适的溶液中来添加另一要素，如上所述。
或者，可在对所述蛋白质进行凝胶电泳之前，使所述蛋白质接触带标记的环糊精，以及任选地，所述试剂。例如，可将所述蛋白质、带标记的环糊精和试剂在缓冲液中混合在一起，从而带标记的环糊精能够结合至所述蛋白质，并与所述试剂产生化学相互作用。在该相互作用已经产生之后，可使此时连接了可检测的标记物的蛋白质在凝胶上跑动。可选择缓冲液来使蛋白质、带标记的环糊精和试剂之间的相互作用最优化，或者，可选择缓冲液来使凝胶电泳的性能最优化。在一些实施方式中，所述缓冲液是水性溶液，并且可以是利姆里缓冲液，其包含Tris-HCl、甘油、SDS、溴酚蓝，和任选的β-巯基乙醇。在另一个示例中，可在将蛋白质加载到凝胶上并在其上跑动之前，使所述蛋白质结合至所述环糊精，然后可在所述凝胶跑动过程中或跑动之后，使所述蛋白质与所述试剂接触，如上所述。本领域技术人员应理解，所述带标记的环糊精和蛋白质在电泳过程中可以不保持相联，这取决于电泳中所用的跑胶缓冲液和凝胶的组成，以及所述环糊精和标记物的化学性质，等等。此外，所述带标记的环糊精与蛋白质之间的相联可能会改变该蛋白质通过凝胶的迁移速率。
本文的还提供用于将感兴趣蛋白质从电泳凝胶转移出来，随后对其检测的方法。转移可采用电印迹法进行。在一些实施方式中，随后可利用蛋白质中的氨基酸序列来进行检测，所述氨基酸序列可以高亲和性和特异性被结合伴侣识别。所述序列在本文中称为识别序列。在一些实施方式中，所述识别序列包含的芳族氨基酸残基可通过与环糊精相联而被保护免于共价修饰。
电印迹法包括，在已经跑胶完毕之后，通过对凝胶以垂直于跑动的方向施加电场，将蛋白质转移到电泳凝胶外。将经转移的蛋白质沉积在膜(也称作‘印迹’或‘印迹膜’；通常由硝化纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成)的表面上，然后使该膜在包含所述结合伴侣的溶液中孵育。识别序列与结合伴侣之间的结合可通过光学方法检测，例如采用荧光或化学发光法，利用放射性或本领域已知的其它方法进行检测。
如果识别序列以抗体作为其结合伴侣，那么所述识别序列被称为抗体结合表位或简单地称为表位。生物技术中常用的表位的示例有：FLAG和myc表位。沉积在印迹上的蛋白质可在称为Western印迹的熟知技术中，利用针对所述蛋白质的表位的抗体来检测。检测可通过例如如下方式来完成：将荧光标记物偶联至所述抗体，用合适波长的光照射所述印迹，并观察由所述标记物重新发出的光。作为所述标记物的替代，可使合适的酶或化学结构偶联至所述抗体，以诱导化学发光。所述结构的一个示例是辣根过氧化物酶(HRP)，其在过氧化氢的存在下催化鲁米诺氧化成3-氨基邻苯二甲酸酯，由此发出可见光。或者，所述抗体可以纳入放射性同位素(例如35S)，然后采用盖革(Geiger)计数器或对该同位素的衰变敏感的胶片来检测。
作为直接检测与所述表位结合的抗体的替代，可采用二抗。二抗对结合该表位的抗体(本领域称为‘一抗’)具有特异性，并且可偶联至荧光标记物、化学发光催化剂或如上所述的其它检测工具。在将印迹与一抗孵育之后，可使该印迹与二抗孵育，然后可检测包含与结合至所述表位的一抗结合的二抗的‘夹心’复合体。在一些情况下，可使所述印迹上结合的抗体脱除，以允许采用不同的抗体组检测所述印迹上的蛋白质。
或者，所述识别序列可结合非抗体蛋白质，或其可结合小分子。在该情况中，所述识别序列可称为亲和标签(尽管术语‘表位’和‘亲和标签’有时在本领域中可互换使用)。亲和标签的示例有：STP1(氨基酸序列WTHPQFER，SEQ ID NO:1)、Strep-标签I(氨基酸序列AWRHPQFGG，SEQ ID NO:2)，和Strep-标签II(氨基酸序列WSHPQFEK，SEQ ID NO:3)(通称为‘Strep-标签’)，其结合蛋白质链霉亲和素及其工程改造的突变体(称作Strep-Tactin(参见例如，Schmidt等，J.Mol.Biol.255，753-766，1996))。像抗体一样(上文描述)，可使亲和标签的结合伴侣偶联至合适的分子检测工具。
在本发明方法，能够对包含具有芳族氨基酸残基(即，色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸)的识别序列的蛋白质进行凝胶电泳，并任选地采用带标记的环糊精检测。例如，可使蛋白质与带吲哚标记的环糊精和卤素取代的有机化合物接触，随后可将所述蛋白质暴露在紫外光下对其进行检测。所述带标记的环糊精可结合至所述蛋白质中的芳族残基，这些芳族残基包括识别序列中的那些。然后，可将所述蛋白质转移至印迹膜，并利用所述识别序列来检测。由于芳族残基已被带标记的环糊精保护，它们不会经历共价修饰。具体而言，色氨酸残基不与卤素取代的有机化合物反应。因此，所述识别序列保持完整，从而具有与结合伴侣相互作用的能力。
在一些实施方式中，将从电泳凝胶中的蛋白质检测剩余下来的化学实体，例如所述环糊精、所述试剂，以及所述可检测的产物，从所述蛋白质移除，然后再检测所述印迹膜上的蛋白质。所述移除可在将蛋白质从凝胶转移至膜之时进行，或者可通过在所述转移之后清洗该膜来实现。其它移除技术是本领域已知的。在其它实施方式中，不进行或尝试所述化学实体的移除。环糊精的移除，具体而言，从蛋白质移除环糊精，在该环糊精不干扰识别序列和结合伴侣之间的结合的情况下是非必需的。
本文所述的采用带标记的环糊精检测蛋白质的方法并不限于在电泳凝胶上进行的检测。因此，蛋白质可在溶液中、表面上、印迹膜上等采用带标记的环糊精来检测。印迹膜的检测不必利用蛋白质中的识别序列或该识别序列的结合伴侣，并且不必在之前进行其中使所述蛋白质与环糊精接触的凝胶电泳处理。而是，例如，可使所述蛋白质经历电泳，并采用标准方案转移至印迹膜。然后，可使所述印迹膜，进而使所述蛋白质，与带标记的环糊精和试剂接触，如上所述，例如通过将该膜浸没在一种或多种溶液中。随后，环糊精标记物和试剂之间的化学相互作用产生的产物可采用上述技术或其变化形式来检测。
本发明方法还提供用于使带标记的环糊精与试剂在没有蛋白质存在的情况下直接接触。随后，可引起共价连接至环糊精的标记物与所述试剂之间的化学相互作用，使所述标记物可检测。所得的环糊精可直接施加至感兴趣蛋白质，以允许对该蛋白质进行检测。采用共价连接至吲哚部分的环糊精，以及卤素取代的有机化合物，该方法可用于制备共价连接至取代的吲哚的环糊精，其随后可结合至蛋白质并在暴露至紫外光下时检测。在一些实施方式中，所述方法包括使蛋白质与共价连接至至少一个取代的吲哚部分的环糊精接触；使所述蛋白质暴露至紫外光；和检测荧光发射，由此检测所述蛋白质。
如果使标记物可检测的化学相互作用在使所述蛋白质与所述带标记的环糊精接触之前发生，则能获得更大的灵活性。例如，该化学相互作用可在这样的条件下进行，所述条件不利于环糊精与具体的感兴趣蛋白质结合。此外，可使可检测的带标记的环糊精(即，经历所述化学相互作用的带标记的环糊精)与杂质分离，例如带有不可检测的标记的环糊精、不带标记的环糊精或游离试剂。所述分离能够降低蛋白质检测时的背景，并且可采用色谱或其它标准技术进行。然而，在使所述带标记的环糊精与蛋白质接触之前进行化学相互作用也可能使形成之后不保持连接至所述环糊精的可检测的产物的应用复杂化。所述产物的一个示例，如上所述，是由试剂切割产生的有色分子，其中切割由标记物催化。所述产物可在环糊精结合至感兴趣蛋白质之前从所述环糊精扩散出去，结果是该产物和蛋白质不一定共定位。
可使共价连接至至少一种可检测的标记物(例如发荧光的经取代的吲哚部分)的环糊精按需与感兴趣蛋白质接触。举例但非限制，接触可在溶液中、电泳凝胶中，或印迹膜上进行。如果对蛋白质进行凝胶电泳，接触可在电泳之前、过程中或之后进行，并且所述可检测的带标记的环糊精可以是蛋白质或凝胶接触的组合物的部分，或所述凝胶的组成部分，如上所述。在与所述蛋白质接触之前，可制备带标记的环糊精，然后按需引起其与合适的试剂的化学相互作用。例如，用于引起化学相互作用方法可以与在蛋白质存在下对带标记的环糊精和试剂所用的方法相同，或者可针对蛋白质不存在的情况进行最优化。
组合物
还提供用于检测蛋白质的组合物。所述组合物可包含环糊精和试剂，所述环糊精共价连接至至少一种标记物，所述试剂与所述至少一种标记物发生化学相互作用，由此使所述标记物可检测。或者，组合物可包含共价连接至至少一种标记物(例如经取代的吲哚部分)的环糊精，其中与试剂的化学相互作用已经发生。所述环糊精、标记物和试剂可具有上述任何特点或性质，并且可被用于上述方法或其变化形式。在同时包含环糊精和试剂的组合物中，所述环糊精和试剂可处于分开的容器或空间中，或可以处于相同容器或空间中(例如混合在一起)。所述组合物可以是任何物质状态，例如固态或液态。除了环糊精和试剂以外，所述组合物可包含其它要素，例如(但不限于)溶剂、基质、催化剂、化学反应性物质或惰性物质。
电泳凝胶
在一些实施方式中，本发明提供用于分离和/或检测蛋白质的电泳凝胶(本文中和本领域中也简称‘凝胶’)。本文涉及的电泳凝胶可包含共价连接至至少一种标记物的环糊精。所述凝胶还可包含能够与至少一种标记物发生化学相互作用的试剂，如上所述。在一些方面中，所述凝胶可包含如上所述的组合物。
所述环糊精、标记物、所述环糊精与标记物之间的连接方式、试剂、组合物和电泳凝胶可具有任何上述特点或性质，并且可被用于上述方法或其变化形式。
电泳凝胶可具有组成部分，例如已经纳入其中的带标记的环糊精或试剂。或者，所述凝胶可具有将这些组成部分纳入其中的方式。例如，前体化学品如丙烯酰胺可与所述带标记的环糊精或试剂一起提供，从而操作者可在浇制凝胶之时将这些组成部分纳入所述凝胶。在另一个示例中，所述带标记的环糊精或试剂可以一种或多种溶液的形式与预浇制的凝胶一起提供，从而可在使该凝胶在所述溶液中孵育之时，将所述组成部分纳入所述凝胶。一般而言，所述凝胶可采用本文所述的方法或本领域已知的方法制备。
试剂盒
还提供用于检测蛋白质的试剂盒。本文中涉及的试剂盒可包含共价连接至至少一种标记物的环糊精。所述试剂盒还可包含能够与所述至少一种标记物发生化学相互作用的试剂，如上所述。在一些方面中，所述试剂盒可包含如上所的组合物。在一些方面中，所述试剂盒可包含如上所述的电泳凝胶，其可任选地包含所述环糊精或试剂。所述试剂盒还可包含水性缓冲液，以及所述环糊精、试剂，或者所述试剂盒的其它组分可以是所述水性缓冲液的组成部分。
鉴于其涉及试剂盒，所述环糊精、标记物、所述环糊精和标记物之间的连接方式、试剂、组合物、电泳凝胶，和水性缓冲液，等等，可具有任何上述特点或性质。所述试剂盒可被用于上述方法或其变化形式。
在一些实施方式中，所述试剂盒的一些或全部组分在分开的容器或空间中提供，并且可由操作者在进行方法以检测蛋白质的过程中合并。组分的合并可包括，例如，将所述组分混合在一起，将一种组分纳入另一种，或允许一种组分与另一种反应或相互作用。在其它实施方式中，所述试剂盒的一些或全部组分处于相同容器或空间中，并且在提供给操作者之前被合并。
实施例1
将宽范围蛋白质标准品(Bio-Rad目录号161-0317)从储液稀释至30ng/μl的浓度，并加载到三块TGX SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad目录号456-8093)中。在各凝胶中，一个泳道加载300ng蛋白质，一个泳道加载150ng，且一个泳道加载75ng蛋白质。电泳之后，将凝胶在包含三氯乙醇(TCE)和不同浓度的甲基-β-环糊精(MBCD)的溶液中浸泡20分钟：(A)无MBCD+0.5％TCE v/v，(B)2.5mM MBCD+0.5％TCE v/v，和(C)25mM MBCD+0.5％TCE v/v。
然后，使所述凝胶暴露至紫外光，以允许TCE与暴露的色氨酸残基反应以及如此反应的色氨酸残基的荧光激发。显示发出可见光的凝胶图像示于图2。由图像可见，凝胶的300ng泳道中的β-半乳糖苷酶条带(MW约200,000Da)采用标准图像分析软件定量。定量的结果示于图3。将β-半乳糖苷酶条带和凝胶两者作为一个整体，检测到的荧光发射水平随着MBCD浓度的增加而下降。该趋势指示，随着MBCD浓度增加，蛋白质内的色氨酸残基更大程度上受到保护以免于与TCE的反应和共价修饰。
实施例2
通过连续稀释制备了四种不同浓度的宽范围蛋白质标准品。将四种浓度加载进入三块10％T,2.6％C手工浇制聚丙烯酰胺凝胶的各泳道1-4。电泳之后，将所述凝胶浸泡在不包含MBCD且包含不同浓度的TCE的溶液中：(A)0.5％TCE v/v，(B)0.47％TCE v/v，和(C)0.25％TCE v/v。然后，如同实施例1那样，对所述凝胶成像。
检测到的荧光并没有随着TCE浓度的降低而显著下降(图4)，这指示实施例1中显示的信号的丢失并不是因为包含MBCD的溶液中TCE的缺失(通过将TCE纳入MBCD腔)。
***
本文引用的所有文件(例如，专利、专利申请、书籍、期刊论文或其它公开物)通过引用全文纳入本文以用于所有目的，就好像将各篇单独的文件特定且单独地通过引用全文纳入本文用于所有目的一样。对于通过引用纳入的此类文件与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
可获得本发明的多种修改形式和变化形式而不背离本发明的精神和范围，这对于本领域技术人员而言是显见的。本文所述的的具体实施方式仅起示例作用，且不意于构成任何方式的限制。本说明书和实施例应仅视为示例性的，本发明真正的范围和精神由所附权利要求书来说明。

Claims (63)

1.一种检测蛋白质的方法，所述方法包括：
使所述蛋白质与共价连接至至少一种含吲哚标记物的环糊精接触，所述接触使得环糊精与蛋白质的芳族氨基酸残基结合；
使所述标记物与试剂接触，并使所述蛋白质在所述试剂存在下接触UV光，所述试剂是卤素取代的有机化合物；
引起所述试剂与所述至少一种标记物之间的化学相互作用以形成产物；
检测所述产物，由此检测所述蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精和γ-环糊精。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1个。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种标记物包含色氨酸残基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述至少一种标记物包含多肽。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述卤素取代的有机化合物选自下组：氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯，和3-溴-1-丙醇。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产物包含取代的吲哚部分，且所述取代的吲哚部分的分子量与未取代的吲哚部分相差28、44或58Da。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产物包含取代的吲哚部分，且所述取代的吲哚部分包含甲酰基、羧酸、羟基乙酮或丙醇基团。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测所述产物包括检测发射的光。
12.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括对所述蛋白质进行凝胶电泳，并且其中在电泳凝胶中检测所述蛋白质。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在凝胶电泳之前，使所述蛋白质与所述环糊精和所述试剂接触。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述环糊精和试剂悬浮于缓冲液中，并且所述接触包括使所述蛋白质与所述缓冲液接触。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在凝胶电泳之后，使所述蛋白质与所述环糊精和所述试剂接触。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述环糊精和试剂悬浮于缓冲液中，并且使所述电泳凝胶与所述缓冲液接触，由此允许所述环糊精和试剂扩散进入所述电泳凝胶，并使所述蛋白质与所述环糊精和试剂接触。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述环糊精或试剂是所述电泳凝胶的组成部分，并且在对所述蛋白质进行凝胶电泳之时，使所述蛋白质与所述环糊精或所述试剂接触。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将所述蛋白质转移出所述电泳凝胶并转移至印迹膜上；和
检测所述印迹膜上的蛋白质。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述蛋白质移除环糊精、试剂，或产物。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包含亲和标签或抗体结合表位，并且，检测所述印迹膜上的蛋白质包括：使所述印迹膜与所述亲和标签或抗体结合表位的结合伴侣接触。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述亲和标签或抗体结合表位包含色氨酸残基。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述亲和标签是Strep-标签。
23.一种组合物，其包含：
环糊精，其共价连接至至少一种含吲哚标记物；和
试剂，其能与至少一种标记物发生化学相互作用，由此使所述标记物可检测，所述试剂是卤素取代的有机化合物，当蛋白质在所述试剂存在下暴露于UV光时发生所述化学反应。
24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精和γ-环糊精。
25.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
26.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述至少一种标记物包含色氨酸残基。
27.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述至少一种标记物包含多肽。
28.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
29.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述卤素取代的有机化合物选自下组：氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯，和3-溴-1-丙醇。
30.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1个。
31.一种电泳凝胶，其包含如权利要求23-30中任一项所述的组合物。
32.一种试剂盒，其包含：
环糊精，其共价连接至至少一种含吲哚标记物；和
试剂，其能与至少一种标记物发生化学相互作用，由此使所述标记物可检测，所述试剂是卤素取代的有机化合物，当蛋白质在所述试剂存在下暴露于UV光时发生所述化学反应。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精和γ-环糊精。
34.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种标记物共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
35.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种标记物包含色氨酸残基。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种标记物包含多肽。
37.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
38.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述卤素取代的有机化合物选自下组：氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯，和3-溴-1-丙醇。
39.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，每个环糊精的标记物的平均数量是至少1个。
40.如权利要求32-39中任一项所述的试剂盒，其还包含电泳凝胶，其中，所述环糊精是所述电泳凝胶的组成部分。
41.如权利要求32-39中任一项所述的试剂盒，其还包含电泳凝胶，其中，所述试剂是所述电泳凝胶的组成部分。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其特征在于，所述环糊精也是所述电泳凝胶的组成部分。
43.如权利要求32-39中任一项所述的试剂盒，其还包含水性缓冲液，其中，所述环糊精是所述水性缓冲液的组成部分。
44.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，所述水性缓冲液是利姆里缓冲液。
45.一种检测蛋白质的方法，所述方法包括：
使所述蛋白质与包含环糊精的组合物接触,所述环糊精共价连接至至少一种取代的吲哚部分；
使所述蛋白质暴露至紫外光；
检测荧光发射，由此检测所述蛋白质。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述环糊精选自下组：α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精和γ-环糊精。
47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述至少一种取代的吲哚部分共价连接至一个或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
48.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述取代的吲哚部分的分子量与未取代的吲哚部分相差28、44或58Da。
49.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述取代的吲哚部分包含甲酰基、羧酸、羟基乙酮或丙醇基团。
50.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述取代的吲哚部分是未取代的吲哚部分与卤素取代的有机化合物的紫外光诱导的反应的产物。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述卤素取代的有机化合物选自下组：氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯，和3-溴-1-丙醇。
52.如权利要求45所述的方法，其特征在于，每个环糊精的取代的吲哚部分的平均数量是至少1个。
53.如权利要求45所述的方法，所述方法还包括对所述蛋白质进行凝胶电泳，并且其中在电泳凝胶中检测所述蛋白质。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，在凝胶电泳之前，使所述蛋白质与所述组合物接触。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述组合物悬浮在缓冲液中，并且所述接触包括使所述蛋白质与所述缓冲液接触。
56.如权利要求53所述的方法，其特征在于，在凝胶电泳之后，使所述蛋白质与所述组合物接触。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述组合物悬浮在缓冲液中，并且使所述电泳凝胶与所述缓冲液接触，由此允许所述组合物扩散进入所述电泳凝胶，并使所述蛋白质与所述组合物接触。
58.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述组合物是所述电泳凝胶的组成部分，并且，在对所述蛋白质进行凝胶电泳之时，使所述蛋白质与所述组合物接触。
59.如权利要求53-58中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将所述蛋白质转移出所述电泳凝胶并转移至印迹膜上；和
检测所述印迹膜上的蛋白质。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述蛋白质移除所述组合物。
61.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包含亲和标签或抗体结合表位，并且所述检测包括使所述印迹膜与所述亲和标签或抗体结合表位的结合伴侣接触。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述亲和标签或抗体结合表位包含色氨酸残基。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述亲和标签是Strep-标签。
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