CN1053925C - 新型组织型纤溶酶原激活剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因工程重组的新型组织型纤溶酶原激活剂。
本发明构建了一种基因工程重组的新型组织型纤溶酶原激活剂。将天然组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator即t-PA)的F与E区的连接序列为44-50位的HSVPVKS共7个氨基酸残基置换、去除t-PA结构中296-302位7个氨基酸残基、并将其结构中K1、K2区去糖基化。得到了能够显著延长半衰期、提高特异活性、具有PAI-1抗性同时与纤维蛋白亲和力不受影响的组合突变体，以得到多种特性均有改善的新型t-PA溶栓剂候选株。

Description

新型组织型纤溶酶原激活剂
本发明涉及一种生物工程药物，特别是涉及基因工程重组的新型组织型纤溶酶原激活剂。
基因工程重组的组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogenactivator简称t-PA，下同)，可作为溶血栓药物，但有如下缺陷：1、在血中半衰期甚短；2、血浆中存在t-PA的天然抑制剂-I型纤溶酶原激活剂抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1，简称PAI-1，下同)可快速抑制t-PA活性。因此，延长t-PA半衰期、引入PAI-1抗性及进一步提高特异性活性是t-PA改构研究的重要内容。
延长t-PA半衰期的改构研究近年来主要集中在t-PA的F区，F区的去除可显著延长半衰期，但F区是介导t-PA与血栓基质纤维蛋白特异亲和的区域，F区的去除也使t-PA丧失了溶栓特异性。1990年Ahern等提出t-PA的F区中F区与E区的连接序列(42-49位氨基酸残基)改变可使t-PA半衰期延长，而对其与纤维蛋白的亲和力的影响较小，但未报道影响程度(Ahern TJ，et al.J Biol Chem1990；265：5540)。1992年有人证实P47G/K49N在中国仓鼠血中半衰期延长了10倍，但与纤维蛋白亲和力大大下降(Nelles L，Li X.-K Thromb Haemosta(in press))。
已有人证明，去除t-PA结构中296-302位7个氨基酸残基可使t-PA抗其抑制剂PAI-1的能力大大提高(Madison EL，et al.Nature 1989；339：721，X.-K.Li，et al.Blood 1992；79：417)。有人研究证明，消除t-PA K1、K2区糖基化位点可提高其特异性活性、延长其半衰期(Haigwood NL，et al.Protein Engineering 1989；2：611 Hotchkiss A，et al.Thromb Haemostas 1988；60：255)。
目前尚未见半衰期延长、特异性活性提高、抗PAI-1等多种特性均有改善的t-PA突变体的报道。t-PA F区与E区连接序列的改变虽可显著延长t-PA半衰期，但同时与纤维蛋白亲和力亦有一定程度损失。
本发明的目的是构建出半衰期延长、抗PAI-1、特异性活性提高，同时与纤维蛋白亲和力不受损害的t-PA组合突变体。
本发明的主要内容是：
1、以纤粘蛋白I型F区间的连接序列或人凝血因子XII间I型F区间的连接序列作为t-PA F与E区间连接序列(44-50位的HSVPVKS)替换物，用DNA定位突变技术构建出置换突变体FR，以期在不影响t-PA与纤维蛋白亲和力的同时延长半衰期，所述替换序列为：ESKPEAEE；TIANR；KPIAEK；TSRNR；ERHTSVQT；YAYSQLRDQ；DPVDQ；QPLQTYPSS；DSSRW；DPHEAT；DNCRRPG；QRLASQA。
2、用DNA定点突变技术去除t-PA的PAI-1结合位点(K296-G302)，构建出PAI-1结合位点缺失突变体Δ(296-302)，作为抗PAI-1的手段。
3、将K1、K2区的糖基化位点Asn117和Asn184同时突变为Gln117和Gln184，构建去糖基化的突变体N117Q/N184Q，以提高t-PA的特异活性。
4、为了将内容1、2、3中的三个单突变体的特性融于一身，用分子剪裁技术进一步构建了三者的组合突变体-FR/N117Q/N184Q/Δ(296-302)。
本发明得到了能够显著延长半衰期、提高特异活性、具有PAI-1抗性同时与纤维蛋白亲和力不受影响的组合突变体，从而得到了多种特性均有改善的新型t-PA溶栓剂候选株。
图1的说明
1、图1为野生t-PA-级结构及功能区示意图。
t-PA是由F区(1-50)、E区(51-87)、K1区(88-176)、K2区(177-275)及蛋白酶功能区P(276-527)组成。
2、本发明所构建的t-PA组合突变体FR/N117Q/N184QΔ(296-302)与野生t-PA比有如下改变：
At-PA F区与E区的连接序列(H44-S50)被置换成人纤粘蛋白I型F区间的连接序列及人凝血因子VII间I型F区间的连接序列，如ESKPEAEE，在不影响与纤维蛋白亲和力的同时延长半衰期。
B K1及K2区中的糖基化位点N117及N184同时被突变为Q117及Q184，以消除糖基化位点，增强特异活性。
C缺失了296-302位共7个氨基酸残基，以引入PAI-1抗性。
实施例
利用定位突变技术及分子剪裁技术等构建了t-PA F与E区连接序列H44SVPVKS50突变成纤粘蛋白I型F区间的连接序列ESKPEAEE的置换突变体FR1、PAI-1结合位点K296-G302 7个氨基酸残基缺失的突变体Δ(296-302)、K1、K2区去糖基化的突变体N117Q/N184Q。在此基础上构建了三者的组合突变体FR1/N117Q/N184Q/Δ(296-302)。将此组合突变体的cDNA序列组入了真核细胞表达载体，并在COS-7细胞及CHO细胞中成功地进行了表达，并对表达出的突变体蛋白的特性进行了研究。
结果如下：
1、以大白鼠为药代动力学模型，经尾静脉注入5000IU的此组合突变体，在给药0-30分钟内7次从颈静脉插管中抽取血样，以间接显色法测血中t-PA变化，并绘制药一时曲线，从曲线中得知，此突变体的半衰期为28.0分钟(3只动物的结果)。同样方法测得的野生t-PA半衰期为1.7分钟(2只动物的结果)。可见半衰期延长了15倍。
2、此突变体的酶活性(12IU/ml)不被PAI-1(12AU/ml)抑制，而等量的野生t-PA活性却被PAI-1完全抑制，可见此组合突变体获得了PAI-1抗性。
3、以纤维蛋白琼脂糖平板法测得的t-PA活性值(IU)与用ELISA法测得含量值(μg)的比值(IU/μg)作为t-PA特异活性值，三次测定结果平均值为：野生t-PA 250IU/μg，组合突变体364IU/μg，可见组合突变体的特异活性提高了46％。
4、根据文献Hitoshi Yahara，et al.Thrombosis Haemostasis1992；68，672提供的方法测定了此组合突变体及野生t-PA与纤维蛋白的亲和力，此组合突变体与纤维蛋白的亲和力略高于野生t-PA。
根据以上结果可认为t-PA突变体FR1/N117Q/N184Q/Δ(296-302)显著延长了半衰期，具有PAI-1抗性，特异活性提高了46％，同时与纤维蛋白亲和力未受影响且略有升高，是一株新型t-PA溶栓剂候选株。

Claims (3)

1、一种基因工程重组组织型纤溶酶原激活剂，其特征是其F区与E区的连接序列由野生型组织型纤溶酶原激活剂第44-50位的氨基酸序列HSVPVKS置换为下述一组氨基酸序列中的任一个序列：ESKPEAEE；TIANR；KPIAEK；TSRNR；ERHTSVQT；YAYSQLRDQ；DPVDQ；QPLQTYPSS；DSSRW；DPHEAT；DNCRRPG；QRLASQA。
2、如权利要求1所述的基因工程重组组织型纤溶酶原激活剂，其特征是其F区与E区的连接序列置换为ESKPEAEE。
3、如权利要求1所述的基因工程重组组织型纤溶酶原激活剂，其特征是其F区与E区的连接序列置换为ESKPEAEE，另外缺失了野生型组织型纤溶酶原激活剂的第296-302位氨基酸残基，并且K1、K2区的糖基化位点即野生型组织型纤溶酶原激活剂的第117位和第184位的天冬酰胺同时突变为谷氨酰胺。
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PROREI ENGINEERING VOL.2 1989.1.1 HAIGWOOD N.L.ET AL *
THE J OF BIOL.CHEM VOL.265.NO.10 1990.1.1 AHERN T.L. ET AL *

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