CN105378476A

CN105378476A - Gi蛋白磷酸化作为脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物，增加脊柱侧凸受试者中的GiPCR信号传导的方法

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Publication number: CN105378476A
Application number: CN201480040278.XA
Authority: CN
Inventors: A·莫罗; M-Y·阿库姆东
Original assignee: CHU STE-JUSTINE
Current assignee: CHU STE-JUSTINE
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2034-06-16
Also published as: EP3011331B1; AU2014284075A1; US20180284132A1; CN105378476B; US20160139146A1; EP3011331A1; WO2014201557A1; HK1220008A1; CA2914208A1; KR20160020552A; EP3011331A4

Abstract

提供将患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)或处于发展青少年特发性脊柱侧凸的受试者分层为诊断上或临床上有用的亚类的方法。所述分层是基于所述受试者的Giα蛋白丝氨酸磷酸化概况和/或在G蛋白偶联的受体中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的不均衡程度。在一些实施方案中，所述方法涉及检测或测定所述细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα1和/或Giα3蛋白的水平，和/或从所述受试者的生物样品测定对Giα蛋白刺激的反应与对Gsα蛋白刺激的反应之间的比率。还提供预测AIS受试者发展严重脊柱侧凸的风险的方法、预测所述受试者对装矫正架治疗的反应性的方法以及鉴别治疗上有用的化合物的方法，以及用于所述方法的试剂盒。

Description

Gi蛋白磷酸化作为脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物，增加脊柱侧凸受试者中的GiPCR信号传导的方法

相关申请的交叉引用

本申请是2014年6月16日提交并且根据PCT条约第21条(2)款以英文公布的PCT申请序列号PCT/CA2014/*，本申请要求2013年6月17日提交的美国临时申请序列号61/835,839的权益。以上所有文件以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本发明涉及脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物。更具体地说，本发明涉及Gi蛋白磷酸化作为脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物、增加脊柱侧凸受试者中的GiPCR信号传导的方法以及其用于分层脊柱侧凸患者和预测发展脊柱侧凸的风险的用途以及增加脊柱侧凸受试者中的GiPCR信号传导的方法。

对序列表的引用

根据37C.F.R.1.821(c)，序列表特此作为命名为14033_122_ST25.txt的ASCII兼容文本文件提交，它是在2014年6月16日创建并且具有57千字节的大小。上述文件的内容特此以引用的方式整体并入。

发明背景

特发性脊柱侧凸是不明原因的脊柱畸形，其通常被定义为伴有脊椎旋转的大于10度的侧弯¹。青少年特发性脊柱侧凸(AIS)是全世界最频繁的幼年期畸形之一，其特征在于不明原因的3D脊柱畸形，并且既代表直接的医学挑战，又代表终生影响个体的慢性病状。它是青少年中最常见的需要外科手术的矫形病状，并且影响4％的此群体。所述病状最常见地在9至13岁的年龄之间被诊断^2,3,4。所述诊断主要是排除并且仅在排除脊柱畸形如椎骨畸形、神经肌肉病症或综合征病症的其他原因之后进行。传统地，躯干不对称在身体检查期间通过亚当斯前屈测试揭示并且用脊柱侧凸测量计测量⁵。然后可以使用科布方法通过弯曲的影像学观察和角度测量来确认所述诊断⁶。

一旦诊断，医师在管理脊柱侧凸儿童方面的主要关注是弯曲是否将进展。确实，弯曲进展经常是不可预测的并且在女孩之中比在男孩中更频繁地观察到⁷。如果未经治疗，弯曲可能急剧进展，从而产生显著身体畸形且甚至心肺问题。当弯曲超过70度时，这些表现形式变得威胁生命^8,9。用于预防或终止弯曲进展的当前治疗选择包括装矫正架和外科手术。一般来说，对于在25与40度之间的弯曲推荐装矫正架，而对大于45度的弯曲或对装矫正架无反应的弯曲保留外科手术。当前在美国，大约一百万的10与16岁之间的儿童具有某种程度的IS。大约10％的被诊断具有特发性脊柱侧凸的儿童具有需要矫形外科手术的弯曲进展¹⁰。每年在北美进行约29,000例脊柱侧凸外科手术，从而导致显著的心理和生理发病率。(GoldbergMS,MayoNE,PoitrasB等TheSte-JustineAdolescentIdiopathicScoliosisCohortStudy.PartI:Descriptionofthestudy.Spine1994；19:1551-61；PoitrasB,MayoNE,GoldbergMS等TheSte-JustineAdolescentIdiopathicScoliosisCohortStudy.PartIV:Surgicalcorrectionandbackpain.Spine1994；19:1582-8)。

当前，没有可靠的方法或测试可供用于鉴定处于发展IS的风险的受试者以预测哪些受影响的个体需要治疗来预防或终止所述疾病的进展，以使得可以尽早提供适当治疗并且预防外科手术并发症以及心脏和/或呼吸问题。(WeinsteinSL,DolanLA,ChengJC等Adolescentidiopathicscoliosis.Lancet2008；371:1527-37)。

因此，当前治疗如装矫正架或外科手术矫正的应用被延迟直到检测到显著畸形或直到清楚地展示显著进展，从而导致延迟的、不太理想的治疗并且通常导致严重的心理后遗症(SocietySR.Morbidity&MortalityCommitteeannualReport1997)。

当前，为了检测畸形，使诊断的儿童在几年内经受多次射线照相，通常直到他们达到骨骼成熟。据估计，患有脊柱侧凸的典型患者将在3年时期内具有大约22次放射学检查¹¹。多次射线照相检查存在潜在风险。也是由于这一原因，能够允许进行特发性脊柱侧凸的预后的替代方法是强烈合乎需要的。

在开发能够有助于患者的治疗选择的诊断测试方面的主要限制是AIS的异质性质。在临床水平，AIS的异质性通过弯曲形态的变化性、定位和弯曲幅度、甚至在具有多个受影响的成员的家庭清楚地显示。

在不存在可靠的AIS表型的情况下，需要更好地了解与疾病发作和脊柱畸形进展相关的分子变化。疾病的分子定义正在迅速替代传统的基于病理学的疾病描述，这是部分由于其在鉴定针对患者的最佳治疗方案中的效用。

为此目的，在AIS患者之中报道了差别褪黑激素信号传导功能障碍的存在，从而导致他们分层为三种功能组或生物内在表型(Moreau等,2004)；(Azeddine等,2007)；(Letellier等,2008)以及Moreau的WO2003/073102。更具体地说，AIS患者被分层为代表不同生物内在表型的三个功能组(FG1、FG2和FG3)。使用这种方法，当与健康对照受试者相比时，脊柱侧凸患者和处于更高发展脊柱侧凸风险的儿童对Gi蛋白刺激的反应较小，并且所述分类是基于相对于对照组的减少程度的百分比。分类范围对于FG3被固定在10％与40％之间，对于FG2被固定在40％与60％之间且对于FG1被固定在60％与90％之间。

最近，使用细胞介电谱(CDS)技术(其是用于G蛋白以及偶联至所述蛋白的内源性受体的功能评价的无标记方法(Verdonk等,2006))，据发现，在通过褪黑激素刺激退黑激素受体之后的细胞反应在正常成骨细胞中主要是Gi依赖性的并且在来源于AIS患者的成骨细胞中减少至不同程度(Akoume等,2010)。大约33％的被诊断具有缺陷型Gi蛋白功能的无症状儿童已在许多年之后发展脊柱侧凸(Akoume等,2010)。

脊柱侧凸的早期检测/预后不仅是对于成功的和侵入性更小的临床结果来说关键的，而且扩大临床医师的治疗选择范围。确实，改进患者分层和疾病分期代表在患者的脊柱畸形太晚期之前选择用于微创外科手术的AIS患者的关键步骤。

本说明书参考多个文献，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。

发明概述

本发明提供以下临床证据：Giα亚基的差别破坏出现在AIS中，并且证明这种受损是由不同Gi同种型的丝氨酸磷酸化引起的，从而导致将AIS患者分类成表示可遗传性状的三种生物内在表型。在检测受脊柱侧凸影响的所有家族成员中的同一内在表型的情况下清楚地证明遗传性。根据AIS患者的生物内在表型评价AIS患者的临床结果揭示，在两个不同组(加拿大人和意大利人)中分类在FG2内在表型中的AIS患者更易于发展严重脊柱侧凸，而分类在FG1内在表型中的AIS患者呈现低得多的疾病进展风险。

在机制体外研究中，进一步观察到出现在AIS中的Gi蛋白的功能减退导致(a)差异地扰乱不同细胞类型中的所有Gi偶联受体的系统性和广泛信号传导缺陷，(b)Gs偶联受体信号传导的增强，而Gq偶联受体信号转导未受损，以及(c)选定激酶的药理学抑制拯救或改进细胞水平下的Gi信号传导损伤并且这种反应在每种生物内在表型的功能方面变化。所述信号传导缺陷是由于涉及不同激酶的各组中的Giα亚基同种型的选择性磷酸化所致，即：FG3具有无磷酸化丝氨酸的Giα1和丝氨酸磷酸化的Giα2和Giα3；FG2具有无磷酸化丝氨酸的Giα3和丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα2；并且FG1具有丝氨酸磷酸化的Giα1、Giα2和Giα3。

这些发现提供以下证据：Gi信号传导的差别破坏突出AIS发病机制，并且代表开发创新型诊断工具和药理学疗法的理性基础。

更具体地说，根据本发明，提供一种分层患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的受试者的方法，所述方法包括：(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；和(ii)(a)测定所述细胞样品中的Giα1的丝氨酸磷酸化；(b)测定所述细胞样品中的Giα3的丝氨酸磷酸化；(c)测定所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应之间的差异(Δ)；或(d)(a)至(c)的任何组合；由此检测步骤的结果使能够将患有AIS的受试者分层为属于AIS亚类。

根据本发明的另一方面，提供一种预测受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的方法，所述方法包括：(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；(ii)(a)测定所述细胞样品中的Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化；(b)测定所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应之间的差异(Δ)；和/或(c)测定所述细胞样品中对激动剂的GiPCR反应，其中(a)Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化的不存在；(b)测定Giα/Gsα比率在约0.5与1.5之间；和/或(c)所述细胞样品中的GiPCR反应比对照样品中的GiPCR反应低约40％至60％指示所述受试者处于发展严重脊柱侧凸的风险。

在一个具体实施方案中，所述受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。

在一个具体实施方案中，所述受试者可能发展脊柱侧凸。在另一个具体实施方案中，所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸。在另一个具体实施方案中，方法是在体外。在另一个具体实施方案中，所述细胞样品包含成骨细胞、成肌细胞和/或外周血单核细胞(PBMC)。在另一个具体实施方案中，所述细胞样品包含PBMC。在另一个具体实施方案中，所述细胞包含淋巴细胞。

根据本发明的另一方面，提供一种增加有需要的受试者(例如，被诊断患有脊柱侧凸或可能发展脊柱侧凸)的细胞中的GiPCR信号传导的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：(i)PKA的抑制剂；或(ii)(a)PKC的抑制剂；(b)CaMK1或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂；或(d)(a)至(c)中的至少两者的任何组合，如果所述受试者的细胞具有丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白；(iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi3上的丝氨酸磷酸化；或(iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi1上的丝氨酸磷酸化，由此所述GiPCR信号传导在所述受试者的细胞中增加。

根据本发明的另一方面，提供以下各项的用途：(i)PKA的抑制剂；或(ii)(a)PKC的抑制剂；(b)CaMK1或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂；或(d)(a)至(c)中的至少两者的任何组合；如果所述受试者的细胞具有丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白；(iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi3上的丝氨酸磷酸化；或(iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi1上的丝氨酸磷酸化，其用于增加有需要的受试者(例如，被诊断患有脊柱侧凸或可能发展脊柱侧凸)的细胞中的GiPCR信号传导或用于制造用以增加有需要的受试者(例如，被诊断患有脊柱侧凸或可能发展脊柱侧凸)的细胞中的GiPCR信号传导的药剂。

根据本发明的另一方面，提供一种用于增加有需要的受试者(例如，被诊断患有脊柱侧凸或可能发展脊柱侧凸)的细胞中的GiPCR信号传导的组合物，所述组合物包含：(i)PKA的抑制剂；或(ii)(a)PKC的抑制剂；(b)CaMK1或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂；或(d)(a)至(c)中的至少两者的任何组合；如果所述受试者的细胞具有丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白；(iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi3上的丝氨酸磷酸化；或(iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi1上的丝氨酸磷酸化。

根据本发明的另一方面，提供一种包含以下各项的组合物：(i)PKA的抑制剂；或(ii)(a)PKC的抑制剂；(b)CaMK1或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂；或(d)(a)至(c)中的至少两者的任何组合；如果所述受试者的细胞具有丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白；(iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi3上的丝氨酸磷酸化；或(iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gαi1上的丝氨酸磷酸化。在本发明的具体实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

根据本发明的另一方面，提供一种用于分层患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的受试者的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)用于检测所述细胞样品中Giα1上不存在丝氨酸磷酸化的配体；(b)用于检测所述细胞样品中Giα3上不存在丝氨酸磷酸化的配体；(c)用于检测Giα和Gsα的配体；或(d)(a)至(c)的任何组合。

根据本发明的另一方面，提供一种用于预测受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)用于检测Giα3上不存在丝氨酸磷酸化的配体；(b)用于检测Giα和Gsα的配体；或(c)(a)与(b)的组合。

根据本发明的另一方面，提供一种用于增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)PKA的抑制剂；(b)PKC的抑制剂；(c)CaMK1或4的抑制剂；(d)CK的抑制剂；(e)CaMK2的抑制剂；或(f)(a)和(e)中的至少两者的任何组合。

在本发明的具体实施方案中，PKA的抑制剂是PKA-γ2的抑制剂。在另一个具体实施方案中，PKA的抑制剂是H89。在另一个具体实施方案中，PKC的抑制剂是PKC-η或PKC-ε的抑制剂。在一个具体实施方案中，PKC的抑制剂是在一个具体实施方案中，CaMK1的抑制剂是CaMk1δ。在一个具体实施方案中，CaMK1或CaMK4的抑制剂是STO609。在一个具体实施方案中，CK的抑制剂是CK2的抑制剂。在一个具体实施方案中，CK的抑制剂是D4476。在一个具体实施方案中，CaMK2的抑制剂是STO609或KN93。在一个具体实施方案中，有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。在一个具体实施方案中，有需要的受试者可能发展脊柱侧凸。在一个具体实施方案中，所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸。在一个具体实施方案中，所述方法是在体外。

根据本发明的另一方面，提供一种选择作为减轻或预防脊柱侧凸的潜在候选物的药剂的方法，所述方法包括使候选药剂与表达(a)PKA、(b)PKC、(c)CaMK1、(d)CaMK4、(e)CK、(f)CaMK2的细胞相接触，其中当(a)至(f)中的任一者的表达或活性降低时，选择所述候选药剂。

在本发明的具体实施方案中，PKA是PKA-γ2。在本发明的其他具体实施方案中，PKC是PKC-η或PKC-ε。在本发明的其他具体实施方案中，CaMK1是CaMK1δ。在本发明的其他具体实施方案中，CK是CK2。

在一些方面，本发明涉及一种分层患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)或处于发展青少年特发性脊柱侧凸的风险的受试者的方法，所述方法包括：(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；(ii)从所述细胞样品检测或测定所述受试者的Giα蛋白丝氨酸磷酸化概况和/或对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的不均衡程度；以及(iii)基于所述受试者的Giα蛋白丝氨酸磷酸化概况和/或对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的不均衡程度将所述受试者分层为临床上有用的AIS亚类。

在一些实施方案中，以上提及的方法包括：(a)检测或测定所述细胞样品中的Giα1的丝氨酸磷酸化；(b)检测或测定所述细胞样品中的Giα3的丝氨酸磷酸化；(c)检测或测定所述细胞样品中对Giα蛋白刺激的反应与对Gsα蛋白刺激的反应之间的比率(Giα/Gsα反应比率)或差异(Δ)；或(d)(a)至(c)的任何组合。

在一些实施方案中，以上提及的方法还包括：将所述受试者分层为属于：(1)第一AIS亚类，其特征在于：(a)丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平升高；和/或(b)在约0.5以下的Giα/Gsα反应比率；(2)第二AIS亚类，其特征在于：(a)丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；和/或(b)介于约0.5与1.5之间的Giα/Gsα反应比率；或(3)第三AIS亚类，其特征在于：(a)丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升高；和/或(b)在约1.5以上的Giα/Gsα反应比率。

在一些实施方案中，以上提及的方法还包括检测或测定所述细胞样品中的Giα2蛋白的丝氨酸磷酸化，其中相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平，检测到丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平升高。

在以上提及的方法的一些实施方案中，(1)属于第一AIS亚类的受试者具有低的严重AIS进展风险；(2)属于第二AIS亚类的受试者具有高的严重AIS进展风险；并且(3)属于第三AIS亚类的受试者具有中等严重AIS进展风险。

在一些方面，本发明涉及一种预测患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的方法，所述方法包括：(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；(ii)检测或测定：(a)所述细胞样品中Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化；(b)所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应；和/或(c)所述细胞样品中对激动剂的GiPCR反应；(iii)当：(a)所述细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白未被检测到或相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；(b)所述细胞样品中对Giα蛋白刺激的反应与对Gsα蛋白刺激的反应的比率(Giα/Gsα反应比率)介于约0.5与1.5之间；和/或(c)检测到所述细胞样品中的GiPCR反应比对照样品中的GiPCR反应低约40％至60％时，确定所述受试者处于发展严重脊柱侧凸的风险。

在以上提及的方法的一些实施方案中，步骤(ii)还包括检测或测定所述细胞样品中的Giα1和/或Giα2蛋白的丝氨酸磷酸化，其中当所述受试者的丝氨酸磷酸化的Giα1或Giα2蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1或Giα2蛋白的水平升高时，所述受试者处于发展严重脊柱侧凸的风险。

在一些方面，本发明涉及一种预测患有脊柱侧凸的受试者对装矫正架治疗的反应性的方法，所述方法包括：(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；以及(ii)检测或测定：(a)所述细胞样品中的Giα1的丝氨酸磷酸化；(b)所述细胞样品中的Giα3的丝氨酸磷酸化；(c)所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应；或(d)(a)至(c)的任何组合；(iii)当：(a)检测到丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升高；和/或(b)所述细胞样品中对Giα蛋白刺激的反应与对Gsα蛋白刺激的反应的比率(Giα/Gsα反应比率)在约1.5以上时，确定所述受试者可能对装矫正架治疗有反应。

在一些实施方案中，以上提及的受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。在一些实施方案中，所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。

在一些实施方案中，以上提及的方法是在体外。

在一些实施方案中，以上提及的细胞样品包含成骨细胞、成肌细胞和/或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，以上提及的细胞样品包含PBMC。在一些实施方案中，以上提及的PBMC包含淋巴细胞。

在一些实施方案中，以上提及的检测或测定细胞样品中的Giα1和/或Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化包括从所述细胞样品分离Giα1和/或Giα3蛋白以及使所述分离的Giα1和/或Giα3蛋白与抗磷酸丝氨酸抗体相接触。

在一些方面，本发明涉及一种增加患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者的细胞中的GiPCR信号传导的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：(i)PKA的抑制剂；(ii)(a)PKC的抑制剂；(b)CaMK1或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂；或(d)(a)至(c)中的至少两者的任何组合；如果所述受试者的细胞具有的丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白的水平升高；(iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞具有的丝氨酸磷酸化的Gαi3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Gαi3蛋白的水平未升高；或(iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞具有的丝氨酸磷酸化的Gαi1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Gαi1蛋白的水平未升高，由此所述GiPCR信号传导在所述受试者的细胞中增加。

在一些实施方案中，以上提及的PKA的抑制剂是PKA-γ2的抑制剂。在一些实施方案中，以上提及的PKA的抑制剂是H89。在一些实施方案中，以上提及的PKC的抑制剂是PKC-η或PKC-ε的抑制剂。在一些实施方案中，以上提及的PKC的抑制剂是在一些实施方案中，以上提及的CaMK1的抑制剂是CaMk1δ。在一些实施方案中，以上提及的CaMK1或CaMK4的抑制剂是STO609。在一些实施方案中，以上提及的CK的抑制剂是CK2的抑制剂。在一些实施方案中，以上提及的CK的抑制剂是D4476。在一些实施方案中，以上提及的CaMK2的抑制剂是STO609或KN93。

在一些实施方案中，以上提及的有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。在一些实施方案中，以上提及的有需要的受试者可能发展脊柱侧凸。在一些实施方案中，以上提及的脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。

在一些实施方案中，以上提及的方法是在体外。

在一些方面，本发明涉及如上所定义的抑制剂用于增加患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者的细胞中的GiPCR信号传导或在制备用于增加患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者的细胞中的GiPCR信号传导的药剂中的用途。

在一些方面，本发明涉及一种用于分层患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)或处于发展青少年特发性脊柱侧凸的风险的受试者的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)用于检测来自所述受试者的细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平的配体；(b)用于检测来自所述受试者的细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平的配体；(c)用于检测所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的配体；或(d)(a)至(c)的任何组合。

在一些实施方案中，以上提及的试剂盒还包括用于检测丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平的配体。

在一些方面，本发明涉及一种用于预测患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)用于检测来自所述受试者的细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平的配体；(b)用于检测来自所述受试者的细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的配体；或(c)(a)与(b)的组合。

在一些方面，本发明涉及一种用于增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)PKA的抑制剂；(b)PKC的抑制剂；(c)CaMK1或4的抑制剂；(d)CK的抑制剂；(e)CaMK2的抑制剂；或(f)(a)至(e)中的至少两者的任何组合。

在一些方面，本发明涉及一种选择作为治疗或预防脊柱侧凸的潜在候选物的药剂的方法，所述方法包括使候选药剂与表达(a)PKA、(b)PKC、(c)CaMK1、(d)CaMK4、(e)CK或(f)CaMK2的细胞相接触，并且当(a)至(f)中的任一者的表达或活性降低时，选择所述候选药剂。在一些实施方案中，以上提及的PKA的抑制剂是PKA-γ2。在一些实施方案中，以上提及的PKC是PKC-η或PKC-ε。在一些实施方案中，以上提及的CaMK1是CaMk1δ。在一些实施方案中，以上提及的CK是CK2。

在阅读仅参考附图通过举例给出的本发明的具体实施方案的以下非限制性描述后，本发明的其他目的、优点和特征将变得更明显。

附图简述

在附图中：

图1示出具有AIS阳性史的家族的代表性谱系。圆圈表示女性并且正方形表示男性。填充符号指示受影响的个体，并且所指示的数字对应于图2中列出的个体(病例编号)。

图2呈现来自所研究的家族的受影响的成员的AIS受试者功能组和临床数据。

图3示出褪黑激素受体的功能性在AIS中未受损。(A)对照组与AIS功能组之间针对褪黑激素的浓度反应曲线的比较。将数据针对来自对照受试者的细胞中的最大反应标准化。(B)对褪黑激素及其类似物的反应的比较。将细胞用相同浓度(1μM)的褪黑激素、碘褪黑激素或苯基褪黑激素刺激。在y轴中作为dZiec表示的阻抗指示细胞针对由Cellkey^TM设备施加的电流的电阻(欧姆)并且表示积分细胞反应。(C，D)在(C)用G-蛋白拮抗剂肽(GPAnt-2)处理4小时和(D)用百日咳毒素处理16小时之后对褪黑激素的反应的抑制曲线。(E)褪黑激素和GPAnt-2在每个功能组中的EC₅₀值和IC₅₀值。数据被表示为n＝12名患者/组的平均值(±SE)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图4示出AIS功能组通过对成骨细胞中的Gi偶联受体的不同特异性激动剂的反应的程度加以区别。(A，B，C，D，E和F)激动剂和靶向受体在每个图的左角指示。将数据针对来自对照受试者的细胞中的最大反应标准化。(G)测试的化合物在每个功能组中的EC₅₀值。数据被表示为n＝12名患者/组的平均值(±SE)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图5示出GPAnt-2对针对Gi偶联受体的不同选择性激动剂的反应的抑制曲线。(A，B，C，D，E和F)将来自不同组的对照受试者或AIS患者的成骨细胞用不同浓度的GPAnt-2预孵育4小时，之后用1μM的特异性合成激动剂刺激。测试的激动剂和靶向受体在每个图的左角中指示。将数据针对来自对照受试者的细胞中的最大反应标准化。(G)在每个功能组中针对每种测试的化合物的IC₅₀值GPAnt-2的表。数据被表示为n＝12名患者/组的平均值(±SE)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图6示出PTX对针对Gi偶联受体的不同选择性激动剂的反应的抑制曲线。(A，B，C，D，E和F)将来自不同组的对照受试者或AIS患者的成骨细胞用不同浓度的PTX预孵育16小时，之后用1μM的特异性合成激动剂刺激。测试的激动剂和靶向受体在每个图的左角中指示。将数据针对来自对照受试者的细胞中的最大反应标准化。数据被表示为n＝12名患者/组的平均值±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图7示出AIS功能组通过对成肌细胞中的Gi偶联受体的不同特异性激动剂的反应的程度加以区别。(A，B，C，D，E和F)激动剂和靶向受体在每个图的左角指示。将数据针对来自对照受试者的细胞中的最大反应标准化。(G)测试的化合物在每个功能组中的EC₅₀值。数据被表示为n＝12名患者/组的平均值(±SE)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图8示出AIS功能组通过对PBMC中的Gi偶联受体的不同特异性激动剂的反应的程度加以区别。(A，B，C，D，E和F)激动剂和靶向受体在每个图的左角指示。将数据针对来自对照受试者的细胞中的最大反应标准化。(G)测试的化合物在每个功能组中的EC₅₀值。数据被表示为n＝12名患者/组的平均值(±SE)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图9示出来自对照和AIS功能组的成骨细胞中的Gs和Gq蛋白的功能状态。通过用(A)异丙肾上腺素；或(B)去氨加压素激发细胞来评价Gs蛋白的功能性。(C)在不同浓度下计算对Gi和Gs刺激的反应之间的差异，并且通过用缓激肽(D)或内皮素-1(E)激发细胞来评定Gq的功能性。由所指示的激动剂靶向的受体亚型出现在括号中。将数据针对来自对照受试者的细胞中的最大反应标准化。(F)测试的化合物在每个功能组中的EC₅₀值。数据被表示为n＝12名患者/组的平均值(±SE)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图10示出Gi和Gs蛋白的表达在AIS功能组之间是类似的。(A)从成骨细胞提取总RNA并且qPCR用于相对于AIS功能组比较对照中的Gi₁、Gi₂、Gi₃和Gs基因的mRNA表达水平。β-肌动蛋白用作内部对照。(B)从每个功能组的成骨细胞获得裂解产物。将每种裂解产物的相等量的蛋白质(40μg)通过10％SDS-PAGE解析并且针对Gi1、Gi2、Gi3或Gs蛋白免疫印迹。β-肌动蛋白用作内部对照。

图11示出AIS功能组中Gi蛋白同种型的差异磷酸化模式。使来自对照或AIS患者的全成骨细胞经受用识别(A)Gi₁、(B)Gi₂或(C)Gi₃的抗体免疫沉淀，并且将这些沉淀物通过10％SDS-PAGE解析且针对磷酸-丝氨酸/苏氨酸特异性抗体免疫印迹。在插图中示出来自单个实验的代表性免疫印迹。通过光密度扫描定量条带。值被表示为n＝6名患者/组的平均值±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。插图描绘功能组中相应Gi蛋白同种型的典型可免疫检测的磷酸化概况。

图12示出Gi和GssiRNA对AIS功能组中对Gi刺激的反应的差别作用。将来自(A)对照受试者、(B)FG3、(C)FG2以及(D)FG1的成骨细胞用Gi₁、Gi₂、Gi₃或GssiRNA(单独或组合)或用乱序siRNA转染，如实施例1-材料和方法中所指示。在转染之后48小时用qPCR验证每个功能组(E至H)中的siRNA效率，并且通过用爱帕林-17、LPA或生长激素抑制素激发细胞来评价对Gi刺激的反应。呈现来自每个组的单个代表性受试者的结果。将数据针对用乱序siRNA转染的细胞中的反应标准化，并且表示为每个功能组中n＝6名患者的平均值±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图13示出不同丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂对来自对照和AIS功能组的成骨细胞中对Gi刺激的反应的作用。将细胞用蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89(5μM)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂(5μM)、Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)(1、2、4)抑制剂STO-609乙酸盐(5μM)、Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMK-2)抑制剂KN93(5μM)、酪蛋白激酶1(CK1)抑制剂D4476(5μM)或媒介物处理1小时，之后用(A)LPA(10^-6M)或(B)生长激素抑制素(10^-6M)刺激。将数据针对用媒介物处理的成骨细胞中的反应标准化，并且表示为每个功能组中n＝12名患者的平均值±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比对照组。

图14示出AIS中不同丝氨酸/苏氨酸激酶的表达。(A)从成骨细胞提取总RNA并且qPCR用于相对于AIS功能组比较对照中的PKC、PKA、CaMK以及CK同种型的mRNA表达水平。β-肌动蛋白用作内部对照。(B)从每个功能组的成骨细胞获得裂解产物。将每种裂解产物的相等量的蛋白质(40μg)通过10％SDS-PAGE解析并且针对所指示的激酶同种型的蛋白质免疫印迹。

图15示出AIS中不同丝氨酸/苏氨酸激酶的表达。从成骨细胞提取总RNA并且qPCR用于相对于AIS功能组比较对照中的(A)不同PKC同种型(即，PKC-α、PKC-β、PKC-δ、PKC-I、PKC-γ、PKC-θ以及PKC-ζ)和(B)CaMK的不同同种型(即，CaMK1、CaMK1γ、CaMK2α、CaMK2β、CaMK2δ、CaMK2γ、CaMK2N1、CaMK2N2以及CaMK4)的mRNA表达水平。β-肌动蛋白用作内部对照。

图16示出AIS中不同丝氨酸/苏氨酸激酶的表达。从成骨细胞提取总RNA并且qPCR用于相对于AIS功能组比较对照中的PKA和CK的不同同种型(即，(A)PKA-α1、PKA-α2、PKA-β1、PKAβ2、PKA-cβ、PKA-cγ、PKA-γ1以及PKA-γ3；以及(B)CK1α、CK1β、CK1δ、CK1ε、CK1γ1、CK1γ2、CK1γ3、CK2α1、CK2α2、CK2β)的mRNA表达水平。β-肌动蛋白用作内部对照。

图17示出Giα1同种型1与2的氨基酸序列之间的多重序列比对。

图18示出Giα2同种型1-6的氨基酸序列之间的多重序列比对。

图19示出Giα1同种型1和2、Giα1同种型1和2以及Giα3的氨基酸序列之间的多重序列比对。

示意性实施方案的说明

如本文所用，术语“发展脊柱侧凸的风险”是指受试者在未来发展脊柱侧凸(即脊柱畸形)和/或发展更严重的脊柱侧凸(即，弯曲进展)的遗传或代谢素因。例如，受试者的科布角(Cobb’sangle)的增加(例如，从40°至50°或从18°至25°)是脊柱侧凸的“发展”。

如本文所用，术语“严重进展”是受试者的科布角增加至45°或更大，可能在低年龄时。

根据本发明，患有AIS的受试者可基于其Giα蛋白磷酸化概况和/或对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的不均衡程度被分层为至少三个不同AIS亚类(FG1、FG2或FG3)。属于第一AIS亚类(FG1)的受试者通常具有严重进展的相对“低风险”–即，其发展严重脊柱侧凸的风险低于属于第二AIS亚类(FG2)和第三AIS亚类(FG3)的受试者。属于第二AIS亚类(FG2)的受试者通常具有严重进展的相对“高风险”–即，其发展严重脊柱侧凸的风险高于属于第一AIS亚类(FG1)和第三AIS亚类(FG3)的受试者。属于第三AIS亚类(FG3)的受试者通常具有严重进展的相对“中等风险”–即，其发展严重脊柱侧凸的风险高于属于第一(FG1)AIS亚类的受试者，但低于属于第二AIS亚类(FG2)的受试者。还已经发现属于所述第三AIS亚类(FG3)的受试者更可能对装矫正架治疗有反应(美国临时申请号61/879,314)。

在一个实施方案中，上述受试者是发展脊柱侧凸，如特发性脊柱侧凸(例如，婴儿特发性脊柱侧凸、少年型特发性脊柱侧凸或青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的可能候选者。如本文所用，表述“发展脊柱侧凸的可能候选者”或“可能发展脊柱侧凸”包括父母中至少有一人具有脊柱侧凸(例如，青少年特发性脊柱侧凸)的受试者(例如，儿童)。在其他因素之中，年龄(青春期)、性别和其他家族前因是已知促成发展脊柱侧凸风险的因素并且在一定程度上用于评定发展脊柱侧凸的风险。在某些受试者中，脊柱侧凸在短时期内迅速发展至需要矫正外科手术的地步(经常是畸形达到科布角≥50°时)。从脊柱侧凸如AIS被诊断的时刻(当脊柱侧凸明显时)可供使用的当前做法包括观察(当科布角在约10°-25°时)、矫形装置(当科布角在约25°-30°时)和外科手术(超过45°)。进展风险的更可靠的确定可以使得能够1)选择适当的饮食以除去被鉴定为脊柱侧凸的促成因素的某些食品；2)选择最佳治疗剂；和/或3)选择侵入性最小的可用治疗如姿势锻炼、矫形装置或侵入性较小的外科手术或无需融合的外科手术(一种不融合脊椎且保留脊柱运动性的外科手术)。本发明涵盖鉴于发展脊柱侧凸的确定的风险选择最有效的且侵入性最小的已知预防措施或治疗。

如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、狗、鸡、猫、猪、猴、马等。

在本发明的背景下“有需要的受试者”或“患者”意图包括将受益于或可能受益于PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-ε、PKC-η)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)和/或CaMK2的抑制剂的任何受试者。在一个实施方案中，有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸(例如，AIS)的受试者。在另一个实施方案中，所述受试者可能发展脊柱侧凸(例如，AIS)或处于发展脊柱侧凸的风险。

如本文所用，术语“生物样品”是指从生物分离的任何固体或液体样品。在一个具体实施方案中，生物样品是指从人分离的任何固体或液体样品。不受如此限制，生物样品包括活组织检查材料、血液、泪液、唾液、母乳、滑液、尿液、耳液、羊水和脑脊液。在一个具体实施方案中，生物样品是指血液样品。如本文所用，术语“血液样品”意指血液、血浆或血清。

如本文所用，表述“细胞样品”是指含有从受试者(例如，患有AIS、疑似患有AIS或处于发展AIS的风险的受试者)获得的表达GiPCR的细胞的生物样品。

如本文所用，术语“对照样品”意指不来自已知患有脊柱侧凸或已知是发展脊柱侧凸的可能候选者的受试者的对应样品。在用于确定被预先诊断患有脊柱侧凸的受试者中发展脊柱侧凸风险的方法中，然而所述样品还可来自在所述疾病或病症的早期阶段在密切注意下的受试者。

如本文所用，术语“对照”意指涵盖“对照样品”。在某些实施方案中，术语“对照”还指在测定多种样品(例如，从未知患有脊柱侧凸且未知是发展脊柱侧凸的可能候选者的一些受试者获得的样品)中的Giα(例如，1、2和/或3)蛋白磷酸化(例如，丝氨酸磷酸化)概况和/或对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的不均衡程度之后获得的平均值或中值。

如本文所用，关于脊柱侧凸的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指以下中的至少一种：预先存在的脊柱畸形的科布角的减小；改善脊柱运动性；保留/维持脊柱运动性；改善具体计划中的均衡和平衡；维持/保留具体计划中的均衡/平衡；改善具体计划中的功能性；保留/维持具体计划中的功能性；美容学改善；以及任何以上的组合。

如本文所用，关于脊柱侧凸的术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”意指以下中的至少一种：患有脊柱侧凸的患者中或无症状患者中科布角进展的降低；脊柱畸形的出现(包括在3D上影响肋架和骨盆的变化)的完全预防；以及任何以上的组合。

如本文所用，表述“检测或测定”细胞样品中的Giα蛋白(例如，Giα1、Giα2和/或Giα3)的丝氨酸磷酸化涉及独立地评定来自受试者的细胞样品中的Giα1和/或Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化状态。在一些实施方案中，所述评定可包括测定所述细胞样品中丝氨酸磷酸化的Giα1、Giα2和/或Giα3蛋白的存在或不存在。在一些实施方案中，所述评定可包括测定所述样品中的丝氨酸磷酸化的Giα1、Giα2和/或Giα3蛋白的表达水平，或所述细胞样品中为丝氨酸磷酸化的总Giα1和/或Giα3蛋白的比例(例如，磷酸化的和未磷酸化的)。在一些实施方案中，所述评定涉及独立地检测丝氨酸磷酸化的Giα蛋白中的每种(例如，使用特异性抗Giα1、抗Giα2和/或抗Giα3抗体)。

鸟嘌呤核苷酸结合蛋白是由α、β和γ亚基组成的异三聚体信号传导分子。α亚基结合鸟嘌呤核苷酸，能够水解GTP并且能够与其他蛋白质相互作用。如本文所用，表述“Giα”或“Giα蛋白”是指异三聚体G蛋白的Gi家族成员的α亚基。存在几种类型的Giα亚基，包括“Giα1”或“Giα1蛋白”、“Giα2”或“Giα2蛋白”、以及“Giα3”或“Giα3蛋白”。如本文所用，表述“Gs”或“Gs蛋白”是指异三聚体G蛋白的Gs家族成员的Gs亚基。Giα和Gs核苷酸和氨基酸序列的实例在以下表中示出。除非另外指示，提及特定Giα蛋白(例如，Giα1、Giα2、Giα3)包括所述特定Giα蛋白的所有表达的同种型。

如本文所用，表述“检测或测定细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应”涉及评定受试者的Giα和Gsα蛋白在刺激(例如，用适当GPCR配体或激动剂)时介导信号转导的能力，并且因此涉及Giα和Gsα蛋白的活性，但不涉及表达水平。在一些实施方案中，这可使用CellKey^TM设备来进行，如先前所描述(Akoume等,2010和Moreau等的WO2010/040234,2010)。

术语“抑制因子”、“抑制剂”和“拮抗剂”是本领域中熟知的并且在本文可互换地使用。PKA(例如，PKA-γ2)的表达抑制剂、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)的抑制剂、CaMK1(例如，CaMK1δ)的抑制剂、CaMK4的抑制剂、CK(例如，CK2)的抑制剂以及CaMK2的抑制剂包括分别能够通过例如降低其表达(即，在转录和/或翻译水平)、PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)和CaMK2mRNA的水平和/或与PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)和CaMK2相关的蛋白质或活性而不利地影响PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)和CaMK2的活性的任何化合物。它包括细胞内以及细胞外抑制因子。不受如此限制，这类抑制因子包括RNA干扰剂(siRNA、shRNA、miRNA)、反义分子、核酶、蛋白质(例如，显性阴性、无活性变体)、肽、小分子、抗体、抗体片段等。不受限制，PKA(例如，PKA-γ2)的抑制剂包括H89cGMP依赖性激酶抑制剂肽；KT5720；PKA抑制剂片段(6-22)酰胺；PKI14-22酰胺，肉豆蔻酰化的。不受限制，PKC(例如，PKC-ε和PKC-η)的抑制剂包括GF109203X；二氢鞘氨醇(Dihydrosyphingosine)；CID2858522；氯化白屈菜赤碱(Chelerythrinechloride)；CGP53353；卡弗他丁(Calphostin)C；C-1；以及双吲哚马来酰亚胺II。不受限制，CaMK1和CaMK4(例如CaMK1δ)的抑制剂包括STO609；NH125；ML9盐酸盐；autocamtide-2相关的抑制肽；以及arcyriaflavinA。不受限制，CaMK2的抑制剂包括KN93；NH125；ML9盐酸盐；autocamtide-2-相关的抑制肽；以及arcyriaflavinA。不受限制，CK(例如，CK1、CK2)的抑制剂包括(R)-DRF053二盐酸盐(抑制CK1)、鞣花酸(CK2的选择性抑制剂)、LH846(选择性酪蛋白激酶1δ抑制剂)、PF4800567盐酸盐(选择性酪蛋白激酶1ε抑制剂)、PF670462(有效和选择性的CK1ε和CK1δ抑制剂)、TBB(选择性细胞可渗透CK2抑制剂)、TMCB(抑制CK2)和D4476(选择性CK1抑制剂)。

在一个实施方案中，PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2抑制剂分别是针对(或特异性地结合)人PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)以及CaMK2多肽的中和抗体。抗体在以下进一步描述。

本发明还涉及用于测定Gαi1(具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)以及Gαs的表达水平(即，转录物(RNA)或翻译产物(蛋白质))的方法。在具体实施方案中，本发明还包括一种方法，所述方法包括测定一种或多种其他脊柱侧凸标记物的表达水平。例如，本发明可包括如Moreau的共同未决WO2008/119170中所公开测定OPN、sCD44等的表达水平(即转录物或翻译产物)。本发明因此涵盖用于这种测定的任何已知的方法，包括Elisa(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、实时PCR和竞争性PCR、RNA印迹、核酸酶保护、噬菌斑杂交以及狭线印迹。

抗体

如本文所用，术语抗PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)或Gsα抗体或免疫特异性抗PKA-γ2、PKC-ε、PKC-η、CaMK1δ、Giα1(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)或Gsα抗体分别是指与PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-ηorPKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)或Gsα蛋白特异性地结合(相互作用)不展示与除了与PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4,CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)或Gsα蛋白共享相同抗原决定簇的蛋白质以外的其他天然存在的蛋白质实质性结合的抗体。术语“抗体”或“免疫球蛋白”以最广泛意义使用且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体以及抗体片段，只要其表现出所需的生物活性。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单结构域抗体(例如，来自骆驼科动物)；鲨NAR单结构域抗体；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段还可指包含CDR或抗原结合结构域的结合部分，包括但不限于，VH区(V_H、V_H-V_H)、anticalin、PepBodies^TM、抗体-T-细胞表位融合体(Troybodies)或肽抗体。此外，针对第一抗体的任何第二抗体(单克隆或多克隆)也包括于本发明的范围内。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是人源化或CDR-接枝的抗体。

针对PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Giα3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)以及Gsα的抗体包括于本发明的范围内，因为它们可通过本领域的技术人员已知的完善建立的工序来产生。此外，针对第一抗体的任何第二抗体(单克隆或多克隆)也包括于本发明的范围内。

总之，用于制备抗体(包括单克隆抗体和杂交瘤)和使用抗体检测抗原的技术是本领域中熟知的(Campbell,1984,刊于“MonoclonalAntibodyTechnology:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology”,ElsevierSciencePublisher,Amsterdam,TheNetherlands)和Harlow等,1988(刊于：AntibodyALaboratoryManual,CSHLaboratories中)。术语抗体在本文中涵盖多克隆抗体、单克隆抗体和抗体变体，如单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体以及抑制或中和其Hyphen中的对应相互作用结构域和/或对其有特异性的抗体的免疫活性片段(例如，Fab和Fab'片段)。

优选通过多次皮下(sc)、静脉内(iv)或腹膜内(ip)注射相关抗原(用或不用佐剂)在动物中产生多克隆抗体。使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烷基)，将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔□血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可能是有用的。

可针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物，通过将抗原或缀合物(例如，对于兔是100μg或对于小鼠是5μg)与3体积的完全弗氏佐剂混合并且在多个部位皮内注射所述溶液来免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射用完全弗氏佐剂中的抗原或缀合物(例如，用于免疫的原始量的1/5至1/10)来加强免疫动物。7至14天后，对动物采血，并且针对抗体滴度测定血清。对动物加强免疫，直到滴度达到稳定。优选地，对于缀合物免疫，用相同抗原但缀合至不同蛋白质和/或通过不同交联试剂缀合的缀合物对动物加强免疫。还可在重组细胞培养物中将缀合物制备成蛋白质融合体。此外，聚集剂如明矾也适用于增强免疫反应。

可使用最初由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备或可通过重组DNA方法(例如，美国专利号6,204,023)来制备单克隆抗体。还可使用美国专利号6,025,155和6,077,677以及美国专利申请公布号2002/0160970和2003/0083293中所描述的技术来制备单克隆抗体。

在杂交瘤方法中，免疫(例如，如上所述)小鼠或其他适当的宿主动物，如大鼠、仓鼠或猴以引发产生或能够产生将特异性地结合用于免疫的抗原的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。然后使用适合的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。

将如此制备的杂交瘤细胞接种且生长在优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的适合培养基中。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。

如本文所用，表述“纯化抗体”中的术语“纯化”仅意味着区分人造抗体与动物针对其自己的抗原而天然产生的抗体。因此，含有抗-OPN抗体的原始血清和杂交瘤培养基是本发明意义内的“纯化抗体”。

本发明还涉及分离的核酸分子，包括用于检测PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1、Giα2、Giα3或Gsα(以及任选地其他脊柱侧凸标记物(例如，OPN、sCD44等)的探针和引物。在具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有不超过300、或不超过200、或不超过100、或不超过90、或不超过80、或不超过70、或不超过60、或不超过50、或不超过40或不超过30个核苷酸。在具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少30、或至少40个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过300个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过200个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过100个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过90个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过80个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过70个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过60个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过50个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过40个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少17且不超过40个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少20且不超过30个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少17且不超过30个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过300个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过200个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过100个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过90个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过80个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过70个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过60个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过50个核苷酸。在其他具体实施方案中，所述分离的核酸分子具有至少30且不超过40个核苷酸。应理解在实时PCR中，引物还构成探针，而不是所述术语的传统意义。适用于检测本发明的方法中的PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1、Giα2、Giα3或Gsα的探针和引物可使用分布在其对应核苷酸序列上的序列用已知的方法来设计。

本发明的探针可用于天然存在的糖-磷酸酯主链以及修饰的主链(包括硫代磷酸酯、连二硫酸酯、烷基膦酸酯以及α-核苷酸等)。修饰的糖-磷酸主链通常是已知的。本发明的探针可由核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)构建，且优选地由DNA构建。

可使用探针的检测方法的类型包括DNA印迹(DNA检测)、斑点或狭线印迹(DNA、RNA)和RNA印迹(RNA检测)。虽然是次优选的，但标记的蛋白质也可用于检测它所结合的特定核酸序列。其他检测方法包括含有在浸渍片装置上的探针的试剂盒等。

如本文所用，术语“可检测标记的”是指标记根据本发明的探针或抗体，所述探针或抗体将允许检测根据本发明的PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1、Giα2、Giα3或Gsα(以及任选地其他脊柱侧凸标记物(例如，OPN、sCD44等)。虽然本发明不具体地依赖于使用用于检测特定核酸序列的检测的标记，但是这种标记通过增加检测的灵敏度而可能是有益的。此外，所述标记能实现自动化。探针可根据众多熟知的方法进行标记。标记的非限制性实例包括3H、14C、32P和35S。可检测标记物的非限制性实例包括配体、荧光团、化学发光剂、酶和抗体。用于与探针一起使用的能够实现本发明的方法的灵敏度增加的其他可检测的标记物包括生物素和放射性核苷酸。对于本领域的普通技术人员将变得显而易见的是具体标记的选择决定它结合探针的方式。

如通常所已知，放射性核苷酸可通过几种方法并入本发明的探针中。其非限制性实例包括使用γ32PATP和多核苷酸激酶来激酶化(kinasing)探针的5’端、在放射性dNTP存在下使用大肠杆菌的PolI的Klenow片段(例如，在低熔点凝胶中使用随机寡核苷酸引物均匀标记的DNA探针)、在一种或多种放射性NTP存在下使用SP6/T7系统来转录DNA区段等。

本发明还涉及选择化合物的方法。如本文所用，术语“化合物”意指涵盖天然、合成或半合成的化合物，包括但不限于化学品、大分子、细胞或组织提取物(来自植物或动物)、核酸分子、肽、抗体以及蛋白质。

本发明还涉及阵列。如本文所用，“阵列”是可合成或生物合成制备的有意产生的分子的集合。阵列中的分子可以彼此相同或不同。所述阵列可采取多种型式，例如可溶性分子的文库；连接至树脂珠粒、二氧化硅芯片或其他固相支持体的化合物的文库。

如本文所用，“核酸分子的阵列”是可以多种不同型式合成或生物合成制备的有意产生的核酸的集合(例如，可溶性分子的文库；以及连接至树脂珠粒、二氧化硅芯片或其他固相支持体的寡核苷酸的文库)。此外，术语“阵列”意指包括可通过将基本上任何长度(例如，1至约1000个核苷酸单体长度)的核酸点样至衬底上来制备的核酸的那些文库。如本文所用的术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNA))的聚合形式，其包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、合成或生物合成修饰的、非天然或衍生化的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中发现)或修饰的或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分间断。因此，术语核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括类似物，如本文所描述的那些。这些类似物是与天然存在的核苷或核苷酸具有一些共同结构特征的那些分子，以使得当并入核酸或寡核苷酸序列中时，所述分子允许与溶液中的天然存在的核酸序列杂交。通常，这些类似物通过替代和/或修饰碱基、核糖或磷酸二酯部分源自天然存在的核苷和核苷酸。所述变化可定制进行以根据需要使杂合体形成稳定或不稳定或增强与互补核酸序列的杂交的特异性。

如本文所用，“固相支持体”、“支持体”和“衬底”可互换地使用并且是指具有一个或多个刚性或半刚性表面的材料或一组材料。在许多实施方案中，所述固相支持体的至少一个表面将是大致上平坦的，但是在一些实施方案中，可能希望针对不同化合物用例如孔、隆起区域、销、蚀刻槽等来物理上分离合成区域。根据其他实施方案，所述固相支持体将采取珠粒、树脂、凝胶、微球的形式或其他几何构型。

可根据本发明使用任何已知的核酸阵列。例如，这类阵列包括基于短或较长寡核苷酸探针以及cDNA或聚合酶链式反应(PCR)产物的阵列。其他方法包括基因表达的系列分析(SAGE)、差别显示以及消减杂交方法、差异筛选(DS)、RNA任意引物(RAP)-PCR、差异表达序列的限制性内切核苷酸分析(READS)、扩增的限制性片断长度多态性(AFLP)。

本发明涵盖使用用于检测或测定例如受试者的样品中的Gαi1(具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαs水平且用于包括在本发明的试剂盒中的抗体。特异性地结合这些生物标记物的抗体可用以上进一步描述的方法常规地产生。本发明还涵盖使用可商购的抗体。不受如此限制，特异性地结合Gαi1(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαs的抗体包括在以下表I中列出的那些抗体。

表I：

针对Gαi1(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi2(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)、Gαi3(例如，具有磷酸化的和/或未磷酸化的丝氨酸残基)以及Gαs的可商购的抗体

本发明还涵盖用于检测和/或定量PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1、Giα2、Giα3或Gsα的翻译产物的阵列。所述阵列包括蛋白质微阵列或大阵列，包括高分辨2D-凝胶方法在内的凝胶技术，可能在细胞水平与质谱成像系统联用，如显微镜与荧光标记系统组合。

本发明还涵盖使用全细胞测定筛选/选择潜在有用的治疗剂的方法，所述治疗性化合物能够降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1、Giα2、Giα3或Gsα的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)。用于所述方法中的细胞包括任何来源(包括内部或可商购的细胞系)和类型(任何组织)的细胞。可通过例如无限增殖来自AIS受试者的细胞来制备内部细胞系。在具体实施方案中，本发明的筛选方法寻求鉴别抑制PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1、Giα2、Giα3或Gsα表达(转录和/或翻译)的药剂。对于这些实施方案有用的细胞系包括产生高水平的PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)、CaMK2、Giα1、Giα2、Giα3或Gsα的那些细胞系。所述细胞包括成骨细胞、PMBc和成肌细胞。

在一个具体实施方案中，所述细胞包括源自脊柱侧凸患者的任何细胞类型的细胞(全细胞测定)。在具体实施方案中，所述细胞包括成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞或血细胞，包括PBMC(包括淋巴细胞)。如本文所用，术语“源自脊柱侧凸患者的细胞”是指从脊柱侧凸患者直接分离的细胞，或源自从脊柱侧凸患者直接分离的细胞的无限增殖细胞系。在具体实施方案中，所述细胞是脊柱旁肌肉细胞。这类细胞可通过例如穿刺活检从受试者分离。

药物组合物还可通过以下途径施用，所述途径如经鼻、静脉内、肌肉内、皮下、舌下、鞘内或皮内。施用途径可取决于多种因素，如环境和治疗目的。

剂量

可将任何量的药物和/或营养制品和/或饮食补充剂组合物施用至受试者。剂量将取决于包括施用方式在内的许多因素。通常，单次剂量内所包含的抗脊柱侧凸组合物(例如，降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)和/或稳定性的药剂)的量将是有效预防、延迟或减轻脊柱侧凸而不会诱导显著毒性的量，即“治疗有效量”。

还可直接测量降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)和/或稳定性的药剂的有效量。可每日或每周给予所述有效量或其几分之一。通常，本发明的药物和/或营养制品和/或饮食补充剂组合物可按每日每kg体重约0.001mg至最多约500mg(例如，10mg、50mg、100mg或250mg)的量施用。可按单次或多次剂量方案提供剂量。例如，在一些实施方案中，有效量是在以下范围内的剂量：每天约1mg至约25克抗脊柱侧凸制剂、每天约50mg至约10克抗脊柱侧凸制剂、每天约100mg至约5克抗脊柱侧凸制剂、每天约1克抗脊柱侧凸制剂、每周约1mg至约25克抗脊柱侧凸制剂、每周约50mg至约10克抗脊柱侧凸制剂、每隔一天约100mg至约5克抗脊柱侧凸制剂以及每周一次约1克抗脊柱侧凸制剂。

作为举例，本发明的药物(例如，含有降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)和/或稳定性的药剂)组合物可以是以下形式：液体、溶液、混悬液、丸剂、胶囊、片剂、软胶囊、粉末、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂、轻雾、雾化蒸汽、气溶胶或磷脂复合物(phytosome)。对于口服施用，可通过常规方法，用至少一种药学上可接受的赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂来制备片剂或胶囊。可通过本领域中已知的方法包衣片剂。用于口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或它们可呈现为用于在使用之前用盐水或其他适合的液体媒介物复原的干燥产品。用于口服施用的制剂还可适合地配制以给予活性成分的控制释放。

此外，本发明的药物(例如，含有降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)和/或稳定性的药剂)组合物可含有用于施用至哺乳动物的药学上可接受的载体，包括但不限于无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油以及可注射有机酯。水性载体包括但不限于，水、醇、盐水和缓冲溶液。药学上可接受的载体还可包括生理学上可接受的水性媒介物(例如，生理盐水)或对于特定施用途径来说适当的其他己知的载体。

可将降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)和/或稳定性的药剂与药物制剂中通常采用的任何媒介物，例如滑石、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性溶剂、油、石蜡衍生物或乙二醇结合并入剂型中。还可使用乳液，如美国专利号5,434,183中所述的那些，其中将植物油(例如，大豆油或红花油)、乳化剂(例如，卵黄磷脂)和水与甘油组合。用于制备适当制剂的方法是本领域中熟知的(参见例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,1980,A.OsloEd.,Easton,Pa.)。

在选择胃肠外施用作为施用途径的情况下，可将含有降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)和/或稳定性的药剂的制剂与药学上可接受的无菌水性或非水性溶剂、混悬液或乳液组合提供给患者。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油以及可注射有机酯。水性载体包括水、水-醇溶液、乳液或混悬液，包括盐水或缓冲的医学胃肠外媒介物，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含乳糖的林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物可包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂等。

由于实际剂量必须由主治医生基于各个患者的独特临床因素或由营养学家仔细选择和滴定，因此这些仅为简单的指导。最佳每日剂量将通过本领域中已知的方法测定，并且将受如患者的年龄的因素以及其他临床相关因素影响。此外，患者可正在服用用于其他疾病或病状的药物。可在降低PKA(例如，PKA-γ2)、PKC(例如，PKC-η或PKC-ε)、CaMK1(例如，CaMK1δ)、CaMK4、CK(例如，CK2)或CaMK2的转录和/或合成和/或活性(例如，Gi蛋白的磷酸化)和/或稳定性的药剂给予患者期间继续其他药物治疗，但在这类情况下特别建议以低剂量开始以测定是否经历不利副作用。

本发明还涉及试剂盒。不受如此限制，本发明涉及用于分层脊柱侧凸受试者和/或预测受试者是否处于发展脊柱侧凸的风险的试剂盒，所述试剂盒包括分离的核酸、蛋白质或配体，如如上所述的根据本发明的抗体。例如，根据本发明的分隔式试剂盒(compartmentalizedkit)包括试剂包含于单独容器中的任何试剂盒。这类容器包括小玻璃容器、塑料容器或塑料或纸条带。这类容器允许将试剂从一个隔室有效转移至另一个隔室，以使得所述样品和试剂不会交叉污染，并且可将每个容器中的试剂或溶液以定量方式从一个隔室添加至另一个。这类容器将包括将接受受试者样品(DNA基因组核酸、细胞样品或血液样品)的容器、含有(在本发明的一些试剂盒中)本发明的方法中所用的探针的容器、含有酶的容器、含有洗涤试剂的容器以及含有用于检测延伸产物的试剂的容器。本发明的试剂盒还可包括使用这些探针和或抗体来分层脊柱侧凸受试者或预测受试者是否处于发展脊柱侧凸风险的说明书。

冠词“一个/种(a/an)”和“所述”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，指代“至少一个”)。

术语“包括(including)”和“包含(comprising)”在本文用于意指短语“包括但不限于”和“包含但不限于”且可与所述短语互换使用。

术语“如”在本文用于意指短语“如但不限于”且可与所述术语互换使用。

术语“约”用以指示值包括用以测定所述值的装置或方法的误差的标准偏差。一般来说，术语“约”意指指定达10％的可能变化。因此，值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的变化包括于术语“约”中。

如本文所用，术语“纯化的”或“分离的”是指已与其原始存在的组合物的组分分离的分子(例如，多核苷酸或多肽)。因此，例如，“分离的多核苷酸”或“分离的多肽”已被纯化至在自然中未发现的水平。“大致上纯化的”分子是缺乏大多数其他组分的分子(例如，30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％不含污染物)。反之，术语“粗”意指未与其所存在的原始组合物的组分分离的分子。为简要起见，单位(例如，66％、67％…81％、82％、83％、84％、85％…91％、92％….)未具体地叙述但仍被认为在本发明的范围内。

通过以下非限制性实施例进一步详细地说明本发明。

实施例1

材料和方法

法裔加拿大人患者(蒙特利尔组)

此研究由圣贾斯汀大学医院(TheSainte-JustineUniversityHospital)、蒙特利尔儿童医院(TheMontrealChildren’sHospital)以及圣地兄弟会儿童医院(TheShrinersHospitalforChildren)的机构审查委员会批准。所述研究中招募了三种群体，包括患有AIS的儿童、患有AIS的儿童的家人以及对照受试者。健康儿童在蒙特利尔小学招募并且外伤病例用作对照。所述招募由蒙特利尔英语学校委员会(MontrealEnglishschoolBoard)、富人学校委员会(TheAffluentSchoolBoard)和以上提及的所有机构审查委员会批准。所有患有或未患有AIS的参与者的父母或法定监护人给出它们的书面知情同意书，并且未成年人给出他们的同意。所有参与者由参与此研究的七名矫形外科医师(H.L.、B.P.、C-H.R.、G.G.、J.O.、M.B-B.、S.P.)之一检查。

意大利人患者(米兰组)

在IRCCSIstitutoOrtopedicoGaleazzi(米兰，意大利)招募了总计139名连续AIS患者和103名对照受试者并且代表复制组。所述复制研究由IRSCC和圣贾斯汀大学医院的机构审查委员会批准。所有患者由一个矫形外科医师(M.B-B)检查。

细胞制备和培养

分别如先前所描述(Moreau等,2004)，从椎骨手术中获得的骨标本(根据所进行的外科手术从T3至L4变化)以及从AIS患者和外伤对照病例中的其他解剖部位(胫骨和股骨)获得的骨标本分离成骨细胞。

从自AIS患者和外伤对照患者获得的骨骼肌的活检标本分离成肌细胞。将每个活检标本清除掉剩余脂肪和结缔组织，之后切割成小块。然后将组织块转移至含有0.01％胶原酶的PBS溶液中，并且在37℃下消化45分钟。在用培养基(1:1)稀释之后，将所述溶液在无菌条件下通过45μm的尼龙过滤器过滤，之后在室温下在280xg下离心5分钟。将含有成肌细胞的托盘悬浮于补充有20％胎牛血清(保证合格的FBS；Invitrogen,Burlington,ON,Canada)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的培养基(α-MEM)中。在两周之后，将培养基用补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的新鲜培养基更换并且允许成肌细胞生长直到汇合。

如先前所描述(Akoume等,2010)，从自患者和对照组获得的血液提取外周血单核细胞(PBMC)。

功能分类

如先前所述(Akoume等,2010和Moreau等的WO2010/040234,2010)，通过使用CellKey^TM设备，使用细胞介电谱(CDS)来评价PBMC中的褪黑激素信号传导的功能状态来分类患者。测量反映由配体/受体相互作用引起的细胞变化的阻抗持续15分钟以监测14^-4M碘褪黑激素刺激的细胞反应。根据以下阻抗值范围实现分类：对于FG1，介于0与40欧姆之间；对于FG2，介于40与80欧姆之间；并且对于FG3，介于80与120欧姆之间。从研究中排除所有表现出小于120欧姆的反应程度的对照病例。

G蛋白的功能评价

如先前所述(Akoume等,2010和Moreau等的WO2010/040234,2010)，使用CellKey^TM设备，通过CDS测定评价成骨细胞中的Gi、Gs和Gq蛋白的功能性，并且还通过CDS测定评价来自相同个体的成肌细胞和PBMC中的Gi的功能性。

RNA干扰

所有Gi₁、Gi₂、Gi₃、Gs和乱序siRNA获自Ambion(AmbionUSA)。用于基因沉默的序列在以下表II中示出。根据制造商的说明书，使用LipofectamineRNAiMAX^TM试剂(Invitrogen)，在不含血清的培养基中瞬时转染来自对照受试者和AIS患者的成骨细胞，并且在转染后第48小时进行功能实验。通过定量实时PCR(qPCR)评价基因敲低。

表II：Gi₁、Gi₂、Gi₃、Gs的SiRNA序列

定量实时PCR

使用TRIzol^TM试剂(Invitrogen)根据制造商的方案从成骨细胞分离RNA。使用Tetro^TMcDNA合成试剂盒(Bioline)将总RNA(1μg)逆转录成cDNA。在cDNA合成之后，使用含有QuantiTect^TMSYBRGreenPCR主混合物(QIAGEN,Ontario,Canada)的PCR主混合物进行qPCR。使用Stratagene^TMMx3000P(AgilentTechnologies,LaJolla,CA)评定转录物表达并且使用β-肌动蛋白作为内部对照根据ΔΔCT方法进行计算。用于鉴别目标基因的人mRNA的正向引物和反向引物的序列在表III中示出。

表III：正向序列和反向序列的列表

成骨细胞中的G蛋白表达

使用标准蛋白质印迹技术测定Gi蛋白同种型和Gs蛋白的表达水平。简言之，将来自AIS患者和外伤对照病例的成骨细胞溶解于添加5mMNaVO₄和蛋白酶抑制剂混合物(RochemolecularBiochemicals,Mannheim,Germany)的RIPA缓冲液(25mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)。用特异性地针对Gi₁、Gi₂、Gi₃或Gs(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)的第一抗体和过氧化物酶缀合的第二抗体进行免疫印迹。然后使用SuperSignal^TM化学发光底物(Pierce,Rockford,IL)可视化条带。

评定成骨细胞中的Gi蛋白同种型的磷酸化

进行对比研究以用免疫沉淀的蛋白质使用同种型特异性抗体且随后用磷酸-丝氨酸/苏氨酸特异性抗体(SantaCruzBiotechnology)探测磷酸化的水平来检查磷酸化的水平且鉴别磷酸化的Gi同种型。将全细胞蛋白质(1mg)与抗Gi₁、抗Gi₂或抗Gi₃(SantaCruzBiotechnology)加用于免疫沉淀(IP)的蛋白质G珠粒在4℃下孵育过夜。在免疫沉淀之后将纯化的蛋白质负载在10％凝胶上，然后通过转移至硝酸纤维素膜和5％BSA封闭进行加工。将膜在4℃下暴露于磷酸-丝氨酸/苏氨酸特异性抗体过夜，并且随后在室温下用第二抗体处理1小时。使用SuperSignalcheminescence^TM可视化条带，并且通过光密度扫描定量。

统计分析

数据被呈现为平均值±SE，并且使用GraphPad^TMPrism4.0软件通过ANOVA或学生t检验对所述数据进行分析。使用单向ANOVA、接着使用邓尼特(Dunnett)事后检验进行平均值的多重比较。仅P值<0.05被认为是显著的。

法裔加拿大人组和意大利人组的人口统计特征和临床特征。法裔加拿大人组由956名连续(即无选择：已经接受参与所述研究的前956受试者)患有AIS的青少年和无脊柱侧凸家族病史的240名年龄匹配的对照组成。在所有对照受试者中证实不存在脊柱畸形，而总计162名AIS患者表现出大于45°的弯曲且794名AIS患者具有介于10°与44°之间的弯曲。在意大利人组中，中度弯曲(科布角10°-44°)在61名AIS患者中明显并且严重弯曲(科布角>45°)在78名AIS患者中明显。在加拿大人组和意大利人组中所有AIS患者都是与对照受试者年龄匹配的(参见以下表IV)。

表IV：AIS和健康对照受试者的人口统计数据

实施例2

根据其功能分类的AIS患者的临床结果

将患者根据其PBMC对碘褪黑激素刺激的反应程度来进行分类，如实施例1中所指示。在来自加拿大人组的956名AIS患者中，243名被分类在功能组1(FG1)中，353名被分类在功能组2(FG2)中并且360名被分类在功能组3(FG3)中。所有三个功能组的流行率在低至中度病例(科布角10°-44°)中是可比较的。然而，FG2在严重病例(科布角>45°)中最显著，相较于FG3和FG1分别31％和13％，具有56％的比例。参见以下表V。

在意大利人组中观察到类似的分布概况，在意大利人组中61％的FG2、36％的FG3和3％的FG1AIS患者需要外科手术。总的来说，这些结果加强了以下观点：临床结果在AIS患者之间变化，并且表明严重进展的风险对于FG2而言较高，对于FG3而言中等并且对于FG1而言较低。参见以下表VI。

表V：被分类为功能组的AIS患者的临床数据

表VI：被分类为功能组的AIS患者的临床数据

实施例3

每个功能组代表潜在遗传性状

因为一直声称AIS的遗传或基因基础(Riseborough和Wynne-Davies,1973)；(Blank等,1999)；(Roach,1999)，所以测试了以下可能性：表征每个功能组的生物缺陷可以是遗传条件。为此目的，检查了来自6个不相关的家族的25个个体。谱系在图1中示出。每个家族中至少两个个体受影响。分类已经揭示所有受影响的家族成员属于同一功能组并且因此展示类似的生物缺陷(图2)。然而，弯曲的模式和严重程度两者都不是组特异性的(图2)。这表明每个功能组代表独立于弯曲类型和脊柱畸形幅度在家族内共分离的生物内在表型。

实施例4

褪黑激素受体对其激动剂的亲和力在功能组之间是类似的

测试AIS中的褪黑激素信号传导功能障碍是否是由于影响褪黑激素受体/Gi蛋白偶联的变化所致。首先检查褪黑激素对其受体的亲和力是否在AIS患者组之间变化。为此目的，使用来自对照受试者的成骨细胞产生了褪黑激素的浓度反应曲线，并且与每种生物内在表型的AIS患者的成骨细胞进行了比较。如图3A中所示，褪黑激素在所有对照和AIS组中引起反应的浓度依赖性增加，在1μM达到稳定，其中对照组中具有较高幅度，并且三个AIS组内具有较低但处于不同程度。从最高至最低反应的最大反应的数量级是对照组、FG3、FG2和FG1。尽管组之间的最大反应的这种明显差异，但在对照和AIS组中在类似浓度下观察到半数最大反应。这些观察结果表明褪黑激素受体对其激动剂的亲和力在AIS中保留。

实施例5

响应于不同激动剂，褪黑激素受体的活性在对照受试者与AIS患者之间是可比较的

然后通过测试三种激动剂检查以下可能性：褪黑激素受体活性的变化具有不同功效来活化褪黑激素受体。将来自对照受试者和每个功能组的AIS患者的成骨细胞中在其最大浓度(10μM)下产生的反应进行比较。图3B中所示的结果显示三种激动剂(褪黑激素、碘褪黑激素和苯基褪黑激素)在来自对照受试者和AIS受试者的成骨细胞中引起不同程度的反应。相较于对照组，对每种激动剂的反应在所有AIS组中较低。然而，在每个组中由于AIS所致的幅度和降低反映了激动剂的功效，激动剂效力的顺序是苯基褪黑激素>碘褪黑激素>褪黑激素，如先前由其他研究者使用不同方法所报道(Nonno等,1999)。这表明褪黑激素受体的活性在对照受试者与AIS患者之间是可比较的并且突出缺陷在褪黑激素受体之外。

实施例6

激动剂/受体复合物活化Gi蛋白的能力在AIS患者中对比对照中降低

测试了以下可能性：褪黑激素信号传导的缺陷可能与激动剂/受体复合物活化Gi蛋白的能力降低有关。G蛋白拮抗剂GPAnt-2(一种疏水性肽)已经显示通过与活化的受体竞争与G蛋白相互作用而抑制受体/Gi蛋白偶联(Mukai等,1992)。图3C中所示的结果显示GPAnt-2在对照组和AIS功能组中以浓度依赖性方式抑制对褪黑激素刺激的反应。在最大浓度下，降低的程度在所有组中是类似的，但在次最大浓度下，模式是明显不同的。所有三个AIS功能组的浓度反应曲线相较于对照组的浓度反应曲线表现出向左位移，并且当与对照相比时，IC50值在AIS组之间显著降低。考虑到GPAnt-2与不同G蛋白上的受体竞争，通过将成骨细胞与增加浓度的百日咳毒素(PTX)一起孵育进一步选择性地降低Gi蛋白的量。据发现PTX处理降低FG2和FG3成骨细胞中对褪黑激素的细胞反应，从而表现出与用GPAnt-2获得的模式类似的模式。相比之下，PTX处理在最大浓度下增强FG1成骨细胞中对褪黑激素的反应(图3D)。这些数据表明AIS中降低的褪黑激素信号传导最可能是由于Gi蛋白对褪黑激素受体的敏感性降低，并且指示褪黑激素受体也可与分类在FG1中的AIS患者中的Gs相互作用。

实施例7

AIS受试者具有Gi蛋白介导的受体信号传导的系统性和广泛受损

为了测定在AIS成骨细胞中测量的通过Gi蛋白信号传导功能障碍是否限于褪黑激素受体，用选择性地活化与Gi蛋白偶联的其他受体的不同合成化合物进行了对比研究。使用五种化合物(包括爱帕林-17、PB554马来酸盐、溶血磷脂酸(LPA)、UK14304以及生长激素抑制素)以分别活化内源性APJ受体、血清素5-HT_1A受体、LPA₁受体、α2-肾上腺素能受体以及生长激素抑制素(sst)受体。如在图4中所示，在所有对照组和AIS功能组中所有测试的激动剂引起细胞反应的浓度依赖性增加，在同一浓度下达到稳定。在每种情况下，当与对照组相比时，信号传导反应的幅度在所有AIS组中较低，但EC50值在所有组中几乎是相同的，从而指示所有测试的激动剂对其对应受体的亲和力在AIS中未受影响(图4G)。令人感兴趣地，用所测试的五种合成激动剂中的任一种产生的GPAnt-2(图5)或PTX(图6)的抑制曲线揭示与用褪黑激素获得的曲线模式类似的曲线模式。在每种情况下，当与对照组相比时，GPAnt-2降低AIS组中的IC50值(图5G)。当将GPAnt-2与肥大脱粒肽-7相比较时也观察到类似的反应(图5F)，肥大脱粒肽-7通过模拟激动剂活化的受体直接活化Gi蛋白(Higashijima等,1990)。此外，在用高浓度的PTX处理之后对肥大脱粒肽的反应几乎在所有AIS组和对照组中消除(图6F)，从而指向在Gi蛋白水平下的异常。总的来说，这些数据加强了以下概念：激动剂/受体相互作用在AIS中未受影响，并且揭示AIS患者可用活化Gi蛋白介导的信号传导途径的任何化合物在功能上分层。

将该分析延伸至来自相同组的对照和AIS患者的其他细胞类型，即骨骼肌成肌细胞和外周血单核细胞(PBMC)。在这些细胞类型中获得与针对所测试的每种激动剂在成骨细胞中获得的反应模式类似的反应模式(图7和8)。总的来说，这些发现强烈指示Gi蛋白介导的受体信号传导的系统性和广泛受损。

实施例8

Gi蛋白功能的降低选择性地影响AIS中的Gs蛋白功能

将来自对照和AIS患者的成骨细胞针对其对异丙肾上腺素和去氨加压素的反应进行筛选，所述异丙肾上腺素和去氨加压素分别活化β-肾上腺素能受体和血管加压素受体(V2)。两种受体均通过Gs蛋白介导信号转导。图9中所示的结果显示当与对照成骨细胞相比时，由两种激动剂引发的细胞反应在来自AIS患者的成骨细胞中显著增强。对于每个功能组，对Gs刺激的反应增加相反地反映在Gi蛋白刺激之后诱导的降低的反应，从而表明Gi蛋白与Gs蛋白之间的功能不均衡。为了进一步说明这种差异，将对褪黑激素和异丙肾上腺素的反应的值报道为对Gi蛋白和Gs蛋白刺激的反应之间的差异(Δ)。如在图9C中所示，对Gi刺激的反应在对照组中以浓度依赖性方式显著(即，大于约1.5的Gi/Gs比率)。在FG3组中观察到类似的模式(即，大于约1.5的Gi/Gs比率)，而在FG2组中未观察到明显不均衡(即，介于约0.5与1.5之间的Gi/Gs比)。相比之下，FG1组表现出对Gs刺激的反应的显著性(剂，小于约0.5的Gi/Gs比率)。这些数据指示Gs蛋白在AIS中根据Gi蛋白功能的畸变程度在功能上受影响，从而揭示对每个AIS组特异的Gi与Gs蛋白功能之间的不均衡概况。

所呈现的结果揭示在AIS中降低的Gi蛋白功能与增加的Gs蛋白功能之间的关系。Gi于Gs蛋白之间的功能不均衡概况是对于每个AIS组特异的，从而指示AIS能够关于对Gi和Gs蛋白刺激的反应之间的不均衡概况清楚地分离。这种方法有利地消除使用对照受试者的必要性并且允许随时间推移监测患者反应。

然后研究Gq蛋白的功能状态。将成骨细胞用缓激肽和内皮素-1刺激。两种激动剂在源自对照受试者和AIS患者的成骨细胞中在不同浓度下引发类似的反应，从而证明通过Gq蛋白受体信号传导在AIS中在很大程度上仍是完整的(图9D-9E)。似乎AIS中Gi蛋白功能的降低排他性地影响Gs蛋白功能。

实施例9

表征三种AIS生物内在表型的反应程度的差异不是由于Gi蛋白的差异表达所致

Gi蛋白的三种同种型(称为Gi₁、Gi₂和Gi₃)共有相同特性并且与Gi蛋白相互作用的大多数膜性受体能够经由这些同种型中的每种引发信号。然而，反应的幅度取决于Gi同种型介导信号转导的能力，而一些Gi同种型似乎比其他同种型更有效。

测试了表征三种AIS生物内在表型的反应程度的差异是否是由于Gi蛋白同种型的差异改变所致。首先检查所观察到的功能变化是否是由于G蛋白表达的变化所致。qPCR分析揭示在对照与AIS成骨细胞之间无Gi蛋白的任何同种型(Gi₁、Gi₂和Gi₃)和Gs蛋白的表达的显著变化(图10A)。假定不同同种型的PCR扩增是同等有效的，似乎Gi₁和Gi₂是对照和AIS成骨细胞中的Gi蛋白的最丰富的同种型，而Gi₃同种型的表达水平丰度较低且与Gs蛋白的表达水平类似。在蛋白质水平下，这些同种型还揭示在对照与任何AIS组之间无差异(图10B)。这些结果指示在来自AIS患者的成骨细胞中观察到的功能变化不可能是由于Gi蛋白同种型的表达水平的畸变所致。

实施例10

差异磷酸化模式影响AIS功能组中的Gi蛋白同种型

Gi蛋白的活性通过磷酸化精确地调控，磷酸化是限制其转导信号的能力的一个过程(Casey等,1995)；(Katada等,1985)；(Kozasa和Gilman,1996)；(Lounsbury等,1991)；(Lounsbury等,1993)；(Morishita等,1995)；(Morris等,1995)；(Yatomi等,1992)。先前报道了来自AIS患者的成骨细胞中的Gi蛋白的三种同种型Gi₁、Gi₂和Gi₃的丝氨酸残基的磷酸化增加(Moreau等,2004)。为了检查在AIS中发生的Gi信号传导的功能破坏是否可能与Gi磷酸化同种型的差异模式相关，将来自对照受试者和来自每种生物内在表型的AIS患者的Gi同种型免疫沉淀且用抗磷酸-丝氨酸抗体探测(图11)。与对照组相比，仅Gi₂和Gi₃同种型是在FG3组中磷酸化的，而仅Gi₁和Gi₂是在FG2组中磷酸化的。然而，三种同种型Gi₁、Gi₂和Gi₃是在FG1组中磷酸化的。这些数据提供AIS中Gi同种型的磷酸化模式与Gi蛋白的异源缺陷之间的关系的证据，并且指示AIS组之间Gi蛋白同种型的功能状态的差异。

实施例11

差异磷酸化模式影响AIS功能组中的Gi蛋白同种型

在用褪黑激素、LPA或生长激素抑制素刺激成骨细胞之前，使用小干扰RNA(siRNA)方法单独地或组合地敲低Gi₁、Gi₂、Gi₃和Gs的表达来测试每个AIS组中负责残余反应的Gi同种型的身份。每种基因的沉默使来自对照和三个AIS组的成骨细胞中的相应mRNA的表达降低75％-85％(图12E-12H)。在对照组中，当单独转染时对任何所测试的激动剂的反应未受Gi₁、Gi₂、Gi₃siRNA显著影响，但当一起转染时所述反应几乎被消除(图12A)。对每种测试的激动剂的反应在FG2成骨细胞中通过单独沉默Gi₃降低至少75％(图12C)，并且在FG3成骨细胞中通过单独沉默Gi₁降低至少90％(图12D)，从而证实对Gi刺激的残余反应分别是由FG2和FG3组中的Gi₃和Gi₁同种型介导的。在FG1成骨细胞中，在通过siRNA缺失所有Gi同种型之后对每种激动剂的反应被降低50％，并且未受单独Gi同种型的敲低影响(图12B)。相比之下，单独Gs的缺失使FG1AIS组中对任何测试的激动剂的细胞反应降低50％，并且在对照、FG2和FG3AIS组中没有作用。这指示在FG1功能组中对Gi刺激的残余反应是同时偶联至Gs和Gi蛋白的Gi受体的相加作用。

分别检测FG2和FG3组中未磷酸化的Gi₃和Gi₁同种型能够解释当与FG1组相比时它们的更高Gi信号传导活性。然而，当与FG3成骨细胞相比时，FG2成骨细胞表现出弱得多的参与Gi信号传导活性，这可由以下事实来解释：Gi₃同种型在人成骨细胞中丰度较低如实施例9中所展示(图10)。分别选择性缺失FG2和FG3成骨细胞中的Gi₃和Gi₁同种型几乎以与图12中展示的类似方式消除其对三种不同Gi偶联受体的细胞反应，从而进一步证实这两个AIS组中Gi₃和Gi₁同种型的功能状态。试图推测其他Gi同种型的功能损失可由FG2中的Gi₃同种型和FG3组中的Gi₁补偿，这与每个Gi同种型能够部分拯救Gi信号传导一致(Hurst等,2008)。

不受所述假设限制，这些发现连同来自高PTX浓度实验的结果表明涉及FG1成骨细胞中的其他G蛋白的补偿机制。概念上，有可能所有Gi同种型的磷酸化允许或促进FG1成骨细胞中Gs蛋白与Gi偶联受体的偶联。这种可能性由Gs和所有Gi同种型的同时缺失清楚地证明，它们几乎在FG1成骨细胞中完全消除信号传导活性。另一方面，所测试的三种GPCR未活化FG2和FG3成骨细胞中的Gs介导的信号传导，这强烈表明Gs蛋白对这些受体的可及分别受Gi₃和Gi₁同种型限制，所述同种型在这些组中不是磷酸化的。值得注意，单独缺失Gs蛋白不会消除FG1成骨细胞中的信号传导活性，但是事实是所有三种Gi同种型都是磷酸化的，从而表明在AIS功能组间磷酸化的丝氨酸残基的数目和位置的可能不均匀性。可设想与FG2和FG3组中的磷酸化的Gi同种型相反，FG1成骨细胞中的磷酸化的Gi蛋白仍然表现出一些残余活性。

实施例12

促成AIS中的Gi蛋白功能减退的丝氨酸/苏氨酸激酶的鉴别

为了鉴别磷酸化AIS中的Gi同种型的推定丝氨酸/苏氨酸激酶，将对照和AIS成骨细胞用一组丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂进行处理，之后用两种不同激动剂(LPA和生长激素抑制素)刺激它们。值得注意，在对照成骨细胞中由其激动剂经由LPA和生长激素抑制素受体诱导的Gi刺激未受任何激酶抑制剂影响(图13)。相比之下，信号传导反应在FG1成骨细胞中通过显著增加，所述抑制PKC的几种同种型；并且还通过STO-609乙酸盐显著增增加，所述STO-609乙酸盐抑制钙调蛋白激酶的三种同种型(CaMK1、CaMK2、CaMK4)；但未受选择性地抑制CaMK2的KN93影响。然而，两种CaMK抑制剂STO-609乙酸盐和KN93均增加来自FG2组的成骨细胞中的信号传导反应，而在所述AIS组中没有显著作用。FG3成骨细胞中的细胞反应未通过抑制PKC和CaMK得到改进。相比之下，用D4476抑制酪蛋白激酶2(CK2)增加来自FG1和FG3组的成骨细胞中的反应，但在FG2成骨细胞中未增加，同时用H89抑制PKA增加所有AIS组中的信号传导反应。

表达分析已经揭示当与对照组相比时，FG1成骨细胞中的PKCε、PKCη和CaMK1-δ的表达水平的选择性增加(图14)。FG2和FG3成骨细胞仅表现出PKAγ2的高表达水平。相比之下，CaMK2n1(一种天然CaMK2抑制剂)在FG2成骨细胞中显著减少，从而表明CaMK2活性的调控系统在所述AIS组中受影响(图14)。其他分析的激酶的表达水平未显示任何显著选择性增加或减少(图15-16)。总的来说，这些结果显示AIS中的Gi蛋白同种型的选择性功能改变涉及不同激酶。

权利要求的范围不应受实施例中阐明的优选实施方案的限制，而是应给予总体上与说明书一致的最广泛的解释。

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Claims

1.一种分层患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)或处于发展青少年特发性脊柱侧凸的风险的受试者的方法，所述方法包括：

(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；

(ii)从所述细胞样品检测或测定所述受试者的Giα蛋白丝氨酸磷酸化概况和/或对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的不均衡程度；以及

(iii)基于所述受试者的Giα蛋白丝氨酸磷酸化概况和/或对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的所述不均衡程度将所述受试者分层为临床上有用的AIS亚类。

2.如权利要求1所述的方法，其中(ii)包括：

(a)检测或测定所述细胞样品中的Giα1的丝氨酸磷酸化；

(b)检测或测定所述细胞样品中的Giα3的丝氨酸磷酸化；

(c)检测或测定所述细胞样品中对Giα蛋白刺激的所述反应与对Gsα蛋白刺激的所述反应之间的比率(Giα/Gsα反应比率)或差异(Δ)；或

(d)(a)至(c)的任何组合。

3.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括将所述受试者分层为属于：

(1)第一AIS亚类，其特征在于：

(a)丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平升高；和/或

(b)在约0.5以下的Giα/Gsα反应比率；

(2)第二AIS亚类，其特征在于：

(a)丝氨酸磷酸化的Giα1的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；和/或

(b)介于约0.5与1.5之间的Giα/Gsα反应比率；或

(3)第三AIS亚类，其特征在于：

(a)丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升高；和/或

(b)在约1.5以上的Giα/Gsα反应比率。

4.如权利要求2或3所述的方法，还包括检测或测定所述细胞样品中的Giα2蛋白的丝氨酸磷酸化，其中相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平，检测到丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平升高。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中：

(1)属于所述第一AIS亚类的受试者具有低的严重AIS进展风险；

(2)属于所述第二AIS亚类的受试者具有高的严重AIS进展风险；以及

(3)属于所述第三AIS亚类的受试者具有中等严重AIS进展风险。

6.一种预测患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的方法，所述方法包括：

(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；

(ii)检测或测定：

(a)所述细胞样品中的Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化；

(b)所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应；和/或

(c)所述细胞样品中对激动剂的GiPCR反应；

(iii)当：(a)所述细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白未被检测到或相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；

(b)所述细胞样品中对Giα蛋白刺激的所述反应与对Gsα蛋白刺激的所述反应的比率(Giα/Gsα反应比率)介于约0.5与1.5之间；和/或

(c)检测到所述细胞样品中的GiPCR反应比对照样品中的GiPCR反应低约40％至60％时，确定所述受试者处于发展严重脊柱侧凸的风险。

7.如权利要求6所述的方法，其中(ii)还包括检测或测定所述细胞样品中的Giα1和/或Giα2蛋白的丝氨酸磷酸化，其中当所述受试者的丝氨酸磷酸化的Giα1或Giα2蛋白的所述水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1或Giα2蛋白的水平升高时，所述受试者处于发展严重脊柱侧凸的风险。

8.一种预测患有脊柱侧凸的受试者对装矫正架治疗的反应性的方法，所述方法包括：

(i)提供从所述受试者分离的细胞样品；以及

(ii)检测或测定：

(a)所述细胞样品中的Giα1的丝氨酸磷酸化；

(b)所述细胞样品中的Giα3的丝氨酸磷酸化；

(c)所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应；或

(d)(a)至(c)的任何组合；

(iii)当：(a)检测到丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升高；和/或

(b)所述细胞样品中对Giα蛋白刺激的所述反应与对Gsα蛋白刺激的所述反应的比率(Giα/Gsα反应比率)在约1.5以上时，确定所述受试者可能对装矫正架治疗有反应。

9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。

11.如权利要求3至10中任一项所述的方法，其是在体外。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞样品包含成骨细胞、成肌细胞和/或外周血单核细胞(PBMC)。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞样品包含PBMC。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述PBMC包含淋巴细胞。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述检测或测定所述细胞样品中的Giα1和/或Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化包括从所述细胞样品分离Giα1和/或Giα3蛋白以及使所述分离的Giα1和/或Giα3蛋白与抗磷酸丝氨酸抗体相接触。

16.一种增加患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者的细胞中的GiPCR信号传导的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：

(i)PKA的抑制剂；

(ii)(a)PKC的抑制剂；(b)CaMK1或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂；或(d)(a)至(c)中的至少两者的任何组合，如果所述受试者的细胞具有的丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Gαi1、Gαi2和Gαi3蛋白的水平升高；

(iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞具有的丝氨酸磷酸化的Gαi3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Gαi3蛋白的水平未升高；或

(iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞具有的丝氨酸磷酸化的Gαi1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Gαi1蛋白的水平未升高，

由此所述GiPCR信号传导在所述受试者的细胞中增加。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述PKA的抑制剂是PKA-γ2的抑制剂。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述PKA的抑制剂是H89。

19.如权利要求16所述的方法，其中所述PKC的抑制剂是PKC-η或PKC-ε的抑制剂。

20.如权利要求16所述的方法，其中所述PKC的抑制剂是

21.如权利要求16所述的方法，其中所述CaMK1的抑制剂是CaMk1δ。

22.如权利要求16所述的方法，其中所述CaMK1或CaMK4的抑制剂是STO609。

23.如权利要求16所述的方法，其中所述CK的抑制剂是CK2的抑制剂。

24.如权利要求16所述的方法，其中所述CK的抑制剂是D4476。

25.如权利要求16所述的方法，其中所述CaMK2的抑制剂是STO609或KN93。

26.如权利要求16至25中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。

27.如权利要求16至25中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者可能发展脊柱侧凸。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。

29.如权利要求16至28中任一项所述的方法，其是在体外。

30.如权利要求16至25中任一项所定义的抑制剂的用途，其用于增加患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者的细胞中的GiPCR信号传导或用于制备用以增加患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者的细胞中的GiPCR信号传导的药剂。

31.如权利要求30所述的用途，其中所述有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。

32.如权利要求30所述的用途，其中所述有需要的受试者可能发展脊柱侧凸。

33.如权利要求31或32所述的用途，其中所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。

34.一种用于分层患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)或处于发展青少年特发性脊柱侧凸的风险的受试者的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)用于检测来自所述受试者的细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平的配体；

(b)用于检测来自所述受试者的细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平的配体；

(c)用于检测所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的配体；或

(d)(a)至(c)的任何组合。

35.如权利要求34所述的试剂盒，还包括用于检测丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平的配体。

36.一种用于预测患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)用于检测来自所述受试者的细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平的配体；

(b)用于检测来自所述受试者的细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应的配体；或

(c)(a)与(b)的组合。

37.一种用于增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信号传导的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)PKA的抑制剂；

(b)PKC的抑制剂；

(c)CaMK1或4的抑制剂；

(d)CK的抑制剂；

(e)CaMK2的抑制剂；或

(f)(a)至(e)中的至少两者的任何组合。

38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述PKA的抑制剂是PKA-γ2的抑制剂。

39.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述PKA的抑制剂是H89。

40.如权利要求37至39中任一项所述的试剂盒，其中所述PKC的抑制剂是PKC-η或PKC-ε的抑制剂。

41.如权利要求37至39中任一项所述的试剂盒，其中所述PKC的抑制剂是

42.如权利要求37至39中任一项所述的试剂盒，其中所述CaMK1的抑制剂是CaMk1δ。

43.如权利要求37至39中任一项所述的试剂盒，其中所述CaMK1或CaMK4的抑制剂是STO609。

44.如权利要求37至43中任一项所述的试剂盒，其中所述CK的抑制剂是CK2的抑制剂。

45.如权利要求37至43中任一项所述的试剂盒，其中所述CK的抑制剂是D4476。

46.如权利要求37至45中任一项所述的试剂盒，其中所述CaMK2的抑制剂是STO609或KN93。

47.一种选择作为治疗或预防脊柱侧凸的潜在候选物的药剂的方法，所述方法包括使候选药剂与表达(a)PKA、(b)PKC、(c)CaMK1、(d)CaMK4、(e)CK或(f)CaMK2的细胞相接触，并且当(a)至(f)中的任一者的表达或活性降低时，选择所述候选药剂。

48.如权利要求47所述的方法，其中PKA是PKA-γ2。

49.如权利要求47所述的方法，其中PKC是PKC-η或PKC-ε。

50.如权利要求47所述的方法，其中CaMK1是CaMK1δ。

51.如权利要求47所述的方法，其中所述CK是CK2。