CN105358150A - 用于心脏病的bet抑制疗法 - Google Patents

Abstract

本发明提供使用包括JQ1的BET抑制剂治疗心脏病的方法。本文中描述治疗心脏肥大的方法、治疗不是由炎症引起的心脏衰竭的方法、治疗心肌梗塞的方法、心脏保护的方法以及抑制再狭窄的方法。所述方法涉及使用有效量的BET抑制剂，如JQ1。

Description

用于心脏病的BET抑制疗法

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年5月28日提交的美国临时申请第61/828,166号和2014年1月24日提交的美国临时申请第61/931,062号的权益，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

联邦政府资助的研究

本发明在政府支持下根据美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)授权号R01DK093821进行。因此，美国政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

心脏衰竭(HF)是现代社会中死亡率、住院以及医疗花费的主要原因。当心脏不能够在足以满足组织需求的水平下维持器官灌注时这种疾病产生，并且引起疲劳、呼吸困难、多器官功能障碍以及早逝。用于罹患HF的个体的现有药物疗法，如β肾上腺素能受体拮抗剂和肾素-血管紧张素系统的抑制剂，一般靶向神经激素信号传导路径。虽然这类疗法已经改进HF患者的存活率，但剩余发病率和死亡率仍然不可接受地高。鉴于这一主要未满足的临床需要，参与HF发病机制的新颖信号传导路径的说明有希望鉴定用于这一高度盛行和致命疾病的新颖疗法。

发明内容

本发明在一些方面中关于如下发现：BET(含溴结构域的识别蛋白的溴结构域和超末端家族)是在心脏中经由其共活化广泛但限定应激诱发转录程序的能力而病理性心脏重塑的重要效应子。此外，本申请的发明人已经发现如JQ1的BET抑制剂可以出人意料地抑制与心脏肥大和血管损伤有关的肌肉细胞生长。因此，本发明的一些方面涉及一种治疗心肌病的方法，其通过向需要这类治疗的个体投与有效治疗心肌病的量的本发明化合物，例如JQ1。

在一些实施例中，个体无心脏衰竭。在一些实施例中，个体无阻塞性冠状动脉疾病的症状。在一些实施例中，个体不进行动脉粥样硬化的治疗。在一些实施例中，个体不进行阻塞性冠状动脉疾病的治疗，如通过血管造影片显示证明。在一些实施例中，个体无心脏衰竭或动脉粥样硬化并且未从心肌梗塞恢复。在一些实施例中，个体正接受降低血压的疗法。在一些实施例中，心肌病是由于慢性高血压、心脏瓣膜病(包括主动脉瓣膜狭窄、主动脉瓣膜关闭不全、二尖瓣关闭不全)、围生期心肌病或因基因突变所致的心肌病(包括家族性肥大型心肌病和家族性扩张型心肌病)。在一些实施例中，本发明化合物是JQ1。在一些实施例中，心肌病是心脏肥大。

根据本发明的一个方面，提供一种治疗不是由炎症引起的心脏衰竭的方法。所述方法包含向需要这类治疗的个体投与有效治疗心脏衰竭的量的本发明化合物，例如JQ1。在一些实施例中，个体无阻塞性冠状动脉疾病，如通过血管造影片显示证明。在一些实施例中，个体未从心肌梗塞恢复。在一些实施例中，心脏衰竭是由于：

(i)无阻塞性冠状动脉疾病迹象的射血分数正常性心脏衰竭(HFpEF)；

(ii)因药物(包括抗癌剂和滥用药物)毒性所致的心脏衰竭；

(iii)由乙醇滥用所引起的心脏衰竭；

(iv)因慢性心动过速(快速心跳速率)所致的心脏衰竭；

(v)因内分泌异常(过多甲状腺激素、生长激素、糖尿病、嗜铬细胞瘤)所致的心脏衰竭；

(vi)高输出心脏衰竭(包括由贫血或周围动静脉分流所引起的心脏衰竭)；

(vii)由营养缺乏(包括硫胺、硒、钙以及镁缺乏)所引起的心脏衰竭；

(viii)因病毒感染(包括HIV)所致的心脏衰竭；或

(ix)因先天性心脏畸形所致的心脏衰竭。

在一些实施例中，个体正接受降低血压的疗法。在一些实施例中，本发明化合物是JQ1。

根据本发明的一些方面，提供一种治疗心肌梗塞的方法。所述方法涉及向需要这类治疗的个体投与呈有效治疗心肌梗塞的量的本发明化合物(例如JQ1)，其中本发明化合物(例如JQ1)投与不早于心肌梗塞之后5天开始。在一些实施例中，本发明化合物(例如JQ1)投与不早于心肌梗塞之后6天开始。在一些实施例中，本发明化合物(例如JQ1)投与不早于心肌梗塞之后7天开始。在一些实施例中，个体无动脉粥样硬化，如通过血管造影片显示证明。在一些实施例中，个体无心脏衰竭。在一些实施例中，本发明化合物是JQ1。

根据本发明的一些方面，提供一种心脏保护的方法。所述方法包含向接受对心脏有毒的疗法的个体投与呈有效抑制这类疗法的心脏毒性的量的BET抑制剂。在一些实施例中，疗法是抗癌疗法。在一些实施例中，抗癌疗法是化学治疗疗法。在一些实施例中，化学治疗剂是选自由以下组成的群组的抗癌剂：蒽环霉素、曲妥珠单抗、5-氟尿嘧啶、米托蒽醌、太平洋紫杉醇、长春花生物碱、他莫昔芬、环磷酰胺、伊马替尼、曲妥珠单抗、卡培他滨、阿糖胞苷、索拉非尼、舒尼替尼以及贝伐单抗。在一些实施例中，BET抑制剂是JQ1分子。

根据本发明的一些方面，提供一种抑制再狭窄的方法。所述方法包含向经历血管成形术和/或接受支架的个体投与呈有效抑制再狭窄的量的BET抑制剂。在一些实施例中，BET抑制剂在狭窄部位局部投与。在一些实施例中，BET抑制剂经由导管投与。在一些实施例中，BET抑制剂作为支架上的涂层的要素投与。在一些实施例中，BET抑制剂是JQ1分子。

本发明的一些方面提供一种预防狭窄或再狭窄的支架，所述支架包括当支架位于血管处时将药剂局部递送到血管的涂层，其中改进包含涂层中包括的BET抑制剂。在一些实施例中，BET抑制剂是JQ1分子。

在前述实施例中的任一个中，本发明化合物是本文和以引用的方式并入本文中的WO2011/143669中所描述的式I-XXII的化合物。在一些重要实施例中，本发明化合物是式I-IV的化合物。在优选实施例中，本发明化合物是JQ1。

本发明的限制中的每一个可以包涵本发明的各种实施例。因此，预期涉及任何一种要素或要素的组合的本发明的限制中的每一个可以包含在本发明的每一方面中。本发明在其应用中不限于以下描述中阐述或图式中说明的组件的建造和布置的细节。本发明能够具有其它实施例并且以各种方式实践或进行。此外，本文所用的措词和术语是出于描述的目的并且不应被视为是限制性的。本文中对“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”以及其变化形式的使用意味着包涵其后所列出的项目和其等效物以及额外的项目。

附图说明

图1显示心脏中的BET表达。(A)在(A)NRVM和(B)成年小鼠心脏组织(N＝4)中通过qRT-PCR的指定BET基因的相对表达。相对于Brd2和Brd3，P<0.05。(C)展现NRVM全细胞提取物(左)和成年小鼠和人类心脏组织核蛋白提取物(右)中BRD4的存在的西方印迹。显示微管蛋白和POL2以便内参考。(D)NRVM中针对BRD4、α-辅肌动蛋白、DAPI的免疫荧光染色。合并图像展现核定位的BRD4信号。白色条＝10μM。(E)展示用光密度定量(N＝3)，NRVM中BRD4蛋白质的有效敲低的西方印迹。相对于sh-对照，*P<0.05。(F)用于图2F中的BET抑制剂的化学结构。

图2显示BET溴结构域抑制活体外阻断心肌细胞肥大。(A)(+)-JQ1的化学结构。(B)用心肌细胞面积定量，用或不用JQ1(250nM)和PE(100μM)处理48小时的NRVM的代表图像。α-辅肌动蛋白免疫荧光染色呈绿色；DAPI呈蓝色。相对于DMSO-PE*P<0.05。相对于JQ1-PE**P<0.05。相对于DMSO+PE#P<0.05。(C)用JQ1(500nM)和PE(100μM)处理48h的NRVM(N＝4)中肥大标记基因的qRT-PCR。相对于媒剂，#P<0.05，相对于PE，*P<0.05。(D)用心肌细胞面积定量，经含腺病毒的sh-Brd4或sh-对照(杂乱shRNA)感染、用或不用PE(100μM)处理48小时的NRVM的代表图像。相对于sh-对照*P<0.05。相对于sh-Brd4-PE，**P<0.05。相对于sh-对照+PE，#P<0.05。(E)用JQ1(500nM)和PE(100μM)处理48h的NRVM(N＝4)中肥大标记基因的qRT-PCR。相对于sh-对照，#P<0.05，相对于sh-对照+PE，*P<0.05。(F)用一组结构上不同的BET抑制剂(JQ1、iBET、iBET-151、RVX-208、PF-1；500nM)和PE(100μM)处理48小时的NRVM的细胞面积测量。相对于指定化合物的-PE对照，*P<0.05。相对于媒剂+PE，#P<0.05。白色条＝30μM。NRVM面积定量从自每组3个独立实验合并的N＝150-200个心肌细胞进行。

图3显示基因表达谱分析在心肌细胞肥大期间活体外限定BET调节的转录程序。(A)差异表达的转录物的所选热图。NRVM用500nMJQ1和100μMPE处理。(B)差异表达的转录物的整体分析，其显示随时间通过PE的基因诱导和PE介导的基因诱导通过JQ1的渐进逆转。(C)显示个别PE诱导的转录物(伴随JQ1对相同转录物的抑制)的火山图(Volcanoplot)。标注Il6的位置。(D)用PE诱导并且通过JQ1逆转的基因的小组的功能路径分析(DAVID)。认为<5％的错误发现率(FDR)是统计显著的。(E)来自用JQ1(500nM)和PE(100μM)处理指定时间点的NRVM(N＝4)的Il6的qRT-PCR。相对于媒剂，*P<0.05，相对于PE，#P<0.05。(F)针对用JQ1(500nM)和PE(100μM)处理90min的NRVM中的PolII和BRD4的ChIP-qPCR。PCR在Il6转录起始位点(TSS)附近进行。-4kb基因座充当非靶向区域(以上描述的PCR引物的位置，N＝3)。相对于媒剂，*P<0.05，相对于PE，#P<0.05。(G)来自用JQ1(500nM)和PE(100μM)处理指定时间点的NRVM(N＝4)的c-myc的qRT-PCR。虽然JQ1抑制Il6诱导，其不抑制c-myc诱导。相对于媒剂，*P<0.05，相对于PE，#P<0.05。

图4显示NRVM中的BET表达不随PE刺激变化。(A)通过qRT-PCR在用PE(100μM)处理指定时间点的NRVM(N＝4)中Brd2-4基因的相对表达。

图5展现用JQ1的BET溴结构域抑制有力地减弱活体内病理性心脏肥大和心脏衰竭。(A)小鼠中TAC和JQ1投与的实验方案。(B)在TAC期间小鼠(N＝7；显示于图6中的假手术组)中的超声心动图参数。LVIDd是左心室舒张末期面积，(IVS+PW)d是舒张末期时室间隔和LV后壁的总厚度。相对于媒剂TAC，*P<0.05。经受4周TAC的小鼠的(C)代表性M-模式追踪和(D)舒张末期2D图像。白色条＝2mm。(E)在4周TAC之后小鼠(N＝7TAC，N＝5假手术组)的心脏重量/体重(HW/BW)和(F)肺重量/体重(LW/BW)比率。相对于假手术媒剂，*P<0.05。相对于TAC媒剂，#P<0.05。相对于假手术JQ1，**P<0.05。(G)来自小鼠的新切除完整心脏的代表性照片。黑色条＝3mm。(H)来自小鼠(N＝5-7)的心脏的指定基因的qRT-PCR。相对于假手术媒剂，*P<0.05。相对于TAC媒剂，#P<0.05。(I)JQ1阻断活体内PE诱导的心脏肥大而不损害LV收缩功能。小鼠(N＝7PE，N＝5生理盐水)中PE输注(75mg/kg/天，经由皮下渗透小型泵)和JQ1投与的实验方案。还参见图6。

图6显示JQ1在小鼠中很好地耐受并且不影响血压或经主动脉梯度。(A)相对于媒剂，小鼠被给予JQ1(腹膜内50毫克/千克/天)17天。使小鼠经受踏车运动(15m/min，无倾斜)并且测量筋疲力尽的时间(N＝6)。NS表示统计非显著性。(B)假手术处理小鼠(N＝5)中的超声心动图参数。(C)用JQ1(腹膜内50毫克/千克/天)相对于媒剂处理17天的小鼠(N＝5)的收缩血压。(D)在TAC之后7天小鼠(N＝4)的主动脉弓的手术缩窄区段中的压力梯度。

图7显示活体内BET溴结构域抑制阻断心脏衰竭的主要组织病理学特征的发展。(A)心脏部分的麦胚凝集素染色和心肌细胞面积定量。条＝30μm。(B)心脏部分的梅森氏三色染色法染色(Masson'sTrichromestaining)与纤维化区域的定量。对于低倍放大图像(上方)条＝400μm，并且对于高倍放大图像(下方)，40μm。(C)心脏部分的TUNEL染色与以下TUNEL-阳性细胞核的定量。条＝20μm。(D)心脏部分的PECAM-1免疫荧光染色与心肌毛细管密度的定量。条＝30μm。对于图A到D：N＝3-4，在4周时间点自小鼠获得的组织，相对于假手术媒剂*P<0.05，相对于TAC媒剂#P<0.05。

图8显示在TAC期间BET共活化心脏中的广泛但特异性转录程序。(A)微阵列GEP实验的方案。(B)基因表达谱的无监测分级聚类。(C)所选基因的热图。(D)显示基因簇的暂时演变的GEDI曲线。(E)个别转录物的火山图。用TAC诱导的基因经JQ1抑制。(F)用TAC诱导并且通过JQ1逆转的基因的小组的功能路径分析(DAVID)。认为<5％的错误发现率(FDR)是统计显著的。(G)针对活体内结点促肥大转录效应子的心肌细胞特异性活化驱动的三种非依赖性GEP的TAC-媒剂和TAC-JQ1的GSEA：钙调神经磷酸酶-NFAT(由组成性活性钙调神经磷酸酶A转基因驱动(布塞特(Bousette)等人,2010))、IKK2转基因驱动的NFκB(迈尔(Maier)等人,2012)以及转基因GATA4过度表达(海内克(Heineke)等人,2007)。FWERP<0.250被认为表示统计显著富集。数据代表所有3个时间点并且代表曲线针对28天时间点显示。还参见图9。

图9显示在TAC期间小鼠心脏的基因表达谱。(A)通过qRT-PCR在小鼠心脏中在假手术/TAC之后在指定时间点Brd2-4的相对表达(N＝5-7)。(B)火山图(C)显示用TAC-媒剂c-myc标靶上调但不与JQ1效果重叠的GSEA。(D)来自小鼠心脏在指定时间点的qRT-PCR(N＝5-7)显示JQ1不抑制c-myc诱导。相对于假手术媒剂，*P<0.05。相对于假手术JQ1，#P<0.05。

图10显示TAC模型中的BET调节基因与人类心脏衰竭有关。(A)维恩图，其显示针对在人类晚期非缺血性和缺血性心脏衰竭中上调的基因表达谱的JQ1抑制的TAC诱导性基因的相交(海能哈利(Hannenhalli)等人,2006)。小鼠TAC模型中BET的标靶以统计显著方式与在人类心脏衰竭中诱导的基因组重叠((χ²<2x10^-14)。(B)列出填充所有3组的相交点的基因名称。

图11A显示研究设计。使用横向主动脉缩窄(TAC)使成年小鼠经受压力超负荷。JQ1或媒剂在TAC后18天开始，这是已经产生显著病理学时的时间点。甚至当在已经产生显著心脏病理学之后投与时，JQ1显著减弱(B)LV收缩功能障碍、(C)LV腔扩张、(D)LV壁增厚以及(E)心肥大的进程。(每组N＝6-12)。这一数据证实了BET溴结构域抑制在与人类中的预先确立的心脏病高度有关的实验设置中的功效。

图12A显示研究设计。使小鼠经受永久性近端左前降支动脉(LAD)结扎以产生大前壁心肌梗塞(MI)。JQ1或媒剂以指定剂量(25毫克/千克/天或50毫克/千克/天，腹膜内注射)在手术后第5天开始。用这一给药方案相对于媒剂对照在JQ1的情况下未看到过高死亡率、心肌破裂以及LV动脉瘤形成。JQ1减弱在大前壁心肌梗塞之后(B)LV收缩功能障碍、(C)LV腔扩张、(D)LV壁增厚以及(E)心肥大的发展。(每组N＝5)。这一数据证实了BET溴结构域抑制在与人类疾病高度有关的实验设置中的功效。

图13显示用JQ1的BET溴结构域抑制阻断经培养心肌细胞中阿霉素诱导的心脏毒性。新生大鼠心室心肌细胞(NRVM)用或不用JQ1(250nM)处理3小时，接着±阿霉素(1μM)的处理另外24小时。通过TUNEL染色分析细胞的细胞凋亡并且细胞核用DAPI复染色。在荧光显微镜上采集图像并且将TUNEL阳性细胞核定量(n＝5；相对于媒剂(-)阿霉素，*p<0.05；相对于媒剂(+)阿霉素，#p<0.05。这些数据证明用JQ1的BET溴结构域抑制可以使心脏免受心脏毒性化学物质，如蒽环霉素。这些数据证明在癌症疗法期间JQ1作为心脏保护剂的效用，伴随JQ1还具有抗癌特性的额外益处。

图14显示JQ1抑制病理性平滑肌细胞活化的主要特征。所有实验都用原生大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)、PDGF-bb(10ng/mL)以及JQ1(500nM)进行。JQ1回应于促效剂PDGF-bb阻断病理性平滑肌活化的标志特征，如(A)增殖(通过放射性标记的胸苷掺入定量)、(B)迁移(使用传斯维尔(Transwell)迁移分析定量)以及(C)病理性基因诱导(针对Ptgs2/Cox2显示的qRT-PCR)。这些发现证明BET溴结构域抑制针对病理性平滑肌生长的功效(每组n＝3-6；相对于媒剂，*p<0.05；相对于PDGF-bb，**p<0.05)。

图15展现BET溴结构域抑制(使用JQ1)在心肌梗塞(MI)小鼠模型中的病理性心脏重塑中的功效。(A)研究设计。使小鼠经受永久性近端LAD结扎以产生大前壁心肌梗塞(MI)。JQ1或媒剂以指定剂量(25毫克/千克/天或50毫克/千克/天，腹膜内注射)在手术后第5天开始。用这一给药方案相对于媒剂对照在JQ1的情况下未看到过高死亡率、心肌破裂以及LV动脉瘤形成。JQ1减弱在大前壁心肌梗塞之后(B)LV收缩功能障碍、(C)LV腔扩张、(D)LV壁增厚以及(E)心肥大的发展。(在假手术组中N＝5，在MI组中N＝10)。

具体实施方式

本发明至少部分基于如下出人意料的发现：含溴结构域的蛋白(BRD2、BRD3、BRD4以及BRDT)的溴结构域和超末端(BET)家族是在心脏中经由其共活化广泛但限定应激诱发转录程序的能力而病理性心脏重塑的重要效应子。本申请的发明人已经显示用小分子探针JQ1的活体内BET溴结构域抑制在暴露于血流动力学和神经激素应激期间有力地抑制病理性心脏重塑并且保留收缩功能。因此，本发明的方面包括治疗心脏肥大的方法。所述方法包含向需要这类治疗的个体投与有效量的本发明化合物，例如JQ1，以治疗心脏肥大。

心肌病(字面上“心肌疾病”)是通常引起心脏衰竭的出于任何原因的心肌层(心肌)功能的可测量的退化；常见症状是气喘(呼吸困难)和外周水肿(腿肿胀)。与炎症或动脉粥样硬化无关的心肌病的实例是由于慢性高血压、心脏瓣膜病(主动脉瓣膜狭窄、主动脉瓣膜关闭不全、二尖瓣关闭不全)、围生期心肌病或因基因突变所致的心肌病(包括家族性肥大型心肌病和家族性扩张型心肌病)。在一些实施例中，心肌病是心脏肥大。

如本文所用，“心脏肥大”指通过如机械和激素刺激的应激源活化并且允许心脏根据对增加的心输出量的需求或损伤调整的心脏增大(摩尔根(Morgan)和贝克(Baker),循环(Circulation)83,13-25(1991))。其是存在心脏质量增加。其通常通过非侵袭性方法,如心电图，或成像模态，如胸部X射线、心脏超声(超声心动图)、心脏CT扫描或心脏MRI扫描检测。存在基于这些图像模态的严格临床上定义的测量。其常常独立于冠状动脉疾病或炎症产生。甚至当以无症状状态存在时，其存在与不良未来事件强烈相关。不存在除高血压的标准治疗(如果存在)外的用于无症状心脏肥大的目前处方疗法。心脏肥大生理上在许多患者中显而易见并且基本上与炎症不相关。

在一些实施例中，心脏肥大也可以独立于心脏衰竭、阻塞性冠状动脉疾病和/或动脉粥样硬化显而易见。如本文所用，“心脏衰竭”是当心脏不能够在足以满足组织需求的水平下维持器官灌注时产生的疾病，并且引起疲劳、呼吸困难、多器官功能障碍以及早逝。心脏衰竭包括各种疾病病况，如充血性心脏衰竭、心肌梗塞、快速心律失常、家族性肥大型心肌病、缺血性心脏病、特发性扩张型心肌病、心肌炎等。心脏衰竭可以由多种因素引起，所述因素包括(但不限于)缺血性、先天性、风湿性、病毒性、毒性或特发性形式。慢性心脏肥大是显著患病病况，其是充血性心脏衰竭和心跳骤停的前兆。

“阻塞性冠状动脉疾病”指由冠状动脉中的一或多者的阻塞引起的动脉心血管疾病。这类疾病包括(但不限于)动脉粥样硬化、血栓形成、再狭窄、心肌梗塞和/或冠状动脉血管的局部缺血(包括复发性局部缺血)。这些疾病中的一或多者的症状可以包括心绞痛，如运动诱导的心绞痛、变异型心纹痛、稳定型心绞痛以及不稳定型心绞痛。

“动脉粥样硬化”指通过含有胆固醇和脂质的斑块在大和中等大小的动脉壁的最内层上的沉积来表征的病症。动脉粥样硬化也可以表征为慢性炎症性疾病，其中血管壁中LDL粒子的存在引起从血液募集单核细胞、其转型成巨噬细胞以及通过噬菌作用消除LDL粒子的动态但最终不成功的尝试。先天性和适应性免疫系统似乎促成病变的发展，并且如在许多其它炎症性疾病中，补体的活化似乎介导至少一部分组织损伤。

“动脉粥样硬化冠状动脉疾病”指伴随心肌血流减少(心绞痛的症状或正心脏应激测试)的临床迹象，在冠状动脉血管造影上检测到的流动限制狭窄(内腔直径的>70％阻塞)的存在。

个体是动物，通常哺乳动物。在一个方面中，个体是狗、猫、马、绵羊、山羊、牛或啮齿动物。在重要实施例中，个体是人类。

在一些实施例中，个体无心脏衰竭。在一些实施例中，个体无阻塞性冠状动脉疾病的症状，包含(但不限于)心绞痛，如运动诱导的心绞痛、变异型心纹痛、稳定型心绞痛以及不稳定型心绞痛。在一些实施例中，个体不进行动脉粥样硬化的治疗。举例来说，个体不用他汀、抗血小板药物、β阻断剂药物、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂以及钙离子通道阻断剂治疗。在一些实施例中，个体不进行动脉粥样硬化的治疗，如通过血管造影片显示证明。

在一些实施例中，个体无心脏衰竭或动脉粥样硬化并且未从心肌梗塞恢复。急性心肌梗塞(AMI)是由向心脏的血液供应中断所引起的心肌细胞的死亡或坏死。术语“心肌梗塞”和“心脏病发作”在本文中用作为具有极类似含义，即，一般医学和心脏病学领域中的技术人员使用的相同含义。

在一些实施例中，个体超过60岁，并且处于患肥大的风险下但目前无症状。这类个体可以基于血管造影片鉴定以便治疗。

在一些实施例中，个体正接受降低血压的疗法，如抗高血压剂。存在许多类别的抗高血压剂，其通过不同方式降低血压；最重要并且最广泛使用的是噻嗪利尿剂、ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、β阻断剂以及血管紧张素II受体拮抗剂或ARB。抗高血压剂的实例包括(但不限于)吲达帕胺、氯噻酮、美托拉宗、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利、贝那普利、氨氯地平、西尼地平、非洛地平、伊拉地平、乐卡地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、尼群地平、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、氧烯洛尔、品多洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔、坎地沙坦、依普罗沙坦、依贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦以及缬沙坦。

本发明的一些方面涉及治疗不是由炎症引起的心脏衰竭的方法。所述方法涉及向需要这类治疗的个体投与有效量的本发明化合物，例如JQ1，以治疗心脏衰竭。

不是由炎症引起的心脏衰竭是不指定消炎药物的心脏衰竭。因此，不向患有不是由炎症引起的心脏衰竭的个体投与消炎药物，如(但不限于)类固醇，和非类固醇消炎药物。不是由炎症引起的心脏衰竭不由动脉粥样硬化、心肌梗塞以及阻塞性冠状动脉疾病引起。

通常，个体无阻塞性冠状动脉疾病，如通过血管造影片显示证明。在一些实施例中，个体未从心肌梗塞恢复。在一些实施例中，心脏衰竭是由于：

(i)无阻塞性冠状动脉疾病迹象的射血分数正常性心脏衰竭(HFpEF)；

(ii)因药物(包括抗癌剂和滥用药物)毒性所致的心脏衰竭；

(iii)由乙醇滥用所引起的心脏衰竭；

(iv)因慢性心动过速(快速心跳速率)所致的心脏衰竭；

(v)因内分泌异常(过多甲状腺激素、生长激素、糖尿病、嗜铬细胞瘤)所致的心脏衰竭；

(vi)高输出心脏衰竭(包括由贫血或周围动静脉分流所引起的心脏衰竭)；

(vii)由营养缺乏(包括硫胺、硒、钙以及镁缺乏)所引起的心脏衰竭；

(viii)因病毒感染(包括HIV)所致的心脏衰竭；或

(ix)因先天性心脏畸形所致的心脏衰竭。

在一些实施例中，个体正接受降低血压的疗法，如抗高血压剂。存在许多类别的抗高血压剂，其通过不同方式降低血压；最重要并且最广泛使用的是噻嗪利尿剂、ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、β阻断剂以及血管紧张素II受体拮抗剂或ARB。抗高血压剂的实例包括(但不限于)吲达帕胺、氯噻酮、美托拉宗、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利、贝那普利、氨氯地平、西尼地平、非洛地平、伊拉地平、乐卡地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、尼群地平、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、氧烯洛尔、品多洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔、坎地沙坦、依普罗沙坦、依贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦以及缬沙坦。

个体是动物，通常哺乳动物。在一个方面中，个体是狗、猫、马、绵羊、山羊、牛或啮齿动物。在重要实施例中，个体是人类。

本发明的一些方面涉及治疗心肌梗塞的方法。所述方法包含向需要这类治疗的个体投与呈有效治疗心肌梗塞的量的本发明化合物，例如JQ1。本发明化合物(例如JQ1)的投与不早于心肌梗塞之后5天开始。在一些实施例中，本发明化合物(例如JQ1)的投与不早于心肌梗塞之后6天开始。在一些实施例中，本发明化合物(例如JQ1)的投与不早于心肌梗塞之后7天开始。在一些实施例中，本发明化合物(例如JQ1)的投与不早于心肌梗塞之后8、9、10、11、12、13、或14天开始。

通常，个体接受β阻断剂和ACE抑制剂治疗。β阻断剂的实例包括(但不限于)阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、氧烯洛尔、品多洛尔、普萘洛尔以及噻吗洛尔。ACE抑制剂的实例包括(但不限于)卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利以及贝那普利。在一些实施例中，个体无动脉粥样硬化，如通过血管造影片显示证明。在一些实施例中，个体无心脏衰竭。

根据本发明的另一方面，提供一种心脏保护的方法。所述方法涉及向接受对心脏有毒的疗法的个体投与呈有效抑制这类疗法的心脏毒性的量的BET抑制剂。

所属领域中已知许多抗癌剂有心脏毒性影响。用于治疗癌症的许多疗法，如(但不限于)传统化学治疗剂、靶向酪氨酸激酶受体的单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂以及甚至抗血管生成药物和化学预防试剂(如环加氧酶-2抑制剂)都影响心血管系统。有心脏毒性的化学治疗药物的熟知实例包括(但不限于)蒽环霉素(如阿霉素和道诺霉素)、单克隆抗体、曲妥珠单抗、5-氟尿嘧啶、米托蒽醌、太平洋紫杉醇或长春花生物碱、他莫昔芬、环磷酰胺、伊马替尼、曲妥珠单抗、抗代谢剂(如卡培他滨或阿糖胞苷)、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)索拉非尼和舒尼替尼以及抗血管内皮生长因子抗体贝伐单抗。

已经出乎意料地发现BET(含溴结构域的蛋白质(BRD2、BRD3、BRD4以及BRDT的溴结构域和超末端家族))抑制剂保护肌肉细胞应激。在一些实施例中，BET抑制剂保护平滑肌细胞应激。因此，BET抑制剂一般来说将适用于使个体免受这类抗癌分子的心脏毒性影响。

BET抑制剂抑制BET家族溴结构域与乙酰化赖氨酸残基的结合。“BET家族溴结构域”意指包含两个溴结构域和额外末端(ET)结构域或其片段，具有转录调节活性或乙酰化赖氨酸结合活性的多肽。例示性BET家族成员包括BRD2、BRD3、BRD4以及BRDT(参见WO2011/143669，其以引用的方式并入本文中)。BET抑制剂的实例包括(但不限于)本发明化合物。BET抑制剂的其它实例可以见于例如WO2011/054843、WO2009/084693以及JP2008-156311(其中的每一个以引用的方式并入本文中)中。

根据本发明的一些方面，提供一种抑制再狭窄的方法。所述方法包含向经历血管成形术和/或接受支架的个体投与呈有效抑制再狭窄的量的BET抑制剂。

当主动脉急性阻塞时，结果可以是严重的，如心肌梗塞。时常，血管介入(包括血管成形术、支架术、动脉粥样硬化切除术以及移植)通常因引起动脉再狭窄或再堵塞的内皮和平滑肌细胞增殖而复杂化。这可能是由于由治疗本身所引起的内皮细胞损伤。经皮经管腔介入(PTI)，如支架术可以实际上触发流体和/或固体从易损斑块释放到血流中，从而可能引起冠状动脉血栓性闭塞。因此，需要易损斑块和再狭窄的治疗。

已经尝试各种疗法用于治疗或预防再狭窄。举例来说，已经提议使用涂布有治疗剂的支架来帮助使再狭窄的可能性最小化。涂布有太平洋紫杉醇的支架当与未涂布支架相比时已经显示减少再狭窄率。本申请的发明人已经发现BET抑制剂(如JQ1)可以出人意料地抑制与心室肥大和血管损伤有关的肌肉细胞生长(例如，平滑肌细胞生长)。因此，提供使用BET抑制剂抑制再狭窄的方法。

如本文所用，“再狭窄”指在进行程序以减轻变窄之后血管(或其它结构)的再变窄。本发明在一些情况下旨在减少再狭窄在个体中的出现(或发生率)和/或降低再狭窄的严重性或程度和/或减少或改善与再狭窄相关的症状。可以直接或间接测量再狭窄的严重性或程度的降低。举例来说，再狭窄的严重性或程度可以直接经由例如测量血管直径测量。间接测量可以包括功能测量。功能测量的性质将取决于受损血管的性质和正常功能。功能测量的实例是通过血管的流动速率和流动品质。这些测量优选地在再狭窄可能发生时基于来自类似但未经治疗个体的历史数据进行。这类时间安排可以是治疗之后的数天、数周、数月或数年。与再狭窄相关的症状的分析还将取决于可能再狭窄的血管的性质。如果再狭窄可能在血管中发生，那么症状包括与血流减损相关的任何心血管症状，包括(但不限于)心脏和脑症状。这些可以包括胸痛(心绞痛)(尤其在身体活动之后)、异常疲劳、呼吸短促以及胸部压力。也可以测量生物标记作为再狭窄的指示。生物标记的实例是肌钙蛋白，其在再狭窄存在下升高。各种测试可用于检测再狭窄，包括成像测试(例如，CT、磁共振成像、放射性核素成像、血管造影片、多普勒超声(Dopplerultrasound)、MRA等)，和功能测试，如运动负荷测试。

通常，个体经历血管成形术。术语“血管成形术”包括通过在内腔内使用球囊扩张血管或通过其它外科手术改变血管结构。术语“血管成形术”包括经皮经管腔冠状动脉血管成形术。在一些实施例中，个体接受支架。支架是用于支撑打开血管和其它体腔的管状支架结构。支架的最普遍用途是打开堵塞的冠状动脉并且防止再狭窄。

在一些实施例中，BET抑制剂在狭窄部位局部投与。狭窄是血管或其它管状器官或结构中的异常变窄。在一些实施例中，BET抑制剂经由导管投与。在一些实施例中，BET抑制剂作为支架上的涂层的要素投与。

BET抑制剂抑制BET家族溴结构域与乙酰化赖氨酸残基的结合。“BET家族溴结构域”意味着包含两个溴结构域和超末端(ET)结构域或其片段，具有转录调节活性或乙酰化赖氨酸结合活性的多肽。例示性BET家族成员包括BRD2、BRD3、BRD4以及BRDT(参见WO2011/143669，其以引用的方式并入本文中)。BET抑制剂的实例包括(但不限于)本发明化合物。BET抑制剂的其它实例可以见于例如WO2011/054843、WO2009/084693以及JP2008-156311(其中的每一个以引用的方式并入本文中)中。

本发明化合物

本发明提供在BET家族成员(例如BRD4)的第一溴结构域的载脂蛋白晶体结构的结合袋中结合的化合物(例如JQl和在本文中和以引用的方式并入本文中的WO2011/143669中描述的化学式的化合物)。在某些实施例中，本发明化合物可以结合到BET家族成员并且降低BET家族成员的生物活性(例如减少伸长)和/或破坏BET家族成员的亚细胞定位(例如减少染色质结合)。

在某些实施例中，本发明化合物可以例如通过结合到溴结构域载脂蛋白结合袋中的结合位点来防止、抑制或破坏BET家族成员(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)的生物活性或将其减少至少10％、25％、50％、75％或100％，和/或破坏这些蛋白质的亚细胞定位。

在某些实施例中，本发明化合物是分子量小于约1000道尔顿、小于800、小于600、小于500、小于400或小于约300道尔顿的小分子。本发明化合物的实例包括JQl和其它结合BET家族成员(例如，BRD4(下文称为BRD4(1)；PDBID20SS)的第一溴结构域的载脂蛋白晶体结构的结合袋的化合物。JQl是新颖噻吩并-三唑并-1,4-二氮呯。本发明进一步提供这类化合物的药学上可接受的盐。

在一个方面中，本发明提供式I化合物：

其中

X是N或CR₅；

R₅是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

R_B是H、烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基或-COO-R₃，其中的每一个任选地经取代；

环A是芳基或杂芳基；

每个R_A独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；或任何两个R_A与其各自连接的原子一起可以形成稠合芳基或杂芳基；

R是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；其中的每一个任选地经取代；

Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是0-3并且L是H、-COO-R₃、-CO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R4)、N(R4)C(O)R₃、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂芳基；

R₂是H、D(氘)、卤素或任选地经取代的烷基；

每个R₃独立地选自由以下组成的群组：

(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；

(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；

(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子；-C₃-C₁₂环烷基、经取代的-C₃-C₁₂环烷基、-C₃-C₁₂环烯基或经取代的-C₃-C₁₂环烯基，其中的每一个可以任选地经取代；以及

(iv)NH₂、N＝CR₄R₆；

每个R₄独立地是H、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

或R₃和R₄与其所连接的氮原子一起形成4-10元环；

R₆是烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；或R₄和R₆与其所连接的碳原子一起形成4-10元环；

m是0、1、2或3；

其限制条件是

(a)如果环A是噻吩基，X是N，R是苯基或经取代的苯基，R₂是H，RB是甲基并且Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是1并且L是-CO-N(R₃R₄)，那么R₃和R₄不与其所连接的氮原子一起形成N-吗啉环；

(b)如果环A是噻吩基，X是N，R是经取代的苯基，R₂是H，RB是甲基，并且Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是1并且L是-CO-N(R₃R₄)，并且R₃和R₄中的一个是H，那么R₃和R₄中的另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代的苯基、吡啶基或经取代的吡啶基；以及

(c)如果环A是噻吩基，X是N，R是经取代的苯基，R₂是H，R_B是甲基，并且Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是1并且L是-COO-R₃，那么R₃不是甲基或乙基；

或其盐、溶剂合物或水合物。

在某些实施例中，R是芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代。

在某些实施例中，L是H、-COO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R₄)、N(R₄)C(O)R₃或任选地经取代的芳基。在某些实施例中，每个R₃独立地选自由以下组成的群组：H；-C₁-C₈烷基，其任选地经取代，含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子；或NH₂；N＝CR₄R₆。

在某些实施例中，R₂是H、D、卤素或甲基。

在某些实施例中，R_B是烷基、羟烷基、卤烷基或烷氧基；其中的每一个任选地经取代。

在某些实施例中，R_B是甲基、乙基、羟基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt或COOCH₂OC(O)CH₃。

在某些实施例中，环A是5或6元芳基或杂芳基。在某些实施例中，环A是硫代呋喃基、苯基、萘基、联苯、四氢萘基、二氢茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基或5,6,7,8-四氢异喹啉基。

在某些实施例中，环A是苯基或噻吩基。

在某些实施例中，m是1或2，并且至少一个出现的R_A是甲基。

在某些实施例中，每个R_A独立地是H、任选地经取代的烷基，或任何两个R_A与其各自连接的原子一起可以形成芳基。

在另一个方面，本发明提供式II化合物：

其中

X是N或CR₅；

R₅是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

R_B是H、烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基或-COO-R₃，其中的每一个任选地经取代；

每个R_A独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；或任何两个R_A与其各自连接的原子一起可以形成稠合芳基或杂芳基；

R是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

R'i是H、-COO-R₃、-CO-R₃、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂芳基；

每个R₃独立地选自由以下组成的群组：

(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基；

(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；

(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子；-C₃-C₁₂环烷基、经取代的-C₃-C₁₂环烷基、-C₃-C₁₂环烯基或经取代的-C₃-C₁₂环烯基，其中的每一个可以任选地经取代；

m是0、1、2或3；

其限制条件是如果R'₁是-COO-R₃，X是N，R是经取代的苯基，并且R_B是甲基，那么R₃不是甲基或乙基；

或其盐、溶剂合物或水合物。

在某些实施例中，R是芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代。在某些实施例中，R是苯基或吡啶基，其中的每一个任选地经取代。在某些实施例中，R是对Cl-苯基、邻Cl-苯基、间Cl-苯基、对F-苯基、邻F-苯基、间F-苯基或吡啶基。

在某些实施例中，R'i是-COO-R₃、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂芳基；并且R₃是-C₁-C₈烷基，其含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子，并且其可以任选地经取代。在某些实施例中，R'i是-COO-R₃，并且R₃是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；或R'i是H或任选地经取代的苯基。

在某些实施例中，R_B是甲基、乙基、羟基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH₂OC(O)CH₃。

在某些实施例中，R_B是甲基、乙基、羟基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt或COOCH₂OC(O)CH₃。

在某些实施例中，每个R_A独立地是任选地经取代的烷基，或任何两个R_A与其各自连接的原子一起可以形成稠合芳基。

在某些实施例中，每个R_A是甲基。

在另一个方面中，本发明提供式III化合物：

其中

X是N或CR₅；

R₅是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

RB是H、烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基或-COO-R₃，其中的每一个任选地经取代；

环A是芳基或杂芳基；

每个R_A独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；或任何两个R_A与其各自连接的原子一起可以形成稠合芳基或杂芳基；

R是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

每个R₃独立地选自由以下组成的群组：

(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；

(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；

(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子；-C₃-C₁₂环烷基、经取代的-C₃-C₁₂环烷基、-C₃-C₁₂环烯基或经取代的-C₃-C₁₂环烯基，其中的每一个可以任选地经取代；以及

(iv)NH₂、N＝CR₄R₆；

每个R₄独立地是H、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

或R₃和R₄与其所连接的氮原子一起形成4-10元环；

R₆是烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；或R₄和R₆与其所连接的碳原子一起形成4-10元环；

m是0、1、2或3；

其限制条件是：

(a)如果环A是噻吩基，X是N，R是苯基或经取代的苯基，R_B是甲基，那么R₃和R₄不与其所连接的氮原子一起形成N-吗啉环；和

(b)如果环A是噻吩基，X是N，R是经取代的苯基，R₂是H，R_B是甲基，并且R₃和R₄中的一个是H，那么R₃和R₄中的另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代的苯基、吡啶基或经取代的吡啶基；

或其盐、溶剂合物或水合物。

在某些实施例中，R是芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代。在某些实施例中，R是苯基或吡啶基，其中的每一个任选地经取代。

在某些实施例中，R是对Cl-苯基、邻Cl-苯基、间Cl-苯基、对F-苯基、邻F-苯基、间F-苯基或吡啶基。在某些实施例中，R₃是H、NH₂或N＝CR₄R₆。

在某些实施例中，每个R₄独立地是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；其中的每一个任选地经取代。

在某些实施例中，R₆是烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代。

在另一个方面中，本发明提供式IV化合物：

其中

X是N或CR₅；

R₅是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

R_B是H、烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基或-COO-R₃，其中的每一个任选地经取代；

环A是芳基或杂芳基；

每个R_A独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；或任何两个R_A与其各自连接的原子一起可以形成稠合芳基或杂芳基；

Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是0-3并且L是H、-COO-R₃、-CO-R₃、-CO-N(R₃R₄)、-S(O)₂-R₃、-S(O)₂-N(R₃R₄)、N(R₃R4)、N(R4)C(O)R₃、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂芳基；

R₂是H、D、卤素或任选地经取代的烷基；

每个R₃独立地选自由以下组成的群组：

(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基或经取代的杂芳基；

(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；

(iii)-C₁-C₈烷基、-C₂-C₈烯基或-C₂-C₈炔基，各自含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子；-C₃-C₁₂环烷基、经取代的-C₃-C₁₂环烷基、-C₃-C₁₂环烯基或经取代的-C₃-C₁₂环烯基，其中的每一个可以任选地经取代；以及

(iv)NH₂、N＝CR₄R₆；

每个R₄独立地是H、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；

或R₃和R₄与其所连接的氮原子一起形成4-10元环；

R₆是烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其中的每一个任选地经取代；或R₄和R₆与其所连接的碳原子一起形成4-10元环；

m是0、1、2或3；

其限制条件是

(a)如果环A是噻吩基，X是N，R₂是H，RB是甲基，并且Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是0并且L是-CO-N(R₃R₄)，那么R₃和R₄不与其所连接的氮原子一起形成N-吗啉环；

(b)如果环A是噻吩基，X是N，R₂是H，RB是甲基，并且Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是0并且L是-CO-N(R₃R₄)，并且R₃和R₄中的一个是H，那么R₃和R₄中的另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代的苯基、吡啶基或经取代的吡啶基；以及

(c)如果环A是噻吩基，X是N，R₂是H，R_B是甲基，并且Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是0并且L是-COO-R₃，那么R₃不是甲基或乙基；或其盐、溶剂合物或水合物。

在某些实施例中，Ri是-(CH₂)_n-L，其中n是0-3并且L是-COO-R₃、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂芳基；并且R₃是-C₁-C₈烷基，其含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子，并且其可以任选地经取代。在某些实施例中，n是1或2并且L是烷基或-COO-R₃，并且R₃是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基；或n是1或2并且L是H或任选地经取代的苯基。

在某些实施例中，R₂是H或甲基。

在某些实施例中，R_B是甲基、乙基、羟基甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH₂OC(O)CH₃。

在某些实施例中，环A是苯基、萘基、联苯、四氢萘基、二氢茚基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基或5,6,7,8-四氢异喹啉基。

在某些实施例中，每个R_A独立地是任选地经取代的烷基，或任何两个R_A与其各自连接的原子一起可以形成芳基。

本发明还提供式V-XXII化合物，和WO2011/143669中描述并且以引用的方式并入本文中的所有化合物。

在某些实施例中，化合物是(+)-JQl：

其盐、溶剂合物或水合物。

本发明化合物以有效量投与。有效量是足以提供医学上所需结果的剂量并且可以由所属领域的技术人员使用常规方法确定。在一些实施例中，有效量是引起所治疗的病状的任何改进的量。在一些实施例中，有效量可以取决于所治疗的疾病或病状的类型和程度和/或一或多种额外治疗剂的使用。然而，所属领域的技术人员可以例如基于活体外和/或活体内测试和/或化合物剂量的其它知识确定使用的治疗剂的合适剂量和范围。

有效量通常将在一或多种剂量投与中在约0.001mg/kg到约1000mg/kg，约0.01mg/kg到约750mg/kg，约0.1mg/kg到约500mg/kg，约1.0mg/kg到约250mg/kg，约10.0mg/kg到约150mg/kg范围内持续一天或几天或许多天(取决于投与模式和上文所论述的因素)。

在一些实施例中，有效量是将停止或抑制心肌病和/或心脏肥大的进程的量。在一些实施例中，有效量是将甚至延迟具有心肌病和/或肥大的风险因素的个体中的心肌病和/或肥大发作的量。

在一些实施例中，有效量是将停止或抑制心脏衰竭的进程的量。在一些实施例中，有效量是将甚至延迟具有心脏衰竭的风险因素的个体中的心脏衰竭发作的量。

在一些实施例中，有效量是将防止和/或减少心脏损伤的BET抑制剂的量。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括病状的严重程度、采用的特定化合物的活性、采用的特定组合物以及个体的年龄。负责投与的人员将在任何情况下确定个别个体的合适剂量。

在一些实施例中，有效量是在血管成形术之后足以抑制或停止在血管损伤部位处冠状动脉平滑肌细胞的增殖的BET抑制剂的量。构成“有效量”的BET抑制剂的量将取决于使用的BET抑制剂、再狭窄的严重程度以及有待治疗的人类的年龄和体重而变化，但可以常规地由所属领域的技术人员考虑到其自身知识和本发明来确定。

通过以下实例进一步说明本发明，所述实例决不应解释为进一步限制。在整个本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考、授予的专利、公开的专利申请以及共同待决专利申请)的全部内容由此以引用的方式明确地并入。

实例

方法：

动物模型.所有关于动物使用的方案都在凯斯西储大学(CaseWesternReserveUniversity)经机构动物照护与使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准并且根据美国国家卫生研究院实验动物照护和使用指南(NIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)进行。所有模型在C57Bl/6J小鼠(杰克逊实验室(JacksonLaboratories))中进行，其在无病原体设施中在标准亮/暗循环和任意获取食物和水下维持。

人类样品.来自健康人类心脏的LV样品如所描述(海能哈利等人,2006；马古利斯(Margulies)等人,2005)根据在宾夕法尼亚州费城，宾夕法尼亚大学医院的研究审查委员会(InvestigationReviewCommitteeattheHospitaloftheUniversityofPennsylvania,Philadelphia,PA)获得。使用NE-Per试剂盒(赛默科技(ThermoScientific)编号78833)根据制造商的说明提取核蛋白。自公开数据集(海能哈利等人,2006)精选从未衰竭与衰竭人类心脏获得的左心室的基因表达谱。

制备JQ1.JQ1在詹姆斯布拉德纳博士(Dr.JamesBradner)(DFCI)的实验室中如先前所公开(菲利帕克普洛斯(Filippakopoulos)等人,2010)合成和纯化。对于活体内实验，使用剧烈涡旋将储备溶液(DMSO中50mg/mL)在水性载剂(10％羟丙基β-环糊精；西格玛(Sigma)C0926)中稀释到5mg/mL的工作浓度。小鼠以每日一次腹膜内给予的50mg/kg的剂量注射。媒剂对照被给予相等量的含DMSO的载剂溶液。所有溶液使用无菌技术制备和投与。对于活体外实验，将JQ1和其它BET抑制剂溶解于DMSO中并且在指定浓度下使用相等体积的DMSO作为对照投与到细胞。使用的BET抑制剂如下：iBET、iBET-151、RVX-208以及PF-1。

小鼠中的横向主动脉缩窄和长期PE输注.所有小鼠是年龄为10-12周的C57Bl/6J同窝出生雄性小鼠。对于TAC，小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，以机械方式通风(哈佛设备(Harvardapparatus))，并且经受开胸术。使用7.0丝质缝合线和27号针如先前描述(胡(Hu)等人,2003)在左和右颈动脉之间缩窄主动脉弓。在我们看来，这一方案是穿过主动脉的缩窄部分的大约50毫米汞柱的一致峰值压力梯度。对于PE输注，小鼠使用连续1％吸入异氟醚麻醉。小型渗透泵(阿尔泽特(Alzet)2004，度瑞公司(DurectCorp.))填充有苯肾上腺素盐酸盐(PE，西格玛)或媒剂(生理盐水)并且皮下在小鼠的背面植入。PE以75毫克/千克/天的剂量输注17天。JQ1或媒剂的注射手术后1.5天开始。

超声心动图、血压以及耐力运动能力测量.对于经胸超声心动图，小鼠用1％吸入异氟醚麻醉并且使用维沃(Vevo)770高分辨率成像系统(视觉声能学公司(VisualSonics,Inc.))和RMV-707B30MHz探针成像。自M-模式取样和在LV短轴中在中乳头水平下采集的整合EKV图像获得测量值(哈尔达(Haldar)等人,2010)。通过高频多普勒如先前描述(刘(Liu)等人，2012)获得穿过主动脉的缩窄部分的压力梯度的测量值。使用BP2000血压分析系统(维希泰科系统公司(VisitechSystems,Inc.))如制造商所建议测量有意识的尾静脉收缩血压。为了使小鼠适应设备，我们在开始实验之前持续一周进行每日血压测量。踏车耐力运动测试在机动小鼠踏车(哥伦布仪器(ColumbusInstruments))上如先前描述(哈尔达等人,2012)进行。

NRVM培养.NRVM自2天大史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠幼仔(查尔斯河(CharlesRiver))的心脏分离并且如所描述(哈尔达等人,2010)维持在标准条件下。将细胞差异涂在细胞培养盘中1.5h以去除污染的非肌细胞。除非另外说明，否则NRVM以10⁵个细胞/毫升的密度涂布。细胞最初在生长培养基(补充有5％FBS、100U/mL青霉素-链霉素以及2mML-谷氨酰胺的DMEM)中涂布24-36小时并且其后维持在无血清培养基(补充有0.1％BSA、1％胰岛素-转铁蛋白-硒液体培养基补充剂(西格玛I3146)、100U/mL青霉素-链霉素以及2mML-谷氨酰胺的DMEM)中。每2-3天更换培养基。在用促效剂刺激之前，NRVM维持在无血清培养基中48-72小时。对于肥大刺激，NRVM用JQ1与DMSO在指定浓度下培育6h，接着用PE(100μM)刺激指定时间点。

NRVMBRD4免疫荧光.NRVM在6孔盘中玻璃盖玻片上生长。细胞固定在含有3％PFA的PBS中(15min)，在PBST/0.25％TritonX-100中经渗透(10min),并且在PBST/5％马血清中阻断1h。在PBST/5％马血清中共培育初级抗体(抗肌节α-辅肌动蛋白，西格玛A7811，1:800；抗BRD4，贝斯(Bethyl)A301-985A，1:250)1h。二级抗体(驴α-小鼠阿莱克萨(Alexa)594红色；驴α-兔阿莱克萨488绿色；杰克逊免疫研究(JacksonImmuno-research))以1:1000各自在PBST/5％马血清中共培育1h。将盖玻片安装到具有含DAPI的封片培养基的载玻片上。在荧光显微镜上采集图像。

细胞面积测量.NRVM以10⁵个细胞/毫升的密度涂在6孔盘中玻璃盖玻片上。在处理之后，细胞简单地固定在含有2％PFA的PBS中，用PBST/0.1％TritonX-100渗透，并且在PBST/5％马血清中阻断。初级抗体是在1:800下的抗肌节α-辅肌动蛋白(西格玛A7811)。以1:1000稀释度使用荧光团标记的抗小鼠二级抗体(α-小鼠阿莱克萨488绿色)。将盖玻片安装在具有含DAPI的封片培养基的载玻片上。心肌细胞细胞表面积的定量在α-辅肌动蛋白染色的心肌细胞上使用荧光显微法和NIH图像J软件如先前描述(梁(Liang)等人,2001)进行。分析由在400倍放大倍数下，在20-30个区域中的至少100个心肌细胞组成。这一过程在最少三个独立实验中复制，并且组合数据。

RNA纯化和qRT-PCR.针对组织RNA，将一片10-20mg的小鼠心脏组织保存在RNA拉特(Later)稳定试剂(凯杰(Qiagen))中，接着在普拉泽尔(PureZOL)(伯乐(BioRad))中在TissueLyser(凯杰)上使用不锈钢珠粒(凯杰)机械破碎/均质化。水相用氯仿萃取。使用欧诺姆(Aurum)纯化试剂盒(伯乐编号732-6830)遵循制造商的说明自水相纯化RNA。对于细胞样品，使用高纯度RNA(HighPureRNA)分离试剂盒(罗氏(Roche)编号11828665001)用柱上DNA酶处理根据制造商的说明自NRVM分离总RNA。纯化RNA使用iScript^TMRT超混合液(伯乐编号170-8841)遵循制造商的方案逆转录成互补DNA。定量实时PCR使用塔克曼(TaqMan)化学(FastStartUniversalProbeMaster(罗氏目录号4914058001)和来自罗氏通用探针库系统(RocheUniversalProbeLibrarySystem)的标记探针)在罗氏莱特塞克勒(RocheLightCycler)上进行。使用ΔΔCt方法用针对组成型基因的标准化如所指定计算相对表达。

西方印迹法.对于总细胞蛋白，将细胞溶解在补充有蛋白酶抑制剂片剂(罗氏目录号4693132001)的RIPA缓冲液(西格玛R0278)中。使用NE-Per试剂盒(赛默科技编号78833)根据制造商的说明分离核蛋白。使20-40μg的全细胞蛋白提取物或20μg的核蛋白提取物经受SDSPAGE，转移到硝化纤维膜，和使用以下抗体的西方印迹法：BRD4(贝斯编号A301-985A)、微管蛋白(西格玛T9026)、RNA聚合酶II(圣克鲁兹(SantaCruz)N-20，sc-899)。

Brd4敲低.对于针对小鼠/大鼠Brd4的shRNA，将发夹序列5'-GCGGTAAGATGTACATCAAACGTGTGCTGTCCGTTTGGTGTACATCTTGCTGC-3'(环序列带下划线)亚克隆到pEQ腺病毒-shRNA载体(威尔基因公司(Welgen,Inc.))中。将sh-Brd4和sh-对照(杂乱shRNA)的重组腺病毒通过威尔基因公司来扩增并且纯化。NRVM用腺病毒(5-10MOI)培育24小时，接着更换新制无血清培养基保持另外24小时。在初始感染之后的48小时，用PE刺激细胞。

染色质免疫沉淀.将NRVM以5×10⁶个细胞/盘涂在15cm盘中。自大约15×10⁶个NRVM合并的染色质用于每一免疫沉淀。在指定处理之后，将NRVM直接固定在具有1％甲醛的盘上10分钟，接着用0.125M甘氨酸淬灭5分钟。提取染色质，接着在比奥卢浦特(BioRuptor)上剪切(迪亚格诺德(Diagenode)；总计16个循环，高功率，30秒开/关)。超声处理的染色质用结合到戴诺磁珠(Dynabeads)(英杰公司(Invitrogen))的5μg抗体免疫沉淀，接着充分洗涤和洗脱。免疫沉淀和输入染色质样品接着逆交联，接着纯化基因组DNA。基因组DNA的靶向和非靶向区域通过qRT-PCR在免疫沉淀和输入样本二者中使用Sybrgreen化学扩增。富集数据如先前描述(奥特(Ott)等人,2012)通过计算每个样品的输入DNA的免疫沉淀DNA百分比来分析。用于ChIP中的抗体是BRD4(贝斯编号A301-985A)和RNA聚合酶II(圣克鲁兹N-20，sc-899)。

组织学分析.将来自中部心室的短轴心脏部分固定在PBS/4％多聚甲醛中并且嵌入在石蜡中。通过用如先前描述(弗洛伊斯(Froese)等人,2011)定量的若丹明结合的麦胚凝集素(载体实验室(VectorLaboratories)RL-1022染色来测定心肌细胞横截面积。纤维化使用梅森氏三色染色法染色试剂盒(生物护理医学(Biocaremedical))在纤维化面积的定量下如先前描述(宋(Song)等人,2010)观测。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口端标记(TUNEL)染色和定量如先前描述(宋等人,2010)使用阿波普塔普拉斯(ApopTagPlus)试剂盒(密理博(Millipore))根据制造商的说明进行。心肌毛细管染色在冷冻LV切片中使用抗PECAM-1抗体(EMD密理博目录号CBL-1337)如先前描述(哈尔达等人,2010)进行。

统计分析.数据以平均值±标准误差报告。用于微阵列数据的分析中的统计方法在以上单独详述。两组之间的平均值的比较使用双尾史都登氏t测试用邦弗朗尼(Bonferroni)校正分析以便多重比较。对于所有分析，认为<0.05的p值是显著的。

结果：

BET溴结构域是活体外病理性心肌细胞肥大的细胞自主性调节因子.

评估心脏中BET的表达谱。新生大鼠心室心肌细胞(NRVM)和成年小鼠心室组织的分析揭露Brd2、Brd3以及Brd4可检测，其中Brd4是最高表达的转录物(图1A-B)。在NRVM、小鼠心脏组织以及人类心脏组织中的西方印迹确认丰富BRD4表达(图1C)并且NRVM的免疫荧光染色展现BRD4经核定位(图1D)。因为BET已知为经由其转录共活化刺激和细胞状态特异性基因表达程序的能力细胞转型的重要调节因子(菲利帕克普洛斯等人,2010；洛克伍德(Lockwood)等人,2012)，假设其可在心肌细胞肥大中起作用。为了探索BET在这一过程中的作用，利用小分子探针JQ1的特性(图2A)，其经由第二溴结构域的竞争性结合和这些表观遗传读取蛋白从乙酰化染色质的所得位移特异性并且有力地抑制BET功能(菲利帕克普洛斯等人,2010)。在广泛使用的NRVM模型(辛普森(Simpson)等人,1982；斯塔克森(Starksen)等人,1986)中，纳摩尔剂量的JQ1显著阻断苯肾上腺素(PE)介导的细胞肥大(图2B)和病理性基因诱导(图2C)。以类似方式，NRVM中Brd4的敲低(图1E)还减弱PE介导的肥大生长(图2D)和病理性基因诱导(图2E)。接着评估多个结构上不同的BET抑制剂(iBET、iBET-151、RVX-208、PF-1；图1F)的抑制心肌细胞肥大的能力。在等摩尔剂量下，发现促效剂诱导的心肌细胞肥大的抑制实际上是BET抑制剂的类别效果，这些化合物的相对效能与其针对BRD4的已知IC50相关(菲利帕克普洛斯等人,2010)。这些数据一起展现BET溴结构域蛋白是病理性心肌细胞肥大的细胞自发性调节因子并且小分子BET抑制剂JQ1具有有效活体外抗肥大效果。

BET为心肌细胞中病理性基因表达程序的诱导所需

为了测定在肥大转型期间BET溴结构域抑制的转录效果，在经培养NRVM中在基线处和在PE刺激(1.5、6、48h)之后在存在或不存在JQ1下进行基因表达谱分析(GEP)研究。评估这三个时间点以捕获早期反应基因，如c-Myc(斯塔克森等人,1986)和最终肥大基因程序的诱导。差异表达的转录物的评估揭露三个主要群集：PE可诱导并且经JQ1抑制的基因、PE可诱导并且不受JQ1影响的基因以及PE抑制的并且不受JQ1影响的基因。基于PE介导的变化的最高幅值选择的基因的热图说明这些群集中的每一个(图3A)。这些GEP的整体分析揭露PE刺激引起超过450个基因的累积诱导并且JQ1的主要效果是减弱或完全消除PE介导的基因诱导。这些转录效果在1.5小时显而易见并且随时间增加(图2B-C)，这是与BET作为可诱导基因表达程序的必需共活化因子的已知作用一致的发现。经JQ1抑制的PE可诱导转录物的功能路径分析揭露BET在已知参与病理性心肌细胞活化的大量生物过程中起必需作用，所述生物过程包括细胞骨架再组织、细胞外基质产生、细胞周期再入、细胞生长的旁分泌/自分泌刺激以及促炎性信号传导(图3D)(宋(Song)等人,2012；赵(Zhao)等人,2004)。使用促肥大细胞因子IL6作为代表性标靶(戴尔韦斯科沃(delVescovo)等人,2013)，我们通过qRT-PCR确认JQ1显著减弱其PE介导的诱导(图3E)。在病理性应力期间BET的活性增加不是由于其自身表达的PE介导的增加(图4A)。染色质免疫沉淀(ChIP)研究展现内源BRD4和PolII回应于PE募集到IL6的近端启动子，而JQ1阻断这一募集(图3F)。有趣的是，BET溴结构域抑制不影响c-Myc的PE介导的诱导(图3G)，c-Myc是在某些骨髓肿瘤中直接经BET调节的重要标靶(德尔默(Delmore)等人,2011；奥特等人,2012；丰岛(Toyoshima)等人,2012；朱伯等人,2011)，其还是病理性心脏肥大的确立的转录驱动(斯塔克森等人,1986；肖(Xiao)等人，2001；钟(Zhong)等人,2006)。总的来说，这些活体外数据(图2和3)展现含有BET溴结构域的蛋白质以细胞自主性方式经由广泛但特异性转录程序的共活化调节心肌细胞肥大。

BET溴结构域抑制活体内病理性肥大和心脏衰竭.

给出我们在经培养心肌细胞中的观察结果，假设BET可调节完整有机体中的病理性心脏重塑。利用JQ1的有利治疗指数，其先前已经显示当以50毫克/千克/天长期投与时在成年小鼠中有力地抑制BET溴结构域功能而无显著毒性(德尔默等人,2011年；菲利帕克普洛斯等人,2010；马楚克(Matzuk)等人,2012)。在独立分析中，这一主要毒性缺乏通过展现用这一剂量的JQ1处理2-3周的小鼠具有保留的耐力运动能力(图6A)(整体心血管代谢健康的度量)来确认。对于活体内研究，使用横向主动脉缩窄(TAC)，其是向心脏提供集中血流动力学应激并且在人类中重现病理性肥大和HF的若干主要方面的充分表征模型(罗克曼(Rockman)等人,1991)。经受TAC的成年小鼠7-10天产生同心左心室肥大(LVH)并且在3-4周之后发展成晚期心脏衰竭。进行TAC或假手术，接着在开始TAC之后大约1.5天投与JQ1(相对于相等体积的媒剂，50毫克/千克/天)(图5A)。连续超声心动图显示JQ1以维持4周的效果免受TAC介导的LV收缩功能障碍、腔扩张以及壁增厚(图5B-D、图6B)。JQ1治疗还在TAC之后抑制病理性心肥大(图5E；代表性照片显示于图5G中)、肺充血(图5F)以及典型肥大标记基因的心肌表达(图5H)。JQ1在TAC期间充分耐受，如通过正常活性证明，并且在与媒剂处理小鼠(数据未显示)相比时，缺乏显著死亡率或重量减轻。此外，在假手术处理的小鼠中JQ1对LV结构或功能无不良影响(图5E-G和图6A)。重要地，JQ1不影响全身血压(图6C)。此外，JQ1在TAC模型中的保护效果不与穿过主动脉缩窄的压力梯度的差相关(图6D)。

除血流动力学应激以外，过度神经激素活化也是病理性心脏肥大的重要驱动(希尔(Hill)和奥尔森(Olson)，2008；凡贝罗(vanBerlo)等人,2013)。因此，评估JQ1是否可以改善神经激素介导的心脏肥大小鼠模型中的病理学。小鼠植入有递送苯肾上腺素(PE，75毫克/千克/天，相对于生理盐水)的渗透小型泵，接着在小型泵安装之后1.5天开始JQ1或媒剂投与。这一输注方案通常在2-3周内产生稳定同心LVH，但在野生型小鼠中不引起显著LV腔扩张或LV收缩功能的受损。与以上TAC结果一致，JQ1在长期PE输注期间有力地抑制病理性心脏肥大的发展，而无LV收缩功能的任何损害(图5I)。

除其对心脏功能的有利效果以外，评估JQ1是否还改善活体内HF的主要组织病理学特征。心脏组织的分析展现JQ1显著减弱通常在TAC4周之后看到的心肌细胞肥大(图7A)、心肌纤维化(图7B)、凋亡细胞死亡(图7C)以及毛细管稀疏(图7D)的产生(佐野(Sano)等人,2007；宋等人,2010)。综合而言，图5和7中的结果显示BET功能对于在血流动力学和神经激素介导的应激下活体内病理性心脏重塑的发生是重要的。此外，这些数据确定小分子JQ1的选择性BET溴结构域抑制在心脏衰竭的动物模型中充分耐受并且有效。

BET抑制遏制活体内病理性心脏基因表达程序.

为了更好地理解BET调节活体内应激诱导的病理性重塑的机制，进行小鼠心肌组织的动力学GEP。使用TAC模型，在3个时间点(图2B)进行3组的微阵列(假手术-媒剂、TAC-媒剂以及TAC-JQ1)：3天(以反映在肥大发作之前发生的早期事件)、11天(肥大确立)以及28天(具有HF的征象的晚期病理性重塑)。GEP的无监测分级聚类揭露在与假手术媒剂组相比时，TAC-媒剂组具有随时间演变的不同转录组标签(图2B)。相比之下，TAC-JQ1GEP在假手术组下群集并且不展示显著暂时变化，尽管连续暴露于TAC(图2B)。因此，JQ1治疗遏制心脏中广泛病理学基因表达程序的演变，效果早在TAC后3天显而易见。类似于我们在分离心肌细胞中的GEP(图3)，差异表达的转录物的整体分析揭露三个主要群集：TAC可诱导并且经JQ1遏制的基因、TAC可诱导并且不受JQ1影响的那些以及TAC遏制并且不受JQ1影响的那些。基因(针对TAC介导的变化的最高幅值选择)的代表性热图突出显示这三个群集中的每一个(图8C)。TAC不显著改变Brd2、Brd3或Brd4自身的心肌表达(图9A)。为了观测TAC和BET溴结构域抑制在模型中随时间的整体转录组效果，进行基因表达动力学检查(GEDI)分析(艾奇勒(Eichler)等人,2003)。虽然假手术组马赛克保持暂时恒定，TAC引起随时间基因群集的渐进诱导，其通过马赛克内许多块的信号增加指示(图8D)。BET溴结构域抑制遏制具有更接近地类似于假手术组的马赛克标签的这一TAC诱导的病理性转录程序的暂时演变(图8D)。经JQ1遏制的TAC可诱导转录物的功能路径分析显示参与活体内病理性心肌重塑和心脏衰竭进程的重要生物过程，包括细胞外基质加工、细胞周期再入、促炎性活化以及趋化因子/细胞因子信号传导的富集(图8G)(宋等人,2012；赵等人,2004)。重要地，这些功能术语与来自分离NRVM的数据(图3D)对准并且表示在晚期人类HF中普遍观测到的病理性过程(海能哈利等人,2006；林(Lin)等人,2011)。

刺激偶联基因诱导经由DNA结合转录因子与高阶染色质结构的变化之间的动态相互作用产生(李(Lee)和杨(Young),2013；施赖伯(Schreiber)和伯恩斯坦(Bernstein),2002)。给出在JQ1下可见的对心肌基因表达的广泛效果，假设BET允许经由其活体内协调地共活化多种转录因子路径的能力来进行病理性基因诱导。使用基因集富集分析(GSEA)(苏布拉玛尼安(Subramanian)等人,2005)，针对转录因子标签的概述比较我们的经BET抑制遏制的TAC可诱导基因集。具体来说，针对以下进行GSEA：(a)布罗德研究所分子标签数据库(BroadInstituteMolecularSignaturesDatabase)C3基元基因集(谢(Xie)等人,2005)以及(b)通过活体内结点促肥大转录效应子的心肌细胞特异性活化驱动的三种非依赖性GEP-钙调神经磷酸酶-NFAT(布塞特等人,2010)、NFκB(迈尔等人,2012)以及GATA4(海内克等人，2007)。这些分析揭露TAC诱导的基因表达谱对于IRF和Et基元(q<0.0001)以及由钙调神经磷酸酶、NFκB以及GATA4活化产生的心肌标签正富集(图8G)。相反，JQ1的效果展现对于这些相同TF标签的强负富集(图5G)。相比之下，虽然TAC与c-Myc和E2F标签强烈相关，在任何时间点c-Myc/E2F与JQ1效果之间不存在相关(图9B；未显示针对E2F的数据)。与我们的NRVM研究一致，还发现JQ1对活体内c-Myc表达的TAC介导的诱导无效果(图9C)。因此，这些GSEA支持其中BET溴结构域经由广泛但特异性心肌转录因子网络的共活化促进基因诱导的模型。

接着针对人类中晚期非缺血性和缺血性心脏衰竭的验证基因表达谱比较经JQ1遏制的TAC可诱导基因集(海能哈利等人,2006)。这一分析展现小鼠TAC模型中的BET的标靶以统计显著方式与在人类心脏衰竭中诱导的基因集重叠(图10A；χ²<2x10^-14)。有趣的是，绝大部分(90％)这些标靶为缺血性和非缺血性人类心脏衰竭所共用(图10B)。因此，由于经受TAC的小鼠的基因表达谱与人类群组中的晚期心脏衰竭的基因表达谱重叠，发现小鼠中的BET信号传导的转录标靶也在人类疾病中相关。

JQI改善小鼠TAC模型中的预先确立的病理性重塑

使用横向主动脉缩窄(TAC)使成年小鼠经受压力超负荷。JQ1或媒剂在TAC后第18天开始，其是当显著病理学已经产生时的时间点(图11)。甚至当在显著心脏病理学已经产生之后投与时，JQ1显著减弱(图11B)LV收缩功能障碍、(图11C)LV腔扩张、(图11D)LV壁增厚以及(图11E)心肥大的进程。(每组N＝6-12)。这一数据证实了BET溴结构域抑制在与人类中的预先确立的心脏病高度有关的实验设置中的功效。举例来说，患者通常呈现预先存在或确立的心脏肥大和/或心脏衰竭。这一数据显示用JQ1的BET溴结构域抑制甚至在预先确立的心脏肥大和心脏衰竭的设置中有效。

JQI抑制小鼠(n＝5和n＝5-10)中大前壁MI之后的病理性重塑

使小鼠经受永久性近端LAD结扎以产生大前壁心肌梗塞(MI)。JQ1或媒剂在手术后第5天以指定剂量(25毫克/千克/天或50毫克/千克/天，腹膜内注射)开始。在这一给药方案下，相对于媒剂对照在JQ1的情况下不可见过高死亡率、心肌破裂以及LV动脉瘤形成(图12)。在大前壁心肌梗塞之后JQ1减弱(图12B和15B)LV收缩功能障碍、(图12C和15C)LV腔扩张、(图12D和15D)LV壁增厚以及(图12E和15E)心肥大的发展。(图12-每组N＝5；图15-在假手术组中N＝5，在MI组中N＝10)。这一数据证实了BET溴结构域抑制在与人类疾病高度有关的实验设置中的功效。在心肌梗塞之后，心脏的异常重塑在未梗塞心肌层的远端区域中产生，引起心脏扩张、增大以及收缩功能障碍。这是心脏衰竭的极常见原因。这一数据显示BET溴结构域抑制使心肌层的未梗塞区域免受病理性重塑，并且因此保留整体心脏功能。这一模型或TAC模型都不涉及动脉粥样硬化。因此，在这些设置中保护心脏的能力与对动脉粥样硬化的任何效果不相关。这些数据展现BET溴结构域抑制(使用JQ1)在心肌梗塞(MI)小鼠模型中的病理性心脏重塑中的功效。在病理性MI后重塑的若干主要参数中获得统计显著效果。

JQ1抑制经培养心肌细胞中阿霉素介导的细胞凋亡.

阿霉素(Doxo)是常用作癌症的细胞毒性化学治疗的蒽环霉素化合物。阿霉素引起对心肌细胞的剂量依赖性毒性并且可以在患者中引起心脏增大、纤维化以及心脏衰竭。心脏毒性对于如阿霉素和道诺霉素的蒽环霉素是剂量限制的。图13展现用JQ1的BET溴结构域抑制阻断经培养心肌细胞中阿霉素诱导的心脏毒性。新生大鼠心室心肌细胞(NRVM)用或不用JQ1(250nM)处理3小时，接着±阿霉素(1μM)的处理另外24小时。通过TUNEL染色分析细胞的细胞凋亡并且细胞核用DAPI复染色。在荧光显微镜上采集图像并且将TUNEL阳性细胞核定量(n＝5；相对于媒剂(-)阿霉素，*p<0.05；相对于媒剂(+)阿霉素，#p<0.05。这些数据证明用JQ1的BET溴结构域抑制可以使心脏免受心脏毒性化学物质，如蒽环霉素。这些数据证明在癌症疗法期间JQ1作为心脏保护剂的效用，伴随JQ1还具有抗癌特性的额外益处。

JQ1抑制病理性平滑肌细胞活化的主要特征

所有实验都用原生大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)、PDGF-bb(10ng/mL)以及JQ1(500nM)进行。JQ1回应于促效剂PDGF-bb阻断病理性平滑肌活化的标志特征，如(图14A)增殖(通过放射性标记的胸苷掺入定量)、(图14B)迁移(使用传斯维尔迁移分析定量)以及(图14C)病理性基因诱导(针对Ptgs2/Cox2显示的qRT-PCR)。这些发现证明BET溴结构域抑制针对病理性平滑肌生长的功效(每组n＝3-6；相对于媒剂，*p<0.05；相对于PDGF-bb，**p<0.05)。

讨论

目前工作暗示BET溴结构域读取蛋白作为病理学心脏重塑和心脏衰竭进程的必需调节因子。使用Brd4敲低和小分子BET抑制剂的在经培养心肌细胞中的研究确立这些蛋白质在心肌细胞肥大中的细胞自发性作用。进一步展现特异性破坏BET溴结构域与乙酰化染色质的相互作用的小分子JQ1在两个独立小鼠模型中有力地减弱病理性肥大的发展。基因表达谱分析和ChIP研究揭露BET经由其共活化重要促肥大转录网络和将PolII募集到启动子的能力调节病理性标靶的广泛程序。相比于在若干癌症中的观测结果(德尔默等人,2011；奥特等人,2012；丰岛等人,2012；朱伯等人,2011)，BET不直接调节心肌层中c-Myc的表达或功能，因此提供BET的转录功能是高度情境特异性的额外迹象。

我们的在经培养心肌细胞和小鼠心脏中的基因表达谱清楚地展现BET在心肌层中具有标靶特异性(图3和8)。给出在发展、分化以及疾病中细胞状态转变期间发生的组蛋白乙酰化中的全基因组变化(李和杨,2013)，赋予BET依赖性信号传导特异性的机制是这一快速演变领域中的重要未解决的问题。可能BET的翻译后修饰和其它蛋白质与BET的相互作用的组合在组蛋白乙酰化中的整体变化以外充当其靶基因特异性的额外决定子。最近在癌细胞方面的工作已经展现特定丝氨酸残基上的酪蛋白激酶2(CK2)对BRD4的磷酸化影响其功能上与转录因子p53相互作用并且共活化转录因子p53的能力(吴(Wu)等人,2013)。值得注意地，在小鼠中的基因研究展现CK2是心脏肥大的正调节因子(伊欧姆(Eom)等人,2011)。探索刺激偶联翻译后修饰(如BRD4的CK2介导的磷酸化)是否还在心脏中活化BET将是重要的。此外，BET共活化某些转录因子路径(例如，NFAT、GATA4、NFκB)而非其它(例如，c-Myc)的能力可能部分来源于心肌层中特定蛋白质复合物的刺激偶联形成。

除蛋白质相互作用的研究以外，限定BET全基因组在心脏中在基础对比病理性条件(例如假手术/TAC)下的染色质定位将是重要的。此处，显示BET被募集到应激诱导的靶基因的近端启动子并且促进在心肌细胞中转录起始位点处的PolII富集(图3F)。当与本文提供的基因表达谱相比时，BET、PolII以及重要乙酰基-组蛋白标记的ChIP-Seq分析将提供对在病理性应激期间发生的染色质状态的动态变化和这些变化怎样受BET溴结构域抑制影响的理解。这些染色质景观将揭露心肌BET(如BRD4)是否填充应激可诱导基因的启动子和强化子区域。此外，JQ1对遍及心脏基因组的PolII富集模式的效果将提供对BET在如重新PolII募集、在准备基因座处PolII的暂停-释放以及转录伸长的过程中的可能作用的理解(李和杨,2013)。最后，结合转录因子的在整个基因组中的BET染色质占用的生物信息学分析将极大地改进我们对这些表观遗传读取蛋白与其共活化的DNA结合因子的特定子集之间的相互作用的理解。鉴于展现BRD4在称为“超强化子”的细胞特异性、主调节强化子的子集处的突出富集的最近研究，有可能BET在推定心肌超强化子上的优先负载也在心脏衰竭期间驱动应激诱导的转录程序的选择性诱导。因为在成年小鼠心脏组织中构建全基因组染色质状态图的可行性刚出现(赛义德等人,2013)，将这一技术应用到心肌BET信号传导领域将是未来研究的令人激动的领域。

心脏衰竭的开始和进展已知经由心肌细胞、心脏成纤维细胞以及可能填充应激心肌层的其它细胞类型之间的病理学串扰发生(凡贝罗等人,2013)。虽然HF的TAC模型向心脏提供相对集中应激，并且JQ1减弱病理性重塑而无对血压或血流动力学负荷(图6C-D)的影响，我们认识到活体内BET溴结构域抑制可以不仅对心肌细胞，而且对心脏成纤维细胞和心肌层的其它细胞成分起作用。然而，我们的数据确实确定虽然所有三种BET在啮齿动物心肌细胞和心脏组织中表达，Brd4在最高水平下表达(图1A-B)。此外，经分离的培养心肌细胞中BET溴结构域抑制和Brd4敲低都减弱活体外病理性心肌细胞肥大(图2)。总的来说，这些数据鉴定BRD4在心肌细胞中的细胞自发性作用并且表明其是活体内JQ1的重要标靶。在成年小鼠中使用Brd4和其它BET家族成员的细胞类型和暂时限制靶向的未来研究将帮助注释其在心脏衰竭的实验模型中的基因和组织特异性功能。

在过去的15年，在小鼠中的基因靶向方法已经实际上提供对管理心脏肥大和衰竭的分子机制的重要理解(凡贝罗等人,2013)。在考虑BET的这类策略中，我们注意到Brd4剔除式和Brd2剔除式接合子无活力并且生殖系Brd4单倍不足引起严重发育异常(霍泽尔斯坦(Houzelstein)等人,2002)。因此，在HF成年小鼠模型中BET功能损失的基因研究将可能需要组织特异性并且可诱导的条件性方法。迄今，尚未针对BET基因中的任一个成功地产生具有条件性地靶向等位基因的小鼠。考虑在传统基因靶向的情况下遇到的概念和技术障碍，此处用于探测BET溴结构域蛋白在心脏生物学中的功能的化学生物方法具有若干优势。第一，这一方法允许我们以使用目前Cre-lox技术难以实现的暂时精度操作BET功能。第二，与使用传统基因缺失方法的基因功能永久性损失相比，化学生物方法暂时破坏BET溴结构域与染色质的相互作用。第三，不同于操作表观遗传编写者(例如，HAT)或清除者(例如，HDAC)的酶活性的策略，JQ1调节基于染色质的信号转导而不直接影响对组蛋白自身的翻译后修饰。第四，JQ1抑制在心脏中表达的所有三个BET家族成员(BRD2-4)并且因此阻断在这一家族内的功能冗余，通常混淆单基因靶向方法的现象。最后，化学生物方法展现如JQ1的小分子探针的全身递送在实验心脏衰竭中有效并且充分耐受并且表明药理学BET溴结构域抑制在这一疾病中的效用。

总之，目前工作决定性地暗示BET表观遗传读取蛋白作为驱动病理性心脏重塑和HF的转录机制的必需组件。具体来说，我们将BET鉴定为心肌层中的新标靶并且将BET溴结构域抑制鉴定为HF疗法的有前景的方法。因为JQ1似乎在心脏衰竭小鼠模型中充分耐受，我们的工作为使用类似药物的BET溴结构域抑制剂作为这一疾病中的药理学策略提供基本原理。考虑在领域中研发转录疗法的强烈兴趣(麦克金赛(McKinsey)和奥尔森(Olson),2005)，这一化学生物方法提供高阶染色质状态和染色质依赖性信号转导的调节可以用于心脏衰竭的治疗增加的原理证明。

参考文献

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张,C.L.,麦克金赛,T.A.,常,S.,安托斯,C.L.,希尔,J.A.,以及奥尔森,E.N.(2002).II类组蛋白脱乙酰基酶充当心脏肥大的信号反应性抑制剂.细胞110,479-488(Zhang,C.L.,McKinsey,T.A.,Chang,S.,Antos,C.L.,Hill,J.A.,andOlson,E.N.(2002).ClassIIhistonedeacetylasesactassignal-responsiverepressorsofcardiachypertrophy.Cell110,479-488)。

赵,M.,周,A.,鲍尔斯,J.,法哈多,G.,以及伯恩斯坦,D.(2004).小鼠中横向主动脉缩窄之后基因表达的微阵列分析。生理基因组学19,93-105(Zhao,M.,Chow,A.,Powers,J.,Fajardo,G.,andBernstein,D.(2004).Microarrayanalysisofgeneexpressionaftertransverseaorticconstrictioninmice.Physiologicalgenomics19,93-105)。

钟,W.,毛,S.,托比斯,S.,安杰利斯,E.,乔丹,M.C.,鲁斯,K.P.,菲什拜因,M.C.,德阿尔沃兰,I.M.,以及麦克莱伦,W.R.(2006).心肌细胞中的肥大生长是由Myc经由细胞周期素D2依赖性路径介导.欧洲分子生物学杂志25,3869-3879(Zhong,W.,Mao,S.,Tobis,S.,Angelis,E.,Jordan,M.C.,Roos,K.P.,Fishbein,M.C.,deAlboran,I.M.,andMacLellan,W.R.(2006).HypertrophicgrowthincardiacmyocytesismediatedbyMycthroughaCyclinD2-dependentpathway.EMBOJ25,3869-3879)。

朱伯,J.,史,J.,王,E.,拉帕波特,A.R.,赫尔曼,H.,西松,E.A.,麦贡,D.,齐,J.,布拉特,K.,文德利希,M.,等人(2011).RNAi筛选将Brd4鉴定为急性骨髓白血病中的治疗标靶.自然478,524-528(Zuber,J.,Shi,J.,Wang,E.,Rappaport,A.R.,Herrmann,H.,Sison,E.A.,Magoon,D.,Qi,J.,Blatt,K.,Wunderlich,M.,etal.(2011).RNAiscreenidentifiesBrd4asatherapeutictargetinacutemyeloidleukaemia.Nature478,524-528)。

所属领域的技术人员将根据前文描述显而易知除本文所显示和所描述的修改之外的本发明的各种修改，并且所述修改在所附权利要求书的范围内。本发明的优势和目标不一定由本发明的每个实施例涵盖。

Claims (35)

1.一种治疗心肌病的方法，其包含向需要这类治疗的个体投与有效治疗所述心肌病的量的本发明化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体无心脏衰竭。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述个体无阻塞性冠状动脉疾病的症状。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述个体不进行动脉粥样硬化的治疗。

5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述个体无阻塞性冠状动脉疾病，如通过血管造影片显示证明。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体无心脏衰竭或动脉粥样硬化并且未从心肌梗塞恢复。

7.根据权利要求1到6所述的方法，其中所述个体正接受降低血压的疗法。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述心肌病是由于慢性高血压、心脏瓣膜病(主动脉瓣膜狭窄、主动脉瓣膜关闭不全、二尖瓣关闭不全)、围生期心肌病或因基因突变所致的心肌病。

9.根据权利要求1到8所述的方法，其中所述本发明化合物是JQ1。

10.根据权利要求1到9所述的方法，其中所述心肌病是心脏肥大。

11.一种治疗不是由炎症引起的心脏衰竭的方法，其包含向需要这类治疗的个体投与有效治疗所述心脏衰竭的量的本发明化合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述个体无阻塞性冠状动脉疾病，如通过血管造影片显示证明。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述个体未从心肌梗塞恢复。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述个体未从心肌梗塞恢复。

15.根据权利要求11到14所述的方法，其中所述心脏衰竭是由于：

(i)无阻塞性冠状动脉疾病迹象的射血分数正常性心脏衰竭HFpEF；

(ii)因药物(包括抗癌剂和滥用药物)毒性所致的心脏衰竭；

(iii)由乙醇滥用所引起的心脏衰竭；

(iv)因慢性心动过速(快速心跳速率)所致的心脏衰竭；

(v)因内分泌异常(过多甲状腺激素、生长激素、糖尿病、嗜铬细胞瘤)所致的心脏衰竭；

(vi)高输出心脏衰竭(包括由贫血或周围动静脉分流所引起的心脏衰竭)；

(vii)由营养缺乏(包括硫胺、硒、钙以及镁缺乏)所引起的心脏衰竭；

(viii)因病毒感染(包括HIV)所致的心脏衰竭；或

(ix)因先天性心脏畸形所致的心脏衰竭。

16.根据权利要求11到15所述的方法，其中所述个体正接受降低血压的疗法。

17.根据权利要求11到16所述的方法，其中所述本发明化合物是JQ1。

18.一种治疗心肌梗塞的方法，其包含向需要这类治疗的个体投与呈有效治疗所述心肌梗塞的量的本发明化合物，其中所述本发明化合物投与不早于所述心肌梗塞之后5天开始。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述本发明化合物投与不早于所述心肌梗塞之后6天开始。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述本发明化合物投与不早于所述心肌梗塞之后7天开始。

21.根据权利要求18到20所述的方法，其中所述个体无动脉粥样硬化，如通过血管造影片显示证明。

22.根据权利要求18到21所述的方法，其中所述个体无心脏衰竭。

23.根据权利要求18到22所述的方法，其中所述本发明化合物是JQ1。

24.一种心脏保护的方法，其包含向接受对心脏有毒的疗法的个体投与呈有效抑制这类疗法的心脏毒性的量的BET抑制剂。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疗法是抗癌疗法。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗癌疗法是化学治疗疗法。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述化学治疗剂是选自由以下组成的群组的抗癌剂：蒽环霉素、曲妥珠单抗、5-氟尿嘧啶、米托蒽醌、太平洋紫杉醇、长春花生物碱、他莫昔芬、环磷酰胺、伊马替尼、曲妥珠单抗、卡培他滨、阿糖胞苷、索拉非尼、舒尼替尼以及贝伐单抗。

28.根据权利要求24到27所述的方法，其中所述BET抑制剂是JQ1。

29.一种抑制再狭窄的方法，其包含向经历血管成形术和/或接受支架的个体投与呈有效抑制再狭窄的量的BET抑制剂。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述BET抑制剂在狭窄部位局部投与。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述BET抑制剂经由导管投与。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述BET抑制剂作为支架上的涂层的要素投与。

33.根据权利要求29到32所述的方法，其中所述BET抑制剂是JQ1。

34.一种用于预防狭窄或再狭窄的支架，所述支架包括当所述支架位于血管处时将药剂局部递送到所述血管的涂层，改进包含所述涂层中包括的BET抑制剂。

35.根据权利要求34所述的支架，其中所述BET抑制剂是JQ1。