CN105348393A - 一种偶联抗体的合成、检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种偶联抗体的合成和应用，公开了Hα1-210-DEC205偶联抗体合成方法：包括以下步骤：①Hα1-210蛋白表达、纯化、鉴定，②DEC-205单克隆抗体，③Hα1-210-DEC205偶联抗体合成；同时公开了Hα1-210-DEC205偶联抗体的体外细胞系实验方法和在体分析方法。本发明的有益效果是不降低机体免疫力的情况下，仅抑制针对AchR的异常免疫应答，起到治疗MG的作用。

Description

一种偶联抗体的合成、检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其是涉及一种偶联抗体的合成、检测方法和应用。

背景技术

重症肌无力(myastheniagravis，MG)是由乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor，AchR)抗体介导、T细胞依赖、补体参与的神经-肌肉接头处的自身免疫性疾病，体液免疫和细胞免疫均参与其发病。引发MG症状的直接原因是B细胞产生的AchR特异性抗体，然而该抗体的产生离不开AchR特异性T细胞的辅助。实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)是研究MG发病机制及治疗手段的理想模型。

树突状细胞(dendriticcells，DC)是迄今发现功能最强的专职抗原递呈细胞，近年来的研究表明DC在诱导和维持机体免疫耐受中发挥着重要作用，尤其是未成熟DC(immaturedendriticcells，iDC)可通过多种机制诱导抗原特异性T细胞耐受，在移植免疫耐受诱导、自身免疫性疾病治疗方面，展现出其独特的应用价值。

为了寻求一种特异性的治疗MG的方法，即在不降低机体免疫力的情况下，仅抑制针对AchR的异常免疫应答，本发明从iDC入手，将MG的自身抗原-AchRα1亚单位胞外段(Hα1-210)蛋白与DC表面特异性受体-DEC205单克隆抗体偶联，合成Hα1-210-DEC205偶联抗体，体内靶向iDC，诱导AchR特异性T细胞耐受，为MG的治疗提供了新的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种偶联抗体的合成和应用，为MG及多种自身免疫性疾病的治疗提供新的思路和理论依据。

本发明的技术方案是：一种偶联抗体的合成方法，包括以下步骤：

①Hα1-210蛋白表达、纯化、鉴定：采用RT-PCR的方法从表达人AchR的细胞系TE671中扩增AchRα1亚单位胞外段基因(Hα1-210)，同原核表达载体pET16b连接，构建重组表达载体，转化BL21感受态菌，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定蛋白的表达；Ni2+亲和层析柱纯化表达的蛋白。

②DEC-205单克隆抗体纯化：MiniPerm系统中连续旋转培养分泌DEC-205，GL-117单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞，培养上清超滤浓缩后经50％饱和硫酸胺沉淀，最后经蛋白A/G亲和层析柱纯化；

③Hα1-210-DEC205偶联抗体合成：纯化后的抗体经2-巯基乙胺·盐酸还原后，同异型双功能交联剂SMCC活化的Hα1-210蛋白混合，4℃过夜连接，SDS-PAGE鉴定偶联抗体的合成；ELISA分别检测偶联后Hα1-210蛋白以及DEC-205抗体的活性。

本发明的另一方面，还包括Hα1-210-DEC205偶联抗体的体外细胞系实验方法，包括以下步骤：

①抗体标记及iDC培养：生物素标记表达纯化的Hα1-210-DEC205、Hα1-210-GL117偶联抗体以及Hα1-210；无菌取C57BL/6小鼠(B6鼠)骨髓细胞，体外诱导培养iDC；

②亲和力检测：将生物素标记的偶联抗体同iDC共孵育后以PE-Avidin染色、流式细胞仪(FlowCytometry，FCM)分析Hα1-210-DEC205与iDC的亲和力；

③体外T细胞增殖实验：通过皮下注射Hα1-210与完全弗氏佐剂(completefreund′sadjuvant，CFA)的方案免疫B6鼠构建EAMG模型；无菌取EAMG鼠脾脏和淋巴结，制备单细胞悬液，抗小鼠CD4抗体免疫磁珠分离T细胞，作为反应细胞；分别加入不同偶联抗体与丝裂霉素C预处理的iDC共孵育体系，BrdU掺入法分析T细胞的增殖；

④凋亡检测：FITC-AnnexinV/PI染色分析T细胞的凋亡；

⑤细胞因子的检测：ELISA检测培养上清中IFN-γ、TGF-α、IL-2、IL-4、IL-10等相关细胞因子的表达。

本发明的另一方面，还包括Hα1-210-DEC205偶联抗体在体分析方法，包括以下步骤：

①体内靶向iDC：将生物素标记的不同偶联抗体皮下注射EAMG动物模型，注射后24h，无菌取小鼠腹股沟淋巴结，制作冰冻切片，Avidin-PE(red)染色，同时结合FITC标记抗CD11c、抗B220、以及抗CD3的抗体染色(green)，激光扫描共聚焦显微镜观察Hα1-210-DEC205偶联抗体对iDC的靶向性；

②EAMG病情影响：偶联抗体同上治疗4周后评估EAMG症状的变化；ELISA法检测血清抗AchR抗体水平；

③免疫耐受检测：取引流淋巴结体外培养，抗CD11C抗体免疫磁珠分离DC并鉴定其表型；抗CD4抗体分离T细胞并分别给予相关刺激后观察AchR特异性T细胞免疫耐受；培养细胞以CD4、CD25抗体标记后，FCM分析Treg细胞的含量；

④长期治疗作用观察：偶联抗体同上作用后继续饲养EAMG小鼠2月，观察其长期治疗作用、测定AchR抗体水平、观察神经肌接头超微结构变化。

本发明的另一方面，还包括Hα1-210-DEC205偶联抗体在自身免疫性疾病的治疗上的应用。

优选的，还包括Hα1-210-DEC205偶联抗体在MG治疗上的应用，可体内靶向iDC，诱导AchR特异性免疫耐受的形成。

本发明具有的优点和积极效果是：本发明通过化学的方法将Hα1-210与DC表面特异性受体-DEC205单克隆抗体偶联，合成Hα1-210-DEC205偶联抗体，体内靶向iDC，使其有效摄取、递呈抗原给AchR特异性T细胞，在与T细胞相互作用时通过使T细胞发生无能、凋亡或激活调节T细胞以及表型转移等机制诱导AchR特异性免疫耐受的形成。

附图说明

图1是重组载体pET16b-Hα1-210构建。

图2是蛋白纯化的SDS-PAGE分析

图3是ELISA检测Hα1-210蛋白的活性

图4是C57BL/6小鼠EAMG症状的评估

图5是EAMG大鼠血清抗体水平测定

图6是DC扫描电镜图像

图7是FCM分析、DC表型鉴定

图8是EAMG小鼠血清中anti-R97-116IgG水平。

图9是EAMG小鼠血清中anti-AChRα亚基IgG水平。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明。

本发明的一种偶联抗体的合成，包括以下步骤：

(1)基因克隆：培养表达人AchR的细胞系TE671，Trizol提取细胞总mRNA，Invitrogen反转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增AchRα1亚单位胞外段(Hα1-210)基因片段上游引物：5’GCGCATATGTCCGAACATGAGACCCGTCT3’，下游引物：5’ATCGGATCCTCCAGGCGCTACATGACGAAGT3’(下划线分别为NdeI和BamHI的酶切位点)。

(2)载体构建：将上述基因片段和pET16b原核表达载体以NdeI和BamHI酶切后，按照载体∶片段≈1∶5的比例，使用T4DNA连接酶于16℃过夜连接目的片段与载体。将连接产物转化DH5α菌株，挑取阳性菌落培养后，取菌液小提质粒，NdeI和BamHI双酶切及测序鉴定片段正确。

(3)Hα1-210蛋白表达、鉴定和纯化：选取鉴定正确的如图1所示的重组载体pET16b-Hα1-210，转化BL21(DE3)pLysS感受态菌，转化产物涂布于含100mg/L氯霉素(Cam)、100mg/L氨苄青霉素(Amp)双抗的2×YT琼脂平板上，倒置平皿37℃孵育10h；随机挑取5个阳性转化子接种于5mL含100mg/LCam和100mg/LAmp的2×YT培养液，于37℃、240rpm(振摇直径200mm)培养至OD值为0.6，加入IPTG37℃诱导4h。诱导前后菌液分别离心后冰浴超声裂菌。如图2所示，裂菌后上清及沉淀分别制样进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白是否诱导表达；Ni2+亲和层析柱纯化表达的蛋白，SDS-PAGE进一步鉴定Hα1-210蛋白的表达，并用Bradford蛋白定量法检测蛋白浓度；用对Hα1-210蛋白空间构象高度依赖的抗体mAb35，如图3所示，通过间接ELISA检测蛋白的活性，Hα1-210蛋白与mAb35特异性结合，提示重组蛋白具有正确空间构象。

(4)NLDC-145、GL-117抗体纯化：分泌DEC-205单克隆抗体(NLDC-145)的大鼠杂交瘤细胞系HB290以及DEC-205同型对照抗体(GL-117)的杂交瘤细胞系购自美国ATCC公司，复苏后用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，在MiniPerm(Heraeus，Gemeny)系统中连续旋转培养，至培养液变黄后，收获大量培养上清。使用PM10膜(Amicon，Danvers，USA)超滤浓缩培养上清10～20倍，浓缩上清经50％饱和硫酸胺沉淀，4℃、15000r/min离心，PBS溶解沉淀物，溶解液置PBS透析24h，其间换液6次，最后将待纯化的样品经蛋白A/G亲和层析柱纯化，ELISA检测抗体的活性。

(5)Hα1-210-DEC205偶联抗体的合成：将纯化后的抗体经2-巯基乙胺盐酸盐(2-mercaptoethylamineHCL，MEA)还原，通过凝胶过滤柱清除多余的还原剂；用异型双功能交联剂Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC；Pierce)活化表达的Hα1-210蛋白，然后将二者混合，4℃过夜连接。连接产物经凝胶过滤柱清除未反应应的交联剂SMCC，并用蛋白A/G亲和层析柱去除未偶联的蛋白。SDS-PAGE分别检测偶联后Hα1-210蛋白以及DEC-205抗体的活性。

本发明的另一方面，体外细胞系实验观察、分析Hα1-210-DEC205对iDC的亲和力及诱导免疫耐受的作用：

①偶联抗体标记和iDC培养：生物素标记表达纯化的Hα1-210蛋白和偶联抗体Hα1-210-DEC205、Hα1-210-GL117；从B6鼠骨髓中诱导培养iDC。颈椎脱臼处死B6鼠，无菌手术取出股骨和胫骨，PBS冲洗骨髓腔直至变白，骨髓悬液经400目滤网过滤去除组织碎片，用红细胞裂解液Tris-NH4Cl去红细胞，不完全RPMI1640培养基洗涤2次，以含GM-CSF和IL-10质量浓度各10ng/L的完全RPMI1640培养基调整细胞浓度为2×106个/ml，置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每2d换液1次以移去悬浮生长的细胞克隆，并补充同体积的新鲜培养基和相同浓度的细胞因子，培养6d用倒置显微镜观察DC的形态，如图6所示，可见细胞表面存在大量皱褶和不规则突起，如图7所示并通过FCM对细胞表型进行鉴定。检测结果显示DC特征性表型：高表达MHCI，MHCII类分子，共刺激分子等，低表达单核细胞标志CD14。表型结果为：HLA-ABC为95.5％，HLA-DR为92.9％，CD86为86.7％，CD83为27.6％，CD14为14％(图7)；以FITC标记的抗小鼠MHC-II、CD80、CD86抗体FCM分析细胞表面分子的表达，对DC未成熟表型进行鉴定；抗小鼠NLDC-145抗体鉴定DC细胞表面DEC-205受体的表达。

②Hα1-210-DEC205偶联抗体对iDC的亲和力：将生物素标记的偶联抗体Hα1-210-DEC205同体外诱导培养的iDC共孵育，以Hα1-210、Hα1-210-GL117为对照，孵育结束后以Avidin-PE染色，FCM分析偶联抗体同iDC的亲和力，提示融合单链抗体与iDC具有较高亲和力。

③混合淋巴细胞反应分析Hα1-210-DEC205对T细胞增殖的影响：体外诱导培养B6小鼠的iDC，用浓度为25μg/ml的丝裂霉素C于37℃灭活30min作为刺激细胞；将亲和纯化的Hα1-210蛋白混合完全弗氏佐剂免疫B6鼠构建EAMG主动免疫模型；无菌取EAMG小鼠脾脏和淋巴结，制备单细胞悬液，抗小鼠CD4抗体免疫磁珠分离T细胞，经BrdU标记后作为反应细胞；将反应细胞分别加入偶联抗体Hα1-210-DEC205与iDC共孵育体系，以Hα1-210、Hα1-210-GL117为对照，48小时后抗BrdU抗体染色，FCM分析T细胞的增殖。

④AnnexinV/PI分析Hα1-210-DEC205诱导T细胞凋亡：将免疫磁珠分离的T细胞加入偶联抗体Hα1-210-DEC205、Hα1-210-GL117、Hα1-210与丝裂霉素C预处理的iDC共孵育体系，孵育结束后，FITC-AnnexinV/PI染色，FCM分析T细胞的凋亡。

⑤细胞因子的检测：偶联抗体Hα1-210-DEC205、Hα1-210-GL117、Hα1-210与丝裂霉素C预处理的iDC共孵育体系中加入T细胞共培养，48h后ELISA检测培养上清中IFN-γ、TGF-αIL-2、IL-4、IL-10等相关细胞因子的表达。

本发明的另一方面：在体分析Hα1-210-DEC205诱导免疫耐受及对EAMG的治疗作用：

①EAMG动物模型的构建、评估及分组：

(一)小鼠EAMG模型的建立：

将50μgR97-116肽段溶于100μl无菌PBS，1mgH37RA/rat溶于100μlCFA，用匀浆机将两者混匀为油包水样，直至抗原乳剂在水中不分离。将20只C57BL/6野生雌性小鼠随机分为两组，实验组小鼠第0天，后肢足垫和肩胛部皮下注射抗原乳剂200μl，对照组小鼠同样部位皮下注射无R97-116肽段的乳剂。皮下注射时应尽量避开脚底血管，缓慢注射并在注射完毕后静置1min，防止皮内的抗原乳液随着针头拔出而流出来。第30天，60天实验组小鼠皮下注射抗原乳剂(50μgR97-116，100μl无菌PBS，100μlIFA)，对照组小鼠注射无抗原的乳剂(100μl无菌PBS和100μlIFA)。第二次免疫之后，每周称小鼠体重，参照FulvioBaggi的评分标准，两人以上同一时间评估EAMG的发病情况。小鼠在R97-116造模前，造模后取血清。

肌无力分级如下：

0级：正常肌力和无异常状态。

1级：活动中等减少，无力抓握和嘶鸣，运动试验(在鼠笼上连续抓爬30s)后症状明显：低头，弯腰弓背，肌肉震颤，肌力下降。

2级：没有进行运动试验，症状明显：低头，弯腰弓背，肌肉震颤，肌力下降。

3级：没有进行运动实验，症状很明显而且无力，濒死。

4级：死亡。

R97-116抗体检测：

1)5μgR97-116多肽溶于100μl包被缓冲液，然后包被在96孔ELISA板4℃过夜。

2)移去各孔内的液体，拍干，用200μlELISA封闭液室温封闭1h。

3)小鼠血清用PBS稀释200倍，每孔加入100μl稀释的小鼠血清室温孵育2h。

4)PBS/Tween20洗3遍，拍干，加入100μlGoatAnti-MouseIgG(1∶5000倍稀释)室温孵育1h。

5)移去各孔内的液体，拍干，ABTS显色，1％SDS终止，405nm处测OD值。

小鼠AchRα1亚基抗体检测

按照说明书进行操作，样本处理，配置试剂，每个样本设置复孔。

1)按照说明书进行标准品稀释与加样。

2)加样：分别设空白孔、待测样品孔。加样时尽量不触及孔壁，将样品加于孔的底部，轻轻震动混匀。

3)温育：室温孵育30min。

4)洗涤：弃去液体，拍干，洗涤液洗5遍，拍干。

5)加酶：除空白孔外，每孔加入酶标试剂50μl，温育30min。

6)显色：洗涤液洗5遍，拍干。加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震动混匀，37℃避光显色15min。

7)终止：每孔加入终止液50μl，终止反应。

8)测定：450nm处测OD值。

本实验采用R97-116肽段混合弗氏佐剂，在小鼠后肢脚垫部和肩胛部皮下注射。从第二次免疫后，部分小鼠出现不同程度的肌力减低，弯腰弓背，体重减轻，有些小鼠不需运动试验就会出现抓握无力，活动明显减少。自第三次免疫后，小鼠症状逐渐加重，有些小鼠明显体重减轻，毛发粗糙，甚至出现瘫痪、濒死。EAMG发病小鼠：活动明显减少，弓腰弯背，头低，毛色粗糙。EAMG未发病小鼠：活动正常，毛发发亮。第三次免疫观察一个月后，EAMG的成功率约为50％。如表1所示：

表1EAMG小鼠临床症状评分

Note：表1：第二次免疫之后，参照FulvioBaggi的评分标准，每周两人以上同一时间评估EAMG的发病情况。

(二)EAMG小鼠血清中抗R97-116抗体的变化

R97-116肽段免疫注射前及第三次免疫注射后取小鼠血清，ELISA板包裹R97-116肽段比较小鼠血清中anti-R97-116IgG浓度变化。如图6所示，与造模前相比，造模后血清中anti-R97-116IgG浓度明显升高，说明小鼠体内产生了较强的anti-R97-116IgG。

小鼠造模前后分别取血清，ELISA检测EAMG小鼠造模前后血清中anti-R97-116IgG分泌水平。

(三)EAMG小鼠血清中anti-AChRα1亚基抗体的变化

取EAMG造模前后的血清，按照MouseAChRabElisakit说明书操作，如图9所示，与造模前相比，造模后小鼠体内anti-AChRα1亚基抗体浓度明显升高，说明造模后小鼠自身主动产生了针对AChRα1亚基的抗体。

从EAMG小鼠体内抗体的变化及临床症状的改变等结果表明EAMG小鼠造模成功。

②Hα1-210-DEC205体内靶向iDC：将生物素标记的偶联抗体Hα1-210-DEC205皮下注射EAMG动物模型，以Hα1-210、Hα1-210-GL117为对照，注射后24h，无菌取小鼠腹股沟淋巴结，制作冰冻切片，丙酮常温固定5min，自然干燥后湿盒内染色。PE-Avidin染色，同时结合FITC标记抗CD11c、抗B220、以及抗CD3的抗体染色，采用叠加法，激光扫描共聚焦显微镜观察偶联抗体对iDC的靶向性，Hα1-210-DEC205不能与B细胞结合，也不能结合到CD3阳性的T细胞。但是AChRα1-scFv205结合到的细胞和CD11C标记的DC重叠，说明AChRα1-scFv205结合到DC。

③Hα1-210-DEC205对EAMG小鼠肌无力症状的影响：将偶联抗体Hα1-210-DEC205以20μg/只皮下注射EAMG小鼠，对照组给予同等剂量的Hα1-210、Hα1-210-GL117，每周3次，共4周；结合上述评估指标，比较分析不同治疗组间在EAMG症状上的差别；每周通过尾静脉取血，留取血清标本，ELISA法检测小鼠外周血抗AchR抗体水平。

④Hα1-210-DEC205对EAMG小鼠免疫耐受的诱导：偶联抗体同上治疗4周后处死小鼠，取引流淋巴结体外培养，抗CD11C抗体免疫磁珠分离小鼠淋巴结DC细胞，以FITC标记的抗小鼠MHC-II、CD80、CD86抗体FCM鉴定DC未成熟表型；抗CD4抗体免疫磁珠分离小鼠淋巴结T细胞，分别给予Hα1-210、PBS、ConA刺激，BrdU掺入法检测T淋巴细胞增殖反应；同时检测细胞培养上清中IFN-γ、TGF-α、IL-2、IL-4、IL-10等相关细胞因子的表达；培养细胞以CD4、CD25抗体标记后，FCM分析Treg细胞的含量。

⑤Hα1-210-DEC205治疗作用的长期观察：偶联抗体同上作用后继续饲养EAMG小鼠2月，观察小鼠饮食、体重、活动性等一般指标；每两周尾静脉取血检测抗AchR抗体水平，继续观察EAMG症状指标；同时，透射电镜观察动物模型神经肌接头超微结构变化，如突触后膜表面积、乙酰胆碱受体的数量等；免疫电镜观察神经肌接头处补体C3以及免疫复合物的沉积情况。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (5)

1.一种偶联抗体的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

①Hα1-210蛋白表达、纯化、鉴定：采用RT-PCR的方法从表达人AchR的细胞系TE671中扩增AchRα1亚单位胞外段基因Hα1-210，同原核表达载体pET16b连接，构建重组表达载体，转化BL21感受态菌，IPTG诱导表达；

②DEC-205单克隆抗体纯化：MiniPerm系统中连续旋转培养分泌DEC-205，GL-117单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞，培养上清超滤浓缩后经50％饱和硫酸胺沉淀，最后经蛋白A/G亲和层析柱纯化；

③Hα1-210-DEC205偶联抗体合成：纯化后的抗体经2-巯基乙胺·盐酸还原后，同异型双功能交联剂SMCC活化的Hα1-210蛋白混合，4℃过夜连接。

2.Hα1-210-DEC205偶联抗体的体外细胞系实验方法，其特征在于：包括以下步骤：

①抗体标记及iDC培养：生物素标记表达纯化的Hα1-210-DEC205、Hα1-210-GL117偶联抗体以及Hα1-210，无菌取C57BL/6小鼠(B6鼠)骨髓细胞，体外诱导培养iDC；

②亲和力检测：将生物素标记的偶联抗体同iDC共孵育后以PE-Avidin染色、流式细胞仪(FlowCytometry，FCM)分析Hα1-210-DEC205与iDC的亲和力；

③体外T细胞增殖实验：通过皮下注射Hα1-210与完全弗氏佐剂(completefreund′sadjuvant，CFA)的方案免疫B6鼠构建EAMG模型；无菌取EAMG鼠脾脏和淋巴结，制备单细胞悬液，抗小鼠CD4抗体免疫磁珠分离T细胞，作为反应细胞；分别加入不同偶联抗体与丝裂霉素C预处理的iDC共孵育体系，BrdU掺入法分析T细胞的增殖；

④凋亡检测：FITC-AnnexinV/PI染色分析T细胞的凋亡；

⑤细胞因子的检测：ELISA检测培养上清中IFN-γ、TGF-α、IL-2、IL-4、IL-10等相关细胞因子的表达。

3.Hα1-210-DEC205偶联抗体在体分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

①体内靶向iDC：将生物素标记的不同偶联抗体皮下注射EAMG动物模型，注射后24h，无菌取小鼠腹股沟淋巴结，制作冰冻切片，Avidin-PE(red)染色，同时结合FITC标记抗CD11c、抗B220、以及抗CD3的抗体染色(green)，激光扫描共聚焦显微镜观察Hα1-210-DEC205偶联抗体对iDC的靶向性；

②EAMG病情影响：偶联抗体同上治疗4周后评估EAMG症状的变化；ELISA法检测血清抗AchR抗体水平；

③免疫耐受检测：取引流淋巴结体外培养，抗CD11C抗体免疫磁珠分离DC并鉴定其表型；抗CD4抗体分离T细胞并分别给予相关刺激后观察AchR特异性T细胞免疫耐受；培养细胞以CD4、CD25抗体标记后，FCM分析Treg细胞的含量；

④长期治疗作用观察：偶联抗体同上作用后继续饲养EAMG小鼠2月，观察其长期治疗作用、测定AchR抗体水平、观察神经肌接头超微结构变化。

4.Hα1-210-DEC205偶联抗体在自身免疫性疾病的治疗上的应用。

5.根据权利要求4所述的Hα1-210-DEC205偶联抗体在自身免疫性疾病的治疗上的应用，其特征在于：Hα1-210-DEC205偶联抗体在MG疾病的治疗上的应用，Hα1-210-DEC205偶联抗体可体内靶向iDC，诱导AchR特异性T细胞耐受。