CN105343180B - 香椿子多酚的提取方法及治疗帕金森病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明适用于天然产物提取工艺技术领域，提供了一种香椿子多酚提取方法及治疗帕金森病的用途，包括以下步骤：A：将香椿子破碎处理，过药筛得到香椿子药粉；B：将得到的香椿子药粉加入石油醚，常压水浴回流提取得到药渣，将药渣中的溶剂挥发掉后进行低温烘干处理，使所述药渣含水量控制在3％；C：将步骤B得到的香椿子药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，提取香椿子多酚。本发明提供的提取方法可以高效的提取香椿子中的多酚，香椿子多酚具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、神经保护、抗高血压及糖尿病等多种生物学功能，对治疗帕金森病有一定的作用。

Description

香椿子多酚的提取方法及治疗帕金森病的用途

技术领域

本发明涉及天然产物提取工艺领域，尤其涉及一种香椿子多酚的提取方法及治疗帕金森病的用途。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种严重危害中老年人健康的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元渐进性变性、死亡，在临床症状出现时往往已丧失达70-80％，残余的神经元仍继续发生变性，导致纹状体中PD的特征性神经递质DA含量明显减少。临床表现除了有静止性震颤、肌僵直、随意运动减慢及姿势、步态异常等运动症状外，还伴发有非运动症状(non-motor symptoms，NMS)，包括感觉障碍、睡眠障碍、神经精神障碍以及自主神经功能障碍。在65岁以上人群中发病率约为1-3％，目前全世界已有约400万PD患者，预计到2030年可能会增加一倍。该病具有发病率高、病程长、致残率高、治疗效果差、费用昂贵等特点，给家庭和社会带来巨大的危害和负担。

PD病因不清，可能与环境、遗传、老化等多种因素有关；PD发病机理尚不明确，可能与神经免疫炎症、氧化应激、线粒体功能障碍、神经营养因子不足、兴奋性氨基酸毒性作用、蛋白酶体功能异常等有关，是多种因素协同作用的结果。目前的研究结果表明，氧化应激和神经炎症所引起的连锁反应是PD黑质DA能神经元受损的核心病理环节。

PD病程长达十几到几十年，尚无令人满意的治疗手段。目前，PD的治疗方法大多限于通过调节神经递质或受体来恢复多巴胺水平，如通过增加多巴胺的水平(例如，左旋多巴或多巴胺激动剂)或防止其降解(MAO-B抑制剂)。尽管这些治疗方法有代偿性保护作用，但没有解决氧化应激、神经炎症和线粒体损伤这些导致细胞死亡的潜在因素。以深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS)为代表的手术治疗取得了的快速进展，但其手术多种禁忌阻碍了DBS的普及推广。神经营养因子对于维持神经元的存活、阻止神经元的变性和受损神经元的修复与再生均具有至关重要的作用，被公认是PD等神经退行性疾病预防和治疗 的希望所在，但由于神经营养因子都是大分子蛋白质，不能透过血脑屏障，严重限制了其在临床的应用。因此，PD作为一种慢性，进行性和多因素神经系统疾病，如能发现具有抗神经免疫炎症、抗氧化应激及促进星形胶质细胞产生神经营养因子的多靶点的小分子物质，从而保护DA能神经元，延缓疾病不断恶化的结局，将可能从根本上解决PD治疗这一医学难题。

香椿子又名椿树子，为香椿的干燥果实。近年来有关香椿的药理作用有不少报道，香椿的药用价值主要来源于香椿嫩叶、老叶、籽以及其它部位含有的类黄酮、槲皮素、皂苷和多酚等化合物；新近的研究表明多酚类能促进中枢神经系统细胞的分化和轴突生长，并能对抗神经毒素引起的炎症损伤。研究发现，香椿子总多酚具有明显的抗炎作用，能减轻大鼠心肌缺血再灌注时的形态学损伤，减轻炎症细胞浸润，具有抗迁移作用，有助于动脉粥样硬化的预防。另外，香椿提取物也有较强的抗细胞凋亡作用。基于此，本实验利用PD细胞模型探究了香椿子多酚提取物(polyphenols from T.sinensis seeds,PTSS)对神经毒素6-OHDA诱导的细胞炎症和细胞凋亡的预防作用。中脑黑质DA能神经元的丢失是PD的主要病理特点，用免疫组化方法测定PD患者死亡后脑组织时发现，Caspase-3阳性神经元的表达与中脑DA能神经元的丢失呈正相关。Kuida等发现Caspase-3缺乏的小鼠在中枢神经系统发育过程中发生的大量细胞凋亡，由此表明Caspase-3在诱导神经细胞凋亡中起重要作用。Ochu等人用一定浓度6-OHDA处理PC12细胞后，Caspase-3蛋白酶抑制剂能抑制6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡。Hartmann等研究提示Caspase-3是PD患者和PD动物模型黑质多巴胺能神经元凋亡的易感因子和最终效应器。

神经炎症、氧化应激和线粒体损伤等在黑质DA能神经元凋亡的发生过程中既可单独启动，又可联合作用，是许多因素诱导凋亡的共同通路。这几种机制常常是互相联系、互为因果的，黑质DA能神经元凋亡的细胞内部调控是一个极其复杂的过程，Caspase-3充当了重要的角色，其核心环节可能是内外环境的毒素、氧自由基、活性离子抑制线粒体呼吸链复合酶I，使细胞的ATP和GSH减少，破坏了钙离子平衡，造成钙超载，导致呼吸链产生自由基增多，伴有小胶质细胞激活炎性因子大量产生，并激活Caspase-3，最终引起DA能神经元的凋亡。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以 改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种香椿子多酚的提取方法及治疗帕金森病的用途，其方法可以高效的提取香椿子中的多酚，香椿子多酚具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、神经保护、抗高血压及糖尿病等多种生物学功能，对治疗帕金森病有一定的作用。

为了实现上述目的，本发明提供一种香椿子多酚的提取方法及治疗帕金森病的用途。其提取方法包括以下步骤：步骤A：将香椿子破碎处理，过药筛得到香椿子药粉；步骤B：将得到的香椿子药粉加入石油醚，常压水浴回流提取得到药渣，将药渣中的溶剂挥发掉后进行低温烘干处理，使所述药渣含水量控制在3％；步骤C：将步骤B得到的香椿子药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，提取香椿子多酚。

根据本发明的香椿子多酚的提取方法，所述步骤A之前还包括：将所述香椿子干燥处理。

根据本发明的香椿子多酚的提取方法，所述步骤B中，回流次数为2次，第一次回流时间为1.5h，第二次回流时间为1h。

根据本发明的香椿子多酚的提取方法，所述步骤A中，所述药筛为100目。

根据本发明的香椿子多酚的提取方法，所述步骤B中，所述低温烘干处理为在低温40℃下烘干3h。

根据本发明的香椿子多酚的提取方法，所述步骤C具体为：将步骤B得到的香椿子药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，控制乙醇的含量为30％～70％，香椿子药渣与所述乙醇的液料比为10:1mL/g～50:1mL/g，提取时间为5min～25min，提取功率为100w～300w，提取香椿子多酚。

根据本发明的香椿子多酚的提取方法，所述步骤C具体为：将步骤B得到的香椿子药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，控制乙醇的含量为43％，香椿子药渣与所述乙醇的液料比为19:1mL/g，提取时间为13min，提取功率为211w，提取香椿子多酚。

本发明还提供一种根据上述方法提取得到的香椿子多酚。

本发明还提供了香椿子多酚在治疗帕金森病中的用途。

本发明通过一种香椿子多酚的提取方法及治疗帕金森病的用途，其方法可以高效的提取香椿子中的多酚，香椿子多酚具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、神经保护、抗高血压及糖尿病等多种生物学功能，流式细胞仪检测PTSS可以减少6-OHDA引起的细胞早期凋亡，对细胞产生明显的保护作用，对治疗帕金森病有一定的作用。

附图说明

图1没食子酸标准曲线；

图2乙醇体积分数对香椿子多酚提取率的影响；

图3液料比对香椿子多酚提取率的影响；

图4提取时间对香椿子多酚提取率的影响；

图5提取功率对香椿子多酚提取率的影响；

图6乙醇体积分数与液料比交互作用；

图7乙醇体积分数与时间交互作用；

图8乙醇体积分数与功率交互作用；

图9液料比与提取时间交互作用；

图10液料比与提取功率交互作用；

图11提取时间与提取功率交互作用；

图12 PTSS和6-OHDA对PC12细胞存活状态的影响；其中，A：对照组；B：PTSS组；C：6-OHDA组；1：加入PTSS或6-OHDA后6h；2：加入PTSS或6-OHDA后12h；3：加入PTSS或6-OHDA后24h；4：加入PTSS或6-OHDA后48h.Bar＝100μm；

图13不同浓度PTSS预处理后对6-OHDA诱导PC12细胞凋亡的影响；

其中，A：PTSS+6-OHDA组(20μmol/L PTSS预处理)；B：PTSS+6-OHDA组(100μmol/LPTSS预处理)；C：PTSS+6-OHDA组(200μmol/L PTSS预处理)；PTSS+6-OHDA组：1：加入PTSS后6h；2：加入PTSS后12h；3：加入PTSS后24h；4：加入PTSS后48h.Bar＝100μm；

图14 PTSS抗6-OHDA诱导的PC12细胞毒性作用；

其中，^aP<0.05vs model group ^bP<0.05vs model group；

图15 PTSS对6-OHDA介导PC12细胞凋亡的影响；

其中，A：对照组；B:6-OHDA组；C：PTSS+6-OHDA(20μmol/L)组； D：PTSS+6-OHDA(100μmol/L)组；E：PTSS+6-OHDA(200μmol/L)组；

图16免疫组化观察caspase-3、TNF-α、COX-2指标的变化。

其中，A：对照组；B：6-OHDA组；C：PTSS组；1：Caspase-3，2：TNF-α，3：COX-2，Bar＝100μm。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种香椿子多酚的提取方法，包括以下步骤：步骤A：将香椿子破碎处理，过药筛得到香椿子药粉；步骤B：将得到的香椿子药粉加入石油醚，常压水浴回流提取得到药渣，将药渣中的溶剂挥发掉后进行低温烘干处理，使所述药渣含水量控制在3％；步骤C：将步骤B得到的香椿子药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，提取香椿子多酚。其中，用到的实验设备有UV-2000紫外可见分光光度计、真空泵、SCIENTZ-ⅡD超声波细胞破碎机和AL104电子分析天平。

在实施本发明所提供的香椿子多酚的具体提取方法之前首先建立和制备标准曲线：

精密量取0.2mg/ml没食子酸标准溶液0μl、20μl、50μl、100μl、150μl、200μl、250μl，加蒸馏水补足至250μl。加入福林酚试剂0.4ml，摇匀，静置1min，再加入10％碳酸钠试液0.4ml，蒸馏水4.0ml，摇匀，显色20min，在波长760nm处测定各管吸光度。以没食子酸对照品含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

再次，按以下步骤对香椿子多酚进行提取，步骤A：将香椿子破碎处理，过药筛得到香椿子药粉；步骤B：将得到的香椿子药粉加入石油醚，常压水浴回流提取得到药渣，将药渣中的溶剂挥发掉后进行低温烘干处理，使所述药渣含水量控制在3％；步骤C：将步骤B得到的香椿子药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，提取得到香椿子多酚。

具体的，称取适量干燥香椿子，使用万能粉碎机破碎5min，过100目药筛；取香椿子药粉，将得到的香椿子药粉加入石油醚，水浴常压回流提取两次得到 药渣，分别为1.5h，1h；将药渣中的溶剂挥发掉后进行低温烘干处理，具体为40℃低温烘干3h，使含水量为3％，密闭保存备用。

精确称取2g香椿子药渣，将药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，分别设置乙醇体积分数(30％、40％、50％、60％、70％)，液料比(10:1mL/g、20:1mL/g、30:1mL/g、40:1mL/g、50:1mL/g)，提取时间(5min、10min、15min、20min、25min)以及提取功率(100w、150w、200w、250w、300w)对多酚进行多次提取操作。

进一步的，本发明还可采用响应面法对多酚超声提取工艺的参数进行优化。在单因素基础上，选用Box﹣Benhnken Design设计实验，每个因素各取三个水平，以香椿子多酚提取量为评价指标，Design-Expert软件建模，进行工艺优化研究。

本发明进行多酚提取工艺优化的实验结果如下：

以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制没食子酸的标准曲线，方程为y＝0.513x+0.0031,r＝0.9996，说明没食子酸在0～2.0mg/mL范围线性关系良好，见图1。

实验数据及处理结果，如实施例1～实施例20所示。

其中实施例1～实施例5是乙醇体积分数对香椿子多酚提取量的实验结果：

在其他条件不变的情况下，分别设置乙醇体积分数为30％、40％、50％、60％、70％，作为实施例1～实施例5进行实验，对香椿子多酚提取率随乙醇体积分数的变化作图，如图2。

由图2可知：多酚提取量随乙醇体积分数增大先增加后减小，在50％时达到最大值。基于此，暂定50％乙醇作为提取溶剂。

其中实施例6～实施例10为液料比对香椿子多酚提取量的实验结果：

在其他条件不变的情况下，分别设置液料比为10:1mL/g、20:1mL/g、30:1mL/g、40:1mL/g、50:1mL/g，作为实施例6～实施例10进行实验，对香椿子多酚提取率随液料比的变化作图，如图3。

由图3可知：多酚提取量随液料比增加先提高后降低，在20:1mL/g时达最大值，为9.84mg。基于此，暂定液料比为20:1mL/g。

其中，实施例11～实施例15为提取时间对香椿子多酚提取量的实验结果：

在其他条件不变的情况下，分别设置提取时间为5min、10min、15min、20min、25min，作为实施例11～实施例15进行实验，对香椿子多酚提取率随提取时间的变化作图，如图4。

由图4可知：多酚提取量提取时间延长先增大再减小，在15min时达最大值。基于此，暂定提取时间为15min。

其中，实施例16～实施例20为超声提取功率对香椿子多酚提取量的实验结果：

在其他条件不变的情况下，分别设置超声功率为100w、150w、200w、250w、300w，作为实施例16～实施例20进行实验，对香椿子多酚提取率随超声功率的变化作图，如图5。

由图5可知：多酚提取量随超声功率增加先变大再减小，在200w时达最大值。基于此，暂定提取功率为200w。

本发明提供的响应面法对香椿子多酚的提取工艺优化结果如下：

1、Box﹣Benhnken设计方案

选取体积分数(A)、液料比(B)、提取时间(C)、提取功率(D)为考察变量，以多酚提取量为响应值，进行四因素三水平实验，Design﹣Expert软件优化超声辅助提取参数，因素和水平见表1，设计方案见表2。

表1 试验因素水平表

表2 实验设计方案及结果

2、模型方程构建

应用Design﹣Expert软件进行二多元回归拟合及回归模型方差分析，见表3，所得二次多项回归方程为：Y＝2.59-0.12A+0.095B+0.009C+0.17D+0.015AB+0.21AC+0.013AD+0.12BC+0.2BD-0.29CD-0.15A2-0.35B2-0.27C2-0.46D2。

表3 方差分析的回归方程

^*P＜0.05

^**P＜0.01

^***P＜0.0001

回归方程F值为152.55，P<0.0001，表明回归模型具有显著性；相关系数R2＝0.9935，说明模型拟合程度较好；校正复相关系数R2Adj＝0.9870，说明该模型可解释98.70％响应值变化，但不能解释总变异的1.30％。体积分数、液料比、时间、功率对香椿子多酚提取量影响顺序为：提取功率>体积分数>液料比>提取时间。

3、响应曲面分析

根据回归方程绘制等高线及响应面图，见图6。在一定浓度范围内，响应值随因素的不断增大而增加，当响应值达到极大值时，响应值随因素的增大而减小。由图6的B、D、E、G、H、I、J、K、L可知，AC、BC、BD、CD四者交互作用的等高线呈椭圆形，且响应面图中曲面陡峭，表明其对多酚的提取量有显著影响。

4、工艺优化

通过响应曲面图及Design﹣Expert分析，超声辅助提取香椿子多酚工艺条件：乙醇体积分数为43.12％，液料比为19.03：1mL/g，提取时间为12.55min，提取功率为211.35w，理论提取率为2.64mg/g。考虑实验可操作性，采取如下条件，即实施例21：乙醇体积分数为43％，提取功率211W，提取13min，液料比为19:1mL/g。

5、工艺验证

精密称量同一批香椿子5份，按优化条件提取香椿子多酚，平均提取率为2.63mg/g，相对于预测值误差为-0.38％，表明响应面优化超声辅助提取香椿子多酚工艺稳定可靠，具有一定应用价值。

本发明在香椿子多酚提取方法的基础上，对其用途特别是在帕金森病的治疗上有一定的作用，香椿子及其香椿子多酚具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、神经保护、抗高血压及糖尿病等多种生物学功能，通过实验来验证香椿子多酚在治疗帕金森病上的用途。

本实验在建立神经毒素6-OHDA诱导PC12细胞PD模型的基础上，应用MTT法、流式细胞仪检测技术和免疫组织化学染色等实验方法研究香椿子多酚提取物(polyphenols fromT.sinensis seeds,PTSS)对6-OHDA损伤PC12细胞的抗炎及抗凋亡作用，为中药治疗PD提供新思路。

本实验用到的材料为试剂PTSS、PC12细胞株、改良型RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、MTT、DMSO、Annexin FITC/PI试剂盒、兔抗大鼠cleaved Caspease-3多克隆抗体、山羊抗兔COX-2、TNF-α多克隆抗体、免疫组织化学试剂盒及DAB显色试剂盒。

本实验主要设备有超净操作台、CO₂培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪。

本实验的方法为：PC12细胞培养PC12细胞培养于含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml的改良型RPMI-1640培养基，37℃、5％CO₂。取对数生长期细胞传代，用0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，计数并进行实验。

本实验的具体步骤由实施例22～实施例25所示：

以2×105/ml的细胞密度将PC12细胞接种到96孔板，每孔100μL，培养12h后倒置显微镜下观察，待细胞贴壁以后，按以下方法进行分组，①对照组； ②6-OHDA损伤组(6-OHDA)：应用100μmol/L 6-OHDA处理PC12细胞12h；③PTSS组：单独应用PTSS(100μmol/L)处理细胞6h；④PTSS+6-OHDA组：在加入6-OHDA前，分别用不同浓度的PTSS(20、100、200μmol/L)预处理细胞不同时间。其中，设置对照组为实施例22，6-OHDA损伤组(6-OHDA)为实施例23，PTSS组为实施例24，PTSS+6-OHDA组为实施例25，每组设置6个复孔，37℃、5％CO₂的培养箱中继续培养12h，倒置显微镜下观察细胞数量与细胞形态变化。

用MTT法检测细胞存活率。细胞接种到96孔板培养12h后加入PTSS，其终浓度分别为20、100、200μmol/L，再加入2μl 6-OHDA，每种浓度设6个复孔，置培养箱中培养24h，然后吸去培养液，PBS冲洗3次，每孔加入加20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h，小心吸取孔内培养基，每孔加入150μl DMSO，37℃摇床震荡10min，至颗粒充分溶解，在酶标仪上测定490nm处的吸光度OD值。

通过流式细胞仪来检测细胞凋亡。按照Annexin FITC/PI试剂盒操作说明，取对数期生长细胞，胰酶消化并收集各组细胞于10ml离心管中，1000rpm，离心6min，弃上清；PBS冲洗3次，加入5ml PBS吹匀；加入70％预冷乙醇中，封口膜封口，4℃固定1-2h；离心，1000rpm×10min，收集细胞，PBS冲洗2次；用PBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；加入Rnase-A约3μl至终浓度50μg/ml，37℃水浴消化30min；加入50μl PI至终浓度为5～50μg/ml，室温避光染色30min；用300目滤网过滤，上机检测。

用免疫组织化学方法检测。Caspease-3、COX-2及TNF-α的表达吸去各组中的培养基，PBS冲洗细胞3遍，4％多聚甲醛固定15-20min后PBS冲洗3遍，正常羊血清封闭，37℃孵育30min，倾去多余血清，分别滴加兔抗大鼠cleaved Caspease-3(1:1000)、COX-2(1:150)、TNF-α(1:150)一抗，4℃过夜，滴加生物素化山羊抗兔二抗，37℃孵育50min，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素，37℃孵育60min，DAB避光显色，苏木素复染细胞核。各步骤之间用0.01mol/L PBS冲洗，5min×3次，中性树胶封片。用0.01mol/L PBS代替一抗，作为阴性对照。

本实验的数据经统计学处理得到，免疫组织化学结果采用IPP图像分析系统进行图像分析，所有数据均用±s表示，应用SPSS 19.0统计软件，采用组 间小样本t检验，各组数据均以P<0.05为有统计学意义，P<0.01认为有显著性差异。

通过数据分析，本实验可得出如下3条结论：

1、PTSS减轻6-OHDA诱导的细胞毒性作用。

我们在预实验时证实，100μmol/L的6-OHDA能明显损伤PC12细胞，导致其细胞存活率下降60％，为使细胞处于损伤状态而不至于过度死亡，故后续实验选择100μmol/L 6-OHDA作为有效损伤浓度。前期预实验证明，PTSS对PC12细胞活力不会产生影响，故选用20μmol/L、100μmol/L和200μmol/L三个浓度的PTSS观测其作用。倒置显微镜下观察各组细胞形态，可见对照组PC12细胞形态完整，呈梭形，如图12 A1-A4所示；PTSS组细胞形态与对照组类似如图12 B1-B4所示；6-OHDA组PC12细胞在加入6-OHDA后12h时细胞数量减少，突起回缩甚至消失，聚集成片，细胞呈球形，胞体变得暗淡，如图12 C1-C4所示；与6-OHDA组比较，PTSS+6-OHDA组加入不同浓度的PTSS作用不同时间后，因6-OHDA诱发的PC12细胞形态改变有所改善，尤以100μmol/L作用48h的改善作用最为显著，镜下可见PC12细胞分布均匀，未出现汇聚成片现象，细胞形态较为规则完整，突起清晰可见，如图13 A4，B4，C4所示。

2、PTSS减轻6-OHDA诱导的PC12细胞损伤。

MTT法检测细胞存活率，结果显示，PTSS预处理不同的时间后加入相同浓度的6-OHDA可有效降低6-OHDA对PC12细胞的损伤。在20～100μmol/L范围内具有浓度正相关性，其中PTSS+6-OHDA组中以100μmol/L与6-OHDA组相比，细胞存活率差异最显著，如图14所示。

3、PTSS抑制6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡。

流式细胞仪检测各组PC12细胞的凋亡情况，由图15可见，6-OHDA主要诱发细胞早期凋亡，如图15右下象限所示，而PTSS可以有效降低PC12细胞的早期凋亡，从而起到保护细胞的作用，如图15所示。免疫细胞化学染色可见，Caspase-3阳性产物主要位于胞核，呈棕黄色细颗粒状；TNF-α免疫反应阳性产物为黄色块状，主要位于胞浆或细胞核；COX-2阳性染色主要位于胞浆。对照组PC12细胞Caspase-3、TNF-α和COX-2的表达量均较少，阳性细胞染色较浅，如图16A1-A3；6-OHDA组三种阳性细胞数量明显增多，且染色较深，如图16 B1-B3；PTSS组三种阳性细胞的数量及染色强度与对照组类似，如图16C1-C3。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种香椿子多酚的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：将香椿子破碎处理，过药筛得到香椿子药粉；

步骤B：将得到的香椿子药粉加入石油醚，常压水浴回流提取得到药渣，将药渣中的溶剂挥发掉后进行低温烘干处理，使所述药渣含水量控制在3％；

步骤C：将步骤B得到的香椿子药渣放入超声波细胞破碎机处理，加入乙醇，控制乙醇的含量为43％，香椿子药渣与所述乙醇的液料比为19:1mL/g，提取时间为13min，提取功率为211w，提取香椿子多酚。

2.根据权利要求1所述的香椿子多酚的提取方法，其特征在于，所述步骤A之前还包括：将所述香椿子干燥处理。

3.根据权利要求2所述的香椿子多酚的提取方法，其特征在于，所述步骤B中，回流次数为2次，第一次回流时间为1.5h，第二次回流时间为1h。

4.根据权利要求1所述的香椿子多酚的提取方法，其特征在于，所述步骤A中，所述药筛为100目。

5.根据权利要求1所述的香椿子多酚提取方法，其特征在于，所述步骤B中，所述低温烘干处理为在低温40℃下烘干3h。

6.一种通过权利要求1～5任一项所述方法提取得到的香椿子多酚。

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