CN105334279A - 一种高分辨质谱数据的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高分辨质谱数据处理的新方法，属于分析化学领域。该方法快速读取原始质谱数据的XML文件，从数据色谱方向分段自动扣除背景，以用户自定义的二个参数初步获得原始数据的质谱特征，即质谱响应阈值和总特征峰数目。在此基础上，从质谱和色谱二个方向以固定的窗口大小划分数据，计算该窗口内被匹配样本与参考样本中所有质谱特征俩倆间的距离，采用线性规划优化的方法获得该距离矩阵的最短路径，构建特征峰匹配最优关系表，校正样本间的漂移。基于高分辨质谱数据峰融合的方法，得到同一代谢小分子中多个特征间的关联关系与多样本的匹配峰表，用于代谢组学标志物鉴定和发现。该方法适合低信噪比和复杂背景的高分辨质谱数据分析。

Description

一种高分辨质谱数据的处理方法

技术领域

本发明涉及一种高分辨质谱数据的处理方法，属于分析化学领域。具体来说是实现多个高分辨质谱数据间同时保留时间和m/z漂移的校正，并融合质谱峰表特征，获得“一对一”的峰表，即一个小分子化合物对应唯一的质谱特征，提高数据用于分类建模及实际应用的能力，比如生物标志物的发现与结构鉴定。

背景技术

高分辨质谱已经得到非常广泛的使用，比如LTQ-Orbitrap和FT-MS等，其主要原因在于其更准确和更高分辨率的质谱量测，从而提供目标化合物分子式甚至子结构或全部结构的信息，提高鉴定的准确性和分析效率。以代谢组学的研究为例，高分辨质谱，特别是液相色谱和高分辨质谱（液-质）的联用，已经非常广泛地用于靶向和非靶向代谢组学的研究中，极大地提高了代谢小分子标志物被发现和鉴定的可能。

代谢组学等领域所涉及的高分辨液-质联用仪器的应用，以及相关数据的分析处理与信息挖掘，大多是建立在多个样本的基础之上，即需要分析的实际样本数通常远不止一个,比如非靶向代谢组学生物标志物的发现，需要系统地分析处理具有统计意义的有病和没病体系数据，寻找可以最大限度地区分这二类样本，且具有优越的未知样本预测能力和生物解释性的代谢小分子标志物。多个高分辨数据样本的分析，必然需要对这些数据进行样本间的保留时间和m/z漂移校正，最理想的状态是达致一个代谢标志物对应一个最终峰表中的质谱特征。

迄今为止，研究者已经提出不少方法来校正和处理多样本的高分辨质谱数据，比如MetAlign，MZmine，XCMS，以及各种商业仪器中自带的数据处理软件包，例如安捷伦公司的MassProfilePro和布鲁克公司的MetabolicProfiler等。整体而言，这些方法各有优劣，结果的好坏往往取决于获得数据时实验设计的具体情形，共同的缺陷可以归类为二个方面：一是方法的复杂性导致的使用复杂性，绝大部分方法都设计成了非常复杂、功能完备的程序或软件系统，对于不具备较强仪器背景和数据分析处理背景的人来说，往往困难较大；另一个方面是方法的缺陷导致的结果不准确性和代谢组学等领域中标志物发现和鉴定的不适应性。以至今使用最为普遍的XCMS方法为例：先对提取离子色谱进行峰识别和峰过滤，再匹配不同样本间的数据，实现保留时间和m/z漂移的校正，最后对得到的峰表数据进行质量提高的处理。

然而，高分辨质谱数据由于不同峰形，噪声和背景的影响，导致色谱方向的准确峰识别异常困难，简单的峰平滑，加上一阶或二阶求导的方法并不能完全找到真实的色谱离子峰，从而导致最终结果的不准确性。此外，传统上峰匹配后的峰表是所有质谱特征的大集合，存在大量一个小分子对应多个裂解质谱特征(m/z)的情形，从而产生一系列的不利后果，包括：1，增加分类建模方法的难度和复杂度，更多的质谱特征导致更小的样本-特征比，减少方法的适应度；2，减少找到真正标志物或有用特征的可能，因为大量质谱特征的存在，实际上稀释了真实的特征，并极有可能筛选到来自相同小分子的质谱特征；3，特征间极大的共线性风险，降低建模方法和结果的可用性。

本发明的方法将峰识别分解为更易实现的二个步骤，即先基于用户自定义的参数实现对质谱峰的快速获取，并在全局优化的峰匹配后进行有效峰融合，既降低对前期准确峰识别的依赖，同时可获得优越的“一对一”峰表，具有更广阔的适应范围和更佳的应用效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的高分辨质谱数据处理方法，通过该方法可实现多个液-质数据样本的同时保留时间和m/z方向峰匹配，其最大特征在于减少对峰准确识别的依赖，基于线性规划的优化方法，可实现全局的最优峰匹配，同时对峰匹配后峰表的融合，可得到所谓的“一对一”峰表结果，更加有利于后续的数据处理和信息挖掘，比如代谢小分子标志物的发现和鉴定。本方法适应范围广，对于具有较大背景，低信噪比的复杂高分辨液-质数据处理，同样能得到较好的结果，具有良好的应用前景。

为了解决多样本间复杂高分辨质谱数据的同时保留时间和m/z校正问题，本发明通过用户自定义的二个参数，即质谱响应阈值或总的峰数目实现质谱特征的初步识别，同时基于自动背景扣除方法提高结果的准确性。在此基础上，采用线性规划逆向思维的模式，校正待分析样本与参考样本间的保留时间和m/z漂移，最后对匹配后的峰表进行峰融合，获得每个小分子化合物对应峰表中唯一质谱特征的峰表，提高后续分析的准确性，并减少对建模方法的依赖。峰识别、全局最优的峰匹配和峰表融合都是优于传统方法的特点，极大限度地保证质谱数据处理结果。

上述高分辨质谱的峰识别，先完整读取原始质谱数据的XML文件，转换XML文件中色谱方向各保留时间点的质谱量测数据为不同m/z下对应的提取离子色谱数据，以非固定尺寸移动窗口的方式，自动扣除不同色谱窗口内的数据背景。根据用户自定义的质谱响应阈值或总的峰数目，提取符合要求的质谱特征，记录得到被分析样本中质谱特征的保留时间和m/z信息表。

上述被分析样本与参考样本间的质谱特征峰匹配，基于m/z和保留时间方向的同时移动窗口划分和线性规划优化峰匹配来达成。先以固定的窗口尺寸大小（比如0.0025）将m/z从大到小的整个范围划分为相同大小等份，找到被分析样本和参考样本在该窗口内的所有质谱特征，然后以固定窗口尺寸大小（比如30S）将整个色谱流出内的保留时间划分为相等大小的窗口，计算被分析样本与参考样本在上述m/z和保留时间重叠窗口内俩倆质谱特征间的欧式距离。采用线性规划逆向思维的模式，搜寻该距离矩阵起始点到结束点的最短距离，记录该最短距离所经过的被分析样本和参考样本路径，得到二者间的质谱特征匹配关系。最后抽提当前m/z和保留时间窗口一半的交汇处的质谱特征，构成匹配后峰表的元素，以减少可能的错误融合，并移动m/z和保留时间窗口，循环上述过程直至所有的质谱特征均被分析后为止，获得峰匹配的初步峰表。

上述峰表是同时校正m/z和保留时间漂移后得到的结果。为了消除该峰表中多个质谱特征本质上对应同一小分子化合物的问题，针对上面得到的初步峰表，进一步采用峰融合的方法，包括同位素离子剔除，加和离子、中性丢失和相关性分析等规则融合峰表中的离子特征。加和离子和中性丢失规则指的是如果某二个离子之间的高分辨质谱m/z之差满足已知的加和规则或中性丢失规则的离子质量之差，则视该对离子应由同一小分子化合物裂解产生，其主要原因在于高分辨质谱的离子准确质量量测能力；相关分析则计算二个离子在不同样本中的相关性，若达到用户自定义的阈值大小，则视为它们来自同一小分子化合物，其原因在于如果二个离子是同一小分子的裂解产物，则其在不同样本中出现的强度比值在理论上应完全相等。最后将不同规则得到的离子进一步融合在一起，即如果上述规则得到二个离子同时与某一离子融合，则所有这些离子都被融合在一起，以其中响应最大的离子强度或者他们总和作为该小分子化合物的特征，并记录所有这些被融合的离子，作为该化合物定性鉴定的依据。

本发明与传统的方法相比，优越性明显。首先本发明避开了色谱方向准确峰识别的难点，通过用户自定义的响应阈值或总的峰数目，以及自动背景扣除的方法，实现了质谱特征的快速获取，减少了峰识别对信噪比的依赖；在此基础上通过m/z和保留时间方向的同时窗口划分，并采用线性规划优化，达到准确的峰匹配；最后将得到的初步峰表进行深层次峰融合，得到每个小分子化合物对应唯一质谱特征的最终峰表，融合结果可进一步辅助提高化合物的定性鉴定能力。

本发明的方法极大地降低了传统方法对峰识别的依赖，具有更好的适应性和应用范围，同时可达致全局最优的方法提高峰匹配的准确性，特别是峰融合方法获得“一对一”的化合物与质谱特征关系，使得该方法具有更好的应用前景。

附图说明

图1为一段典型的提取离子色谱图，即某一精确质量数离子下所对应的色谱，本例的离子质荷比是268.2；

图2为多样本液-质数据峰匹配的原理图和示例图。（A），示意二个样本1和2所对应的LC-MS数据；（B），图（A）中样本1和2中各三个典型离子a、b和c，以及a’、b’和c’的分布示意，峰匹配的目的在于将图中属于不同样本的离子全局性最优地找到各自的对应关系；（C），图（B）中各离子理想匹配后的结果；（D），二个实际样本1和2的保留时间-m/z图，准确峰匹配需要同时全局性地校正图中二个样本各点的保留时间和m/z漂移；

图3为传统方法和本发明方法的工作流程图。（A），传统方法从原始数据到最终峰表的简单流程图，（B），本发明方法的简单工作流程图，包括峰识别的参数定义与初步识别，峰匹配与峰表中质谱特征的精细融合等；

图4为典型的高分辨质谱特征峰与峰融合后的结果。（A），同一精确质量离子下的相同化合物色谱峰在12个不同的样本中的流出情形，从图中可以清楚地看到峰形的差别；（B），图（A）中各样本中的色谱峰通过平滑后得到图形。从图中可以清楚地看到在所有条件都相同的情况下，所得到的实际色谱峰的巨大差异，亦说明了传统峰识别方法所面临的巨大挑战；

图5为一个典型的模拟峰匹配结果。（A），10个样本中的10个质谱特征数据计算得到的距离矩阵；（B），线性规划逆向思维模式得到的结果。从图中可以清楚地看到，从起始点1到所有结束点的最短距离结果。这些结果亦与图（A）中的实际数据情形完全匹配。

具体实施方式

实施例：

以一个用于烟草代谢组学研究的数据为例，说明本发明所述的高分辨质谱数据处理方法及其应用。本数据包括29个样本，均为XML数据格式，色谱方向的检测时间为60分钟，m/z的量测范围为50-1000道尔顿，采用高分辨的LTQ-orbitrap进行分析检测。

从原始数据可以清晰看到，该数据集比较复杂，色谱峰密集，有的峰信噪比不高，而且存在非常明显的基线漂移，特别是不同样本间的保留时间漂移较大，有的甚至长达2-5分钟。采用传统的XCMS方法，初步得到5,000个质谱离子，但由于复杂的峰漂移和背景漂移，导致结果并不理想。

图1为一个典型的提取色谱图。本发明所述的高分辨质谱数据处理，在于实现图2所示的峰匹配，即同时校正不同样本间的m/z和保留时间漂移，并进一步实现峰融合，即达到一个被检测的小分子化合物在最终的融合峰表仅出现一个质谱特征。其简单流程图示于图3，其中亦包括与传统流程的比较。

采用本发明所述的方法，具体包括如下几个步骤：

1)XML文件的读取与初步峰识别

本发明的方法已开发成Matlab程序，系统可自动读取用户自定义文件夹路径下的所有XML文件，并临时保存在系统中，每读取一个文件，均独立与参考样本数据进行峰匹配，并记录相应的结果到初步峰表中。图4示意高分辨质谱数据复杂噪声，以及峰平滑和求导等方法往往并不能有效地对复杂峰进行准确识别。

本例中峰识别所涉及的质谱特征总数目设定为10,000，即读取XML文件并扣除数据背景后，选取具有最大响应的前10,000个质谱特征，用于其后的峰匹配。在计算机可接受的运算能力内，本步骤中的特征数目可尽量设定为一个较大的值，包括最大数目的质谱特征，以保证不丢失潜在的有用信息。对于因此而被选进的噪声信号，则以质谱响应阈值和峰融合阶段的预处理予以剔除。

2)峰匹配

a.将m/z从50-1,000以0.0025为间隔做等距离划分，选择被分析样本数据和参考样本数据位于此区域内的质谱特征，并将得到的这些特征从色谱方向以5分钟作为流出窗口，进行新的划分。以5分钟作为窗口尺寸可保证具有最大保留时间漂移的样本，亦可以得到有效校正；

b.将被分析样本和参考样本位于上述窗口内的特征记录下来，并计算二类不同样本中所有特征的俩倆间距离，得到一个距离矩阵。采用线性规划的逆向思维模式进行峰匹配，优化计算该距离矩阵从起始点到结束点的最短距离，并记录经过最短距离的路径，即经过该路径的被分析样本和参考样本的质谱特征序号。选择m/z和保留时间一半窗口尺寸内的被匹配特征进入初步峰表。选择一半尺寸窗口，而不是全部被匹配的峰表中的特征，可更进一步保证进入峰表结果的准确性，减少错误的峰匹配。未被选入的特征，则进入下一阶段的窗口划分进行新的匹配；

c.重复上述过程，以实现所有质谱特征的匹配，得到完整的初步峰表。图5示意基于线性规划逆向思维模式的峰匹配的准确性和可靠性；

3)峰融合

根据峰融合的4个规则，即同位素峰的剔除，加和离子和中性丢失，以及相关性分析，融合同一代谢小分子所产生的多个离子特征。在本实施例中，m/z和保留时间的差值分别设置为0.0025与0.5，相关性分析的阈值设为0.9，以融合上述过程得到的初步峰表。经过峰融合后的结果，详细记录不同规则对结果的贡献以及主要中间结果，对不同规则所产生的共有融合，以及因离子特征融合交叉，即离子A与B融合，而A亦与C融合所产生的A、B和C的总融合结果，同样有详细的记载，以保证利用这些结果进行后续的代谢小分子定性分析和结构鉴定时可以快速追踪。

4)峰表结果的评价与使用

上述得到的最终峰表结果，需要与原始数据的图形结果进行可视化的直观比较，以保证结果的可靠性。与此同时，将上述结果用于相关的研究，包括代谢组学标志物与关键代谢组份的研究中，辅助实现重要代谢物的结构鉴定和确认。

Claims (8)

1.一种高分辨质谱数据处理的新方法，其特征在于包括以下步骤：

a.用户预先定义用于质谱数据处理的参考数据样本；

b.快速读取质谱数据的XML文件，单个文件读取完成后，构造二维矩阵并从数据色谱方向扣除背景基线；

c.背景基线扣除以非固定尺寸移动窗口的方式进行，即沿着色谱的流出方向根据色谱峰的划分对数据进行自动背景扣除；

d.用户自定义质谱响应的阈值或总特征峰数目，将已扣除背景的数据响应值，按照从大到小的顺序排列，筛选符合响应阈值或峰数目条件的质谱特征作为与参考样本比较分析的依据；

e.以用户自定义的窗口尺寸大小，依次从数据的质谱和色谱二个方向，以固定的窗口大小划分数据，获得被分析样本与参考样本在该窗口内的质谱特征，计算二个不同类型样本中质谱特征俩倆间的距离；

f.基于线性规划经典逆向思维的策略，计算该距离矩阵内从起始点到结束点的最短路径，并记录该最短路径所经过的轨迹，获得被校正样本数据与参考样本数据中各个特征峰的最优匹配关系，同时校正样本间的保留时间与m/z漂移；

g.将校正完成后获得的峰表进行高分辨质谱特征融合，即得到同一代谢小分子中多个特征间的关联关系与多样本的匹配峰表；

h.将上述获得的峰表与原始数据进行比较，验证结果的准确性和可靠性，并将结果应用于代谢组学标志物的发现和鉴定中。

2.根据权利要求书1所述的质谱数据处理方法，其特征在于先完整读取整个XML文件数据，再重排数据以完成沿着色谱方向的背景漂移校正。

3.根据权利要求书1所述的质谱数据处理方法，其特征在于将高分辨质谱数据的峰识别分解为二个不同但相互补充和协作的步骤，即先校正数据的噪声和背景，以用户自定义的参数快速获得数据中的主要质谱特征，在峰匹配完成后再对峰表进行融合获得所谓的“一对一”小分子特征，即每个被检测到的代谢物在峰表中仅以一个质谱特征来表征。

4.根据权利要求书1所述的质谱数据处理方法，其特征在于被分析的数据样本与参考数据样本间的校正，采用可达致全局最优的线性规划方法完成，减少计算时间，提高结果的准确可靠性。

5.根据权利要求书1所述的质谱数据处理方法，其特征在于去除传统的峰识别步骤，仅以用户可简便使用和达成的质谱响应阈值或特征峰数目方法判别质谱特征，并采用高分辨质谱数据峰融合的方法对大量的质谱特征进行删减、合并和归类的融合处理。

6.根据权利要求书4所述的质谱峰表数据的融合，其特征在于包括以下步骤：

i.对峰表数据进行预处理分析以提高数据质量，比如80%规则的应用和缺失值的处理；

j.去除峰表数据中的同位素峰；

k.根据加和离子，中性丢失和相关性分析的原则，找到不同离子俩倆间的融合关系，即寻找这些离子可被视为来自同一小分子裂解的规律和线索；

l.根据上述结果，将相同小分子的裂解碎片离子融合在一起；

m.人工查看结果，评价上述融合结果的准确性，若存在错误的融合，则加入去除错误融合的规则，重新进行新的峰表数据融合。

7.根据权利要求书2至6所述的质谱数据处理方法，其特征在于重复上述过程，直到所有离子特征均被分析完成为止。

8.根据权利要求书6所述的质谱峰表融合方法，其特征在于融合后的结果可用于更准确的小分子定性分析和鉴定，即所有该小分子化合物裂解后所得的离子特征均可用于鉴定小分子结构或验证其结果。