CN105334189A - 基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，先将微透镜浸没在带有抗原的样品溶液中，在平行光照射下，所成的像是一外周边缘为暗环的亮圆；再滴入抗体溶液，抗原抗体发生的反应使得溶液折射率发生变化，从而使微透镜像的暗环粗细发生变化，通过测定暗环的粗细变化并按照用几何光学原理推导出的方程式计算折射率在抗原抗体反应前后发生的变化，将变化量的大小与抗原浓度的关系标定曲线，定性确定是否发生抗原抗体反应并定量确定参与反应的抗原浓度及反应动态学参数。该方法操作简便、快速，不但可实现对抗原抗体反应的定性定量检测，而且检测时不需要事先在固相载体上包被抗原或抗体，具有无需任何事先包被抗原或抗体、事后洗涤的优点。

Description

基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法

技术领域

本发明涉及抗原抗体反应测量技术领域，特别涉及一种基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法。

背景技术

抗原抗体反应检测分析是目前生物学、基础医学研究与临床研究，以及食品安全、环境监测等最为重要的检测分析手段之一。目前抗原抗体反应检测分析最主要的技术有酶联免疫吸附试验测定技术(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)技术以及放射免疫(RIA)法、荧光免疫测定仪与化学发光免疫测定等。ELISA测定技术将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的高度专一性、特异性相结合，以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂进行免疫测试，所以具有很高的灵敏度。但是，其检测操作复杂，步骤繁多，需要先在固相载体(可采用多孔板、微珠或微管)上包被抗原或抗体，而且包被的条件还需要根据包被的抗原或抗体先通过实验进行探索；再加入被检样品后还要进行洗涤，然后加特异性的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合，然后又再洗涤，再加底物显色。才能送交酶标仪亦即分光光度分析仪，通过分析其显色的波长及强度来进行检测。整个过程费工费时，需使用大量较为昂贵的酶标记抗体及标准校样，且在进行定量检测时灵敏度与重复性往往不能令人满意，实验条件难以掌握。SPR是20世纪90年代发展起来的一种生物分子检测技术，它利用光线在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会在金属膜中产生消失波，消失波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。因此，反射光强的响应曲线有一最小值尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角为共振SPR角。SPR角随金属表面折射率变化而变化。通过在金膜基片上用共价交联法固定抗体，当含有匹配的抗原样品流经芯片表面时，亲和反应将分析物(抗原)捕获在膜表面，引起该表面折射率的变化，反射光的共振角也随之改变。而表面折射率的变化又与其结合的抗原分子质量成正比，故随时间的变化，共振强度也会变化。通过注入含有待检测物质和不含有待检测物质的缓冲液，可监测被分析物结合与解离的过程。这就是SPR对抗原抗体反应检测的基本原理。SPR仪是一个相当昂贵的仪器系统(约数十万美元)，其缺点是难以解决微型化与多通检测问题，容易发生管道堵塞且液流中常会有气泡产生影响检测；测量时也需要较多样品溶液；机械转动扫描及二维机械扫描成像，增加了测量的时间和仪器的成本，且会产生磨损偏差；而且因其原理所限，通常可测折射率范围很窄(1.33-1.36)，线性响应的范围也小，容易产生折射率伪值。至于放射免疫(RIA)法，因为需要放射性标记可能会对试验者造成放射性危害，一般现在已较少应用了。而荧光免疫测定仪与化学发光免疫测定亦都存在仪器价格昂贵，需要辅助层析条，容易产生假阳性假阴性等问题。

目前对抗原抗体反应的检测不但需求大，而且临床医学检测的要求也越来越高。首先要求检测快速、多通同时进行，通常希望能在10分钟内完成多个样品的检测，以便迅速确定是否存在靶分子，从而为临床诊断以及有关防疫等工作提供依据。第二是希望检测不但是定性的，而且是定量的，有很好的特异性，能较为精确定量地确定样品内的含有多少靶分子。而目前用于免疫检测的主要技术(如ELISA测定技术、SPR技术、荧光免疫测定仪、化学发光免疫测定仪以及放射免疫(RIA)技术等)都不能同时满足或大致满足上述这些需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，该方法操作简便、快速，不但可实现对抗原抗体反应的定性定量检测，而且检测时不需要任何事先在固相载体上包被抗原或抗体，具有无需任何事先包被抗原或抗体、事后洗涤，也不需加酶标物、底物显色等过程，不需辅助试剂盒或层析条等配件材料。

本发明的技术方案为：一种基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，先将微透镜浸没在带有抗原的样品溶液中，在平行光照射下，所成的像是一外周边缘为暗环的亮圆；再滴入抗体溶液，抗原抗体发生的反应使得溶液折射率发生变化，从而使得微透镜像的暗环粗细发生变化，通过测定暗环的粗细变化并按照用几何光学原理推导出的方程式计算折射率在抗原抗体反应前后发生的变化，将变化量的大小与抗原浓度的关系标定曲线，定性确定是否发生抗原抗体反应并定量确定参与反应的抗原浓度；其中，微透镜是为一端为球面，另一端为平面的微透镜，或者是微球型微透镜，这些微透镜通常由玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯等光学透明材料制成。

对于微球型微透镜推导出的方程式为：

$n_2=n_1{(\frac{3}{8}\sqrt[3]{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2+\sqrt{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^4-{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^6}}+\frac{3{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2}{8\sqrt[3]{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2+\sqrt{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^4-{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^6}}}+\frac{1}{4})}^{-\frac{1}{2}}---\left(1\right)$

而对于一端为球面，另一端为平面的微透镜，方程式为：

$\begin{array}{c}{n}_1=n_2*\[13.172968*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^8+67.604493*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^7-150.372939*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^6+189.176433*\\ {\left(\frac{R_b}{R}\right)}^5-147.260928*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^4+72.6673*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^3-22.408722*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2+4.408178*\left(\frac{R_b}{R}\right)+\\ 0.359321\]\end{array}---\left(2\right)$

两式中，n₁为抗原抗体溶液的折射率，n₂为微透镜的折射率，R_b为暗环内亮圆的半径，R为微透镜的半径。

上述过程中，具体包括以下步骤：

(1)将一微透镜浸没在抗原(或含有抗原的样品)溶液内，然后在平行光照射下成像，其像的特征为一外周边缘为一暗环的亮圆，且暗环的粗细与微透镜折射率与其所浸没溶液折射率的差值成正比；

(2)测定微透镜像的半径R及其中心亮圆的半径R_b1；

(3)加入抗体溶液，再次测定微透镜像的半径R及其中心亮圆的半径R_b2；

(4)利用方程式计算抗原抗体反应前后的溶液折射率变化Δn＝n_2后-n_2前；其中，n_2后为加入抗体起抗原抗体反应后的溶液折射率，n_2前为加入抗体起抗原抗体反应前的溶液折射率。

(5)配制不同浓度的抗原溶液，分别以上述步骤测定对应每一浓度情况下的Δn，然后得到Δn与抗原浓度的关系曲线；

(6)利用Δn与抗原浓度的关系曲线，可通过测出对某一样品溶液在加入抗体溶液前后的Δn的大小，定性确定是否发生抗原抗体反应并定量确定参与反应的抗原浓度。

所述平行光照射的方式是：通过由透镜组组成的平行光照明系统或相衬显微镜进行照射。

所述带有抗原的样品溶液为带有抗原的各种形式的样品溶液，包括各种临床血液、血清或体液；或者食品溶液、防疫与环保现场获得的溶液；或者人工配制的带有抗原的各种形式的样品溶液等。

所述抗体溶液为带有过量抗体配制的溶液，可以是由血清、水溶液与过量抗体配制的溶液，或者由BSA、PBS等生物溶液、水溶液与过量抗体配制的溶液。

过量抗体为含量比通常临床样品中所带抗原的含量要大的可与之发生特异性抗原抗体反应的抗体。抗原抗体反应是将抗体溶液直接滴入抗原溶液中产生的反应，而不需任何事先修饰，也不需要任何事后洗涤与染色作用。

所述抗原溶液的用量以浸没微透镜为准；所述抗体溶液的用量，一般与带有抗原的样品溶液等容积。

所述抗原抗体发生反应前后溶液折射率的变化为Δn，Δn为仅有抗原溶液或样品溶液时微透镜测得的溶液折射率与抗体溶液滴入后5-100秒间微透镜测得的5-100次溶液折射率的平均值之间的差值。

所述折射率在抗原抗体反应前后发生的变化大小与抗原浓度的关系标定曲线，为通过配制不同浓度的抗原溶液，分别测定对应每一浓度情况下的Δn之后，所得到的Δn与抗原浓度的关系曲线。

所述抗原抗体反应测定时，利用动态监测抗原抗体反应过程的折射率随时间的变化，测定抗原抗体反应动态学参数，参数包括抗原抗体复合物的生成常数k_a和解离常数k_d。

本发明的作用原理是：当将玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯等光学透明材料制成的微透镜浸没到抗原溶液或含有抗原的样品溶液内时，由于溶液的折射率比微透镜的折射率小，故在平行光照射下，由于微透镜的球面对光的折射作用，使得其背光表面边缘部分没有折射光到达，因而会形成一边缘暗环。由于微透镜的折光能力随其折射率同所在溶液折射率的差值而变化，故使得边缘暗环的宽窄程度也随所在溶液折射率的变化而变化。而抗原抗体反应时，通常会发生分子团簇现象，改变了溶液中分子的结构，使溶液从亲水溶液转变为疏水溶液，导致溶液折射率发生明显变化(一般是升高)。大部分抗原抗体反应前后溶液折射率的变化的RIU为10^-2到10^-6间，因此，便使得微透镜像边缘暗环的宽窄程度发生明显变化。而非抗原抗体反应时溶液折射率的变化则相比要小很多甚至是反方向的变化。故通过测定微透镜像边缘暗环的宽窄程度在抗原抗体反应前后发生的变化，便可了解溶液折射率的变化Δn，从而确定溶液是否发生抗原抗体变化。

由于微透镜成像可快速实时进行，故利用动态监测抗原抗体反应过程的折射率随时间的变化，通过反应平衡方程：

dn/dt＝k_aCn_max-(k_aC+k_d)n(3)

还可测定抗原抗体复合物的生成常数k_a与解离常数k_d等抗原抗体反应动态学参数。其中dn/dt为溶液折射率随时间的变化梯度，C为抗原浓度，n为抗原抗体溶液的折射率。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

1、本发明的测定方法简便，操作容易。仅需拍摄下抗原抗体反应即往抗原溶液滴入抗体溶液前及后微透镜的图像并测出微透镜像中心亮圆对应的两个半径R_b1及R_b2分别和微透镜半径R的比值，便可利用方程得到有关折射率变化Δn，从而根据Δn的大小确定是否为抗原抗体反应，并定量确定样品中抗原的浓度。

2、测定抗原抗体反应时，既不用像ELISA与SPR技术那样要先将抗原或抗体包被在固相载体上，也不需任何的酶标记物及底物。不需要像ELISA那样多番洗涤、显色、酶标测定等一连串繁琐过程，也不需要像SPR那样要有液流注入系统、机械扫描系统、转臂等一系列复杂的仪器系统，仅需对微球在抗原抗体反应前后进行两次高分辨率成像(静态图像)，测定其中心亮斑位置的变化，通过有关软件分析系统的计算，便可简易快捷定性定量测定抗原抗体反应。

3、抗原抗体反应前后的折射率一般在10^-3量级变化，所以以本微透镜测定技术可测RIU为10^-6的灵敏度，对抗原抗体反应的测定会具有较高的灵敏度。

4、抗原抗体反应后的折射率变化5分钟左右已稳定，故本技术测定与ELISA与SPR技术相比，其测量速度得到较大的提高；且由于微透镜成像可以快速完成(速度可高达每秒数千帧)，故可快速动态监测抗原抗体反应的动态过程。

5、抗原抗体反应组与非特异性及空白对照组的折射率变化有明显差别，故以微透镜法对抗原抗体反应的测定会具有较高的特异性与可靠性。

6、抗原抗体反应产生的折射率变化与抗原浓度成正比，故本技术可实现对抗原抗体反应的定性、定量测定。

7、通过动态监测抗原抗体反应过程的折射率变化，还可测定抗原抗体复合物的生成与解离常数等抗原抗体反应动态学参数。

8、由于本微透镜成像技术可快速反应所处媒质折射率的变化，故其抗各种干扰的能力较强，结果较为稳定准确。

9、由于只需将微透镜浸没便可成像测定，而微透镜体积可小至数十微米直径，故所需样品量很小，可小至数微升。

10、由于微透镜成像可在任何颜色的样品中进行，故即使是溶血的样品，也可实现对抗原抗体反应测定，而不会像Elisa或荧光与化学发光等技术会因此受到干扰不能测量。

附图说明

图1a和图1b是以微透镜成像法测定抗原抗体反应的示意图。其中图1a是微透镜在平行光照射下在抗原抗体反应前所成的像，R为微透镜的半径，R_b1为其像中心亮斑的半径。图1b是微透镜在抗原抗体反应后所成的像，R为微透镜的半径，R_b2为其像中心亮斑的半径。

图2是以微透镜成像技术测定的ODA抗体与ODA血清反应的实验结果，可见ODA抗体与ODA血清反应所引起的折射率变化(如图中曲线1)与非特异性对照(如图中曲线2)及空白对照(如图中曲线3)有明显的差别。

图3是以微透镜成像法所测定的ODA抗原与ODA血清反应后的折射率随浓度的变化，可见抗原抗体反应所产生的折射率变化与抗原浓度成线性关系，故可根据抗原抗体反应所产生的折射率变化，定量测定抗原的浓度。

图4是干扰素抗原抗体在发生结合反应前后，其溶液的折射率随时间的变化的情况，可据此分析计算其抗原抗体复合物生成与解离常数等抗原抗体反应动态学参数。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例以一端为球面，另一端为平面的微透镜成像技术测定ODA抗体与ODA血清反应：将一二氧化硅微透镜置入一多孔板的孔内，然后滴入ODA血清将微透镜浸没，此时利用数字成像系统对被平行光照明下的微透镜成像，并利用专门的图像分析软件测定其微透镜的半径R和其像中心亮斑的半径R_b。随后再滴入抗体溶液，滴入后马上每隔两秒拍摄一次微透镜的像，在100秒内分别获得50个微透镜的像，分别测定各像中中心亮斑的半径R_b，连同微透镜的半径R一起用方程(2)计算出溶液的折射率，取第10秒到50秒的折射率值求平均，将得出的均值与事先得到的抗原抗体反应引起的溶液折射率变化与抗原浓度的关系曲线(如图3所示)作比较，从而定量确定样品的抗原浓度值。以此办法可测定的抗原浓度可低至100pg/mL。

实施例2

本实施例以微球型微透镜成像技术测定CRP抗体与CRP抗原反应：将一聚苯乙烯微透镜置入一多孔板内，然后滴入CRP抗原溶液将微透镜浸没，此时利用数字成像系统成像对被平行光照明下的微透镜成像，并利用专门的图像分析软件测定其微透镜的半径R和其像中心亮斑的半径R_b。随后再滴入抗体溶液，滴入后马上每秒拍摄一次微透镜的像，在100秒内分别获得100个微透镜的像，分别测定各像中中心亮斑的半径R_b，连同微透镜的半径R一起用方程(1)计算出溶液的折射率，取第10秒到80秒的折射率值求平均，从而定量确定样品的抗原浓度值。

实施例3

本实施例以一端为球面，另一端为平面的微透镜成像技术测定干扰素抗体与其抗原反应：将一聚苯乙烯微透镜置入一多孔板内，然后滴入干扰素抗原溶液将微透镜浸没，此时利用数字成像系统成像对被平行光照明下的微透镜成像，并利用专门的图像分析软件测定其微透镜的半径R和其像中心亮斑的半径R_b。随后再滴入抗体溶液，滴入后马上每秒拍摄一次微透镜的像，在600秒内分别获得40个微透镜的像，分别测定各像中中心亮斑的半径R_b，连同微透镜的半径R一起，得到溶液折射率随抗原抗体反应过程变化的曲线(如图4所示)，然后用反应平衡方程(3)计算出抗原抗体复合物的生成与解离常数k_a与k_d。

如上所述，便可较好地实现本发明，上述实施例仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；即凡依本发明内容所作的均等变化与修饰，都为本发明权利要求所要求保护的范围所涵盖。

Claims (10)

1.基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，先将微透镜浸没在带有抗原的样品溶液中，在平行光照射下，所成的像是一外周边缘为暗环的亮圆；再滴入抗体溶液，抗原抗体发生的反应使得溶液折射率发生变化，从而使得微透镜像的暗环粗细发生变化，通过测定暗环的粗细变化并按照用几何光学原理推导出的方程式计算折射率在抗原抗体反应前后发生的变化，将变化量的大小与抗原浓度的关系标定曲线，定性确定是否发生抗原抗体反应并定量确定参与反应的抗原浓度；其中，所述微透镜是一端为球面，另一端为平面的微透镜，或者是微球型微透镜；

对于微球型微透镜推导出的方程式为：

$n_2=n_1{(\frac{3}{8}\sqrt[3]{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2+\sqrt{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^4-{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^6}}+\frac{3{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2}{8\sqrt[3]{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2+\sqrt{{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^4-{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^6}}}+\frac{1}{4})}^{-\frac{1}{2}}$

对于一端为球面，另一端为平面的微透镜推导出的方程式为：

$\begin{array}{c}{n}_1=n_2*\[13.172968*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^8\mathrm{+67}\mathrm{.604493}*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^7\mathrm{-150}\mathrm{.372939}*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^6\mathrm{+189}\mathrm{.176433*}\\ {\left(\frac{R_b}{R}\right)}^5\mathrm{-147}\mathrm{.260928}*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^4\mathrm{+72}.6673*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^3-22.408722*{\left(\frac{R_b}{R}\right)}^2+4.408178*\left(\frac{R_b}{R}\right)+\\ 0.359321\]\end{array}$

两式中，n₁为抗原抗体溶液的折射率，n₂为微透镜的折射率，R_b为暗环内亮圆的半径，R为微透镜的半径。

2.根据权利要求1所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述微透镜为由光学透明材料制成的微透镜。

3.根据权利要求1所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述平行光照射的方式是：通过由透镜组组成的平行光照明系统或相衬显微镜进行照射。

4.根据权利要求1所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述带有抗原的样品溶液为临床血液、血清、体液样品、食品溶液、防疫与环保现场获得的溶液或人工配制的带有抗原的样品溶液。

5.根据权利要求1所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述抗体溶液为带有过量抗体配制的溶液。

6.根据权利要求5所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述抗体溶液是由血清与过量抗体配制的溶液，或者由生物溶液、水溶液与过量抗体配制的溶液。

7.根据权利要求1所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述抗原溶液的用量以浸没微透镜为准；所述抗体溶液与带有抗原的样品溶液等容积。

8.根据权利要求1所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述抗原抗体发生反应前后溶液折射率的变化为Δn，Δn为仅有抗原溶液或样品溶液时微透镜测得的溶液折射率与抗体溶液滴入后5-100秒间微透镜测得的5-100次溶液折射率的平均值之间的差值。

9.根据权利要求9所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述折射率在抗原抗体反应前后发生的变化大小与抗原浓度的关系标定曲线，为通过配制不同浓度的抗原溶液，分别测定对应每一浓度情况下的Δn之后，所得到的Δn与抗原浓度的关系曲线。

10.根据权利要求1所述基于微透镜成像的抗原抗体反应测定方法，其特征在于，所述抗原抗体反应测定时，利用动态监测抗原抗体反应过程的折射率随时间的变化，测定抗原抗体反应动态学参数，参数包括抗原抗体复合物的生成常数k_a和解离常数k_d。