CN105324131B - 包含马来酰亚胺基核心的超分子聚集体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(VI)的超分子聚集体，其中A为活性物质，并且X1、X2、X3和X4彼此独立地是包含马来酰亚胺基官能化的式(I)的部分，且X1、X2、X3和X4中的至少一个存在于式(VI)中。在一个优选的实施方案中，马来酰亚胺基官能化的核心为PWT2。超分子聚集体可在药物、疫苗领域中作为GPCR的配体，即激动剂以及拮抗剂，作为抗生素以及作为最终与放射性核素络合的诊断物质被使用。

Description

包含马来酰亚胺基核心的超分子聚集体
发明领域
本发明涉及通式(VI)的超分子聚集体及其用于靶向和任选地递送活性物质的应用。特别地，本发明涉及与活性物质形成超分子聚集体的新的马来酰亚胺基官能化的核心。
技术状态
用于设计多聚体大分子的化学策略已经在近期的文献中描述(B.D.Mather等人Prog.Polym.Sci.31(2006)487-531；K.Sadler等人Reviews in Molecular Biotechnology90,(2002)195-229)。这类具有肽性质的分子的第一个实例由Tam和同事提出(K.J.Chang等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,(1988)4929-4933)作为在保持原始氨基酸序列的同时增加肽大小的解决方案。由Tam设计的分子被应用为用于产生抗体的“章鱼免疫原”并且此类免疫策略已被命名为多抗原肽(MAP)策略。MAP对蛋白水解的抗性的观察开启了肽作为药物的用途的前景。在这方面，MAP策略被应用于合成作为眼镜蛇毒素解毒剂、作为抗微生物剂、作为用于肿瘤靶向的载体等的分支肽(A.Pini等人Current Protein and PeptideScience 9,(2008)468-477))。另外，一小组神经肽，包括脑啡肽类、神经降压素和痛敏肽/孤啡肽FQ(N/OFQ)，被以单体和四分支形式合成并与人血浆和血清孵育。所有四分支神经肽保留完整的生物活性，并通常显示出对血液和脑蛋白酶活性的较高稳定性(L.Bracci等人J.Biol.Chem.278,(2003)56590-56595)。综合来说，这些数据支持开发分支肽分子作为创新的疗法。此外，作为超分子聚集体的多聚体大分子越大，它们的合成、纯化和分析表征就越复杂。事实上，在通过标准固相合成技术的MAP装配期间产生的杂质在纯化步骤期间特别是当需要长臂时不能够被除去。文章(A.Pini等人Current Protein and Peptide Science9,(2008)468-477)的图4幅C中报道的HPLC谱显示了研究的四分支MAP的低纯度级别。通过标准固相肽合成技术获得的MAP分子的低纯度级别提出了为了开发作为药物的分支分子即超分子聚集体所需要解决的重要问题。
在Zhang Xiaofen等人“macrocyclic chelator assembled RGD multimer fortumer targenting”Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，21卷11号，2011年6月中，描述了用于靶向肿瘤中的肽装配的大环螯合剂，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。由于DOTA的结构，DOTA一被更多地官能化，最终多聚体官能化的产物的产量就降低，使得具有四肽的DOTA的产量非常低。
因此，制备能够保证不仅当制备甚至完全官能化时高产量而且以高纯度保持与待被靶向至最终位点的分子连接的新的超分子聚集体是非常困难的。另一方面，超分子聚集体还应保证以可再生的方式与最终靶标连接。
因此，本发明的目的是不使用长的和困难的纯化步骤以高产量地提供超分子聚集体。
此外，存在提供能够以稳定和可再生的方式连接和靶向活性物质的新的超分子聚集体的需求。
发明概述
因此通过式(VI)的超分子聚集体已经实现了前述目的
其中
f、q彼此独立地是从1到8的整数，
r和s彼此独立地是从1到4的整数，
Y是从1到4的整数，并且
X1、X2、X3和X4彼此独立地是式(I)的部分并且
X1、X2、X3和X4中的至少一个是存在的，并且
其中
A-S-是用巯基衍生的活性物质或具有游离的巯基的活性物质
并且I是从1到10的整数。
在本发明中，当使用用于A-S-的定义“活性物质”时，它意指待被靶向并递送到靶位点的活性物质，诸如药物、疫苗、诊断物质。
式(VI)的聚集体包括式(IV)的核心
以及X1和/或X2、X3和X4。
在另一方面，本发明涉及式PWT2的马来酰亚胺基官能化的核心
因此本发明通过提供作为包含马来酰亚胺基部分的超分子聚集体的新的分支支架解决了以上提到的问题(即分支分子的低纯度)。连接至分支核心的此类马来酰亚胺基部分允许高产量的巯基-迈克尔加成反应，并因此可用于包含巯基的分子的化学选择性连接(welding)。由于应用的反应的高产量和化学选择性，所得的超分子聚集体可被容易地纯化。另外，包含核心的马来酰亚胺基和巯基衍生的活性物质之间的连接反应需要的温和条件和该连接反应的快速性有利地将此类方法延伸至具有低化学稳定性的活性物质。
因此，在另一方面，本发明涉及用于制备本发明的超分子聚集体的方法，所述方法包括将n个(A-SH)与式(VII)的化合物巯基-迈克尔加成反应的步骤
其中
f、q彼此独立地是从1到8的整数，
r和s彼此独立地是从1到4的整数，
Y是1到4的整数，并且
Z1、Z2、Z3和Z4彼此独立地是式(II)的部分
并且Z1、Z2、Z3和Z4中的至少一个是存在的，
并且I是从1到10的整数。
因此，在本发明中，式(VII)的化合物优选为PWT2。
新的式(IV)的马来酰亚胺基官能化的核心，即式(VII)的化合物，更特别为PWT2，致使结构上能够不仅提供在巯基上与特定的活性物质的精确连接，而且能够将这样的活性物质以可再生的方式靶向至被靶向的位点。
不束缚于任何理论，本发明人认为活性物质的精确、可再生和与其稳定的连接，以及有效的靶向至靶位点的惊人特性是由于(IV)的马来酰亚胺基官能化的核心更优选为PWT2的特定结构。
在另一方面，本发明涉及用于将活性物质A靶向和任选地递送至靶位点的超分子聚集体。
所得的超分子聚集体可用于例如药物、疫苗领域中、作为GPCR的配体(激动剂以及拮抗剂)、作为抗生素、作为诊断物质(即作为放射性配体的PWT2衍生物)以及将单个生物活性药理单元连接到多官能支架可以是有价值的所有领域中。
附图说明
在下文中参考附图详细描述本发明，其中：
图1示出了PWT2的合成方案
图2示出了PWT2的质谱(计算的M.W.861.37775)(计算的PWT2+Na M.W.883.35969)
图3示出了PWT2-N/OFQ的化学式和HPLC谱
图4示出了PWT2-N/OFQ的质谱(计算的M.W.8505.69)
图5.对CHONOP+Gαqi5细胞进行的钙动员测定。N/OFQ、PWT2-N/OFQ的浓度响应曲线(左图)。针对抗N/OFQ和PWT2衍生物的刺激效应的SB-612111的抑制响应曲线(右图)。数据为以一式两份做出的至少4组实验的平均值±sem。
图6.在电刺激的小鼠输精管中N/OFQ和PWT2-N/OFQ的浓度响应曲线。值为3组独立实验的平均值±sem。
图7.N/OFQ(顶图)和PWT2-N/OFQ(底图)的浓度响应曲线的典型追踪。记录PWT2-N/OFQ作用和洗涤后缺乏逆转的缓慢动力学。
图8.在SB-612111(100nM)的不存在(对照)和存在下在电刺激的小鼠输精管中获得的N/OFQ(顶图)、PWT2-N/OFQ(底图)的浓度响应曲线。值为至少3组独立实验的平均值±sem。
图9.在取自NOP(+/+)和NOP(-/-)小鼠的输精管组织中获得的N/OFQ(顶图)、PWT2-N/OFQ(底图)的浓度响应曲线。值为3组独立实验的平均值±sem。
图10.小鼠运动活性。等效i.c.v.剂量的N/OFQ(10nmol)、PWT2-N/OFQ(0.25nmol)对动物运动距离(顶图)、不动时间(中图)、和竖起(底图)的效应。结果表示为从下午4时至上午9时的时间过程(左图)和累积效应(右图)。数据为每组10-12只小鼠的平均值±sem。根据ANOVA随后是用于多重比较的Bonferroni’s检验相比于盐水*p<0.05。
发明详述
因此本发明涉及式(VI)的超分子聚集体
其中
f、q彼此独立地是从1到8的整数，
r和s彼此独立地是从1到4的整数，
Y是从1到4的整数，并且
X1、X2、X3和X4彼此独立地是式(I)的部分并且
X1、X2、X3和X4中的至少一个是存在的，并且
其中
A-S-是用巯基衍生的活性物质或具有游离的巯基的活性物质
并且I是从1到10的整数。
在本发明中，当使用用于A-S-的定义“活性物质”时，它意指待被靶向并递送到靶位点的活性物质，诸如药物、疫苗、诊断物质。
式(VI)的聚集体包括式(IV)的核心
和X1和/或X2、X3和X4中的至少一部分。
在式(VI)的聚集体中和在式(IV)的核心中，f、q彼此独立地是从1到8的整数，优选地f是3且q是2，r和s彼此独立地是从1到4的整数，优选地它们等于1，并且Y是从1到4的整数，更优选地是1。在本发明的超分子聚集体的式(I)的部分中，I是3。
根据本发明，在超分子聚集体(VI)中X1、X2、X3和X4彼此独立地是连接的马来酰亚胺基片段，所述马来酰亚胺基片段转而通过巯基连接至用巯基衍生的或具有巯基基团的活性物质A。
因此本发明涉及式(IV)的马来酰亚胺基官能化的核心。
在另一方面，本发明涉及式PWT2的马来酰亚胺基官能化的核心
马来酰亚胺基官能化的核心连接至巯基活性物质A。
因此，在另一方面，本发明涉及制备本发明的超分子聚集体的方法，所述方法包括将n个(A-SH)与式(VII)的化合物巯基-迈克尔加成反应的步骤
其中
f、q彼此独立地是从1到8的整数，
r和s彼此独立地是从1到4的整数，
Y是从1到4的整数，并且
Z1、Z2、Z3和Z4彼此独立地是式(II)的一部分
并且Z1、Z2、Z3和Z4中的至少一个是存在的
并且I是从1到10的整数。
在一个更优选地实施方案中，式(VII)的化合物是PWT2。
根据本发明的活性物质A-S-可以是必须被靶向且任选地递送到靶位点的用巯基衍生的或包含巯基的任何物质。
活性物质A优选地选自由以下组成的组：
-阿法诺肽
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2(SEQ IDNO:1)
(天然存在的黑皮质素肽激素α黑素细胞刺激激素(α-MSH)的合成类似物)
-阿肽地尔
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(SEQ ID NO:2)
-比伐卢定
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH(SEQ ID NO:3)
-水蛭素和相关的直接凝血酶抑制剂肽
-铃蟾肽
Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2(SEQ IDNO:4)
(Pyr；焦谷氨酸)以及相关类似物。
-缓激肽
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH(SEQ ID NO:5)，以及相关的类似物
-西曲瑞克
Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2(SEQ ID NO:6)
(乙酰基-D-3-(2’-萘基)-丙氨酸-D-4-氯苯丙氨酸-D-3-(3’-吡啶基)-丙氨酸-L-丝氨酸-L-酪氨酸-D-瓜氨酸-L-亮氨酸-L-精氨酸-L-脯氨酸-D-丙氨酸-酰胺)以及相关的促性腺激素释放激素拮抗剂诸如阿巴瑞克、地加瑞克、加尼瑞克。
-布舍瑞林
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt(SEQ ID NO:7)
(Pyr；焦谷氨酸)以及相关的促性腺激素释放激素激动剂，诸如戈那瑞林、Boserelin、德舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林。
-肌肽
Beta-Ala-His-OH
-章鱼唾液精
Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2(SEQ ID NO:8)
(Pyr；焦谷氨酸)
-恩夫韦肽
Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2(SEQ ID NO:9)
-艾塞那肽
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-
Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-
Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(SEQ ID NO:10)
以及相关的胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂，诸如：利拉鲁肽
-葛瑞林
Gly-Ser-Ser(辛酰基)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-OH(SEQ ID NO:11)以及相关的生长激素促分泌素受体激动剂，诸如舍莫瑞林、替莫瑞林
-GHRP-6
His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2(SEQ ID NO:12)
以及相关的生长激素释放肽(GHRP)，诸如GHRP-2(D-Ala-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)(SEQ ID NO:13)、海沙瑞林(His-2-Me-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)(SEQID NO:14)
-艾替班特
D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg-OH(SEQ ID NO:15)
以及相关的缓激肽受体(B2)拮抗剂
-神经肽S
Ser-Phe-Arg-Asn-Gly-Val-Gly-Thr-Gly-Met-Lys-Lys-Thr-Ser-Phe-Gln-Arg-Ala-Lys-Ser-OH(SEQ ID NO:16)
及相关的类似物
-阿片样肽,包括脑啡肽、皮啡肽、δ啡肽、强啡肽、内吗啡肽、痛敏肽/孤啡肽FQ以及相关的类似物
肽序列诸如：
Lys-Ala-Lys-Glu-Gly-Val(SEQ ID NO:17)
Lys-Thr-Lys-Gln-Gly-Val(SEQ ID NO:18)
Lys-Thr-Lys-Glu-Gly-Val(SEQ ID NO:19)
Lys-Thr-Lys-Glu-Gln-Val(SEQ ID NO:20)
Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala(SEQ ID NO:21)
具有全部L和全部D Ac-(Lys-Phe)8的16肽
-替可沙肽
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-
Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH(SEQ ID NO:22)
合成的ACTH类似物
-胸腺喷丁
Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(SEQ ID NO:23)
-胸腺素α-1
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH(SEQ ID NO:24)
-Vx-001
Tyr-Leu-Phe-Phe-Tyr-Arg-Lys-Ser-Val-OH(SEQ ID NO:25)
-特夫素
Thr-Lys-Pro-Arg(SEQ ID NO:26)
-ACE抑制剂，包括假肽和肽拟似物(peptidomimetic)，如阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利、群多普利、佐芬普利。
-H1拮抗剂,包括酮替芬、阿扎他定、塞替利嗪、氯雷他定。
-β2肾上腺素-激动剂,包括沙丁胺醇、沙美特罗、克仑特罗。
优选的活性物质A是阿片样肽或神经肽S(NPS)以及相关的类似物NPS，更优选地所述活性物质选自由以下组成的组：脑啡肽、皮啡肽、δ啡肽、强啡肽、内吗啡肽、痛敏肽/孤啡肽FQ和NPS，再更优选地其是痛敏肽/孤啡肽FQ或NPS。
超分子聚集体通过巯基-迈克尔加成反应将式(VII)的Z1、Z2、Z3和Z4官能化的核心与巯基衍生的物质连接来制备，优选地在活化(activating)混合物的存在下进行。
马来酰亚胺基官能化的核心可以以溶液和固相两者有机化学合成，或其任何组合来制备。马来酰亚胺基官能化的核心(例如PWT2)然后与包含巯基或使用巯基衍生的活性物质反应，以得到本发明的超分子聚集体。
新的式(IV)的马来酰亚胺基官能化的核心结构(如式(VII)的化合物)致使结构上能够不仅提供以巯基与特定活性物质的精确连接，而且将这样的活性物质以可再生的方式靶向在至靶位点。不束缚于任何理论，本发明人认为活性物质的精确、可再生和与其稳定的连接，以及有效的靶向至靶位点的惊人特性归因于式(IV)的马来酰亚胺基官能化的核心的特定结构。
在另一方面，本发明涉及用于将活性物质A靶向和任选地递送到靶位点的超分子聚集体。优选地活性物质是药物。
所得的超分子聚集体可用于例如疫苗领域中、作为GPCR的配体(激动剂以及拮抗剂)、作为抗生素、作为诊断物质(最后，与放射性核素络合的PWT2)，以及其中将单个分子连接到多功能支架上可以是有价值的所有领域中。
在本发明中，获得的PWT2不仅提供了与活性物质的巯基的特定连接，而且提供了广泛和大量的结构的络合。特别地，对于PWT2，该结构导致能够络合作为放射性同位素的金属。
本发明的超分子聚集体不影响活性物质A的生物活性。具体地，本发明人表明，在N/OFQ的情况下，超分子聚集体的形成不影响N/OFQ的药理活性(全激动(full agonism))。另外，他们表明，与N-OFQ的相比，PWT2-N/OFQ衍生物的作用的体内持续时间显著增加。为了示例性目的，以下报道了制备PWT2、其与包含巯基的物质A或巯基衍生的物质A的反应的一般程序。
马来酰亚胺基核心的合成(合成PWT2的一般程序)
图1中报道了用于制备被制造为PWT2的马来酰亚胺基核心的一般程序中。商购可得的化合物6和7在活化混合物WSC/Oxp的存在下反应，以在一个步骤中以高产量生成期望的产物PWT2。
然后，如下面说明的通过制备型HPLC纯化PWT2，并且其准确质谱在图2中被报道。
制备型HPLC纯化PWT2的一般程序
如以上获得的粗制化合物PWT2通过制备型反相HPLC使用具有Jupiter柱C18(250x30mm，300A，15μm球状粒径)的Water Delta Prep 4000系统来纯化。柱用流动相A(0.1％TFA中的H2O)以及B(0.1％TFA中的60％CH3CN)以20mL/min的流速灌注，并将以下梯度用于洗脱化合物：t0 A90％；t25 A40％；t30 A20％；t35 A90％。
然后，马来酰亚胺基官能化的核心(PWT2)与包含巯基或用巯基衍生的活性物质反应。将包含巯基的活性物质A和马来酰亚胺基官能化的核心(PWT2)连接的示例性一般程序如下。
PWT2核心和包含巯基的分子之间的巯基-迈克尔加成反应的一般程序
向PWT2(0.00169mmol)的CH3CN/H2O搅拌溶液(1mL)中加入包含巯基的活性物质A(0.00744mmol，10％过量)的CH3CN/H2O溶液(1mL)，随后加入5％的NaHCO3(0.1mL)。反应在室温下搅拌并通过分析型HPLC来监测。PWT2核心在几分钟内完全反应并从HPLC色谱图上消失。然后，反应混合物直接通过制备型HPLC来纯化以高产量获得最终产物。
涉及制备PWT2和它们与包含巯基的物质A的反应的详细程序的实施例如下。
实施例1.合成PWT2的详细程序(参考图1)
PWT2。向0℃的化合物6(1.1mmol)的(DMF)搅拌溶液(5mL)中加入WSC(1.2mmol)和Oxp(1.2mmol)。10min后，加入化合物7(0.25mmol)的DMF溶液(3mL)，并搅拌反应混合物4h。蒸发溶剂后，通过制备型HPLC纯化剩余物，以在冷冻干燥后得到高吸湿性的白色固体。
实施例2.制备具有痛敏肽/孤啡肽FQ(N/OFQ-NH2)的PWT2的超分子聚集体的详细 程序
向PWT2(0.00169mmol，MW 1062，1.8mg)的CH3CN/H2O搅拌溶液(1mL)中加入[Cys18]N/OFQ-NH2x 5TFA(0.00744mmol，MW 2482，18.5mg)的CH3CN/H2O溶液(1mL)，随后是5％的NaHCO3(0.1mL)。反应通过分析型HPLC来监测并显示在5-min内完成。通过制备型HPLC纯化反应混合物，以定量产量得到期望的产物(PWT2-N/OFQ)。
PWT2-N/OFQ的化学式和HPLC谱在图3中被报道。其质谱在图4中被报道。
巯基-迈克尔反应的高化学选择性和强度以及相对于核心10％过量的A-SH的使用允许马来酰亚胺基部分完全消耗而不依赖于肽长度。
最终超分子聚集体相对于A-SH单体的不同化学物理性质允许反应混合物的容易的色谱纯化，该色谱纯化具有不仅回收100％期望的最终产物而且回收为促进完全反应而使用的10％过量的A-SH的可能性。
测试以上制备的超分子聚集体的生物活性。
实施例3.
本发明的超分子聚集体(N/OFQ的PWT2衍生物)的生物活性
本实验的目的是药理学表征痛敏肽/孤啡肽FQ(N/OFQ)肽的PWT2衍生物的体外和体内作用。为此目的，使用表达N/OFQ肽(NOP)以及经典的阿片样(MOP、DOP和KOP)人重组受体的细胞和N/OFQ敏感的药理学制备物电刺激的小鼠输精管进行体外实验。通过测量N/OFQ和PWT2-N/OFQ对小鼠运动活性的作用进行体内研究。
材料和方法
钙动员-稳定共表达人NOP、或KOP、或MOP受体和C末端修饰的Gαqi5的CHO细胞和表达DOP受体和GαqG66Di5蛋白的CHO细胞如先前描述的来产生(Camarda等人，NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol.379,(2009)599-607；Camarda和Calo,Methods MolBiol.937,(2013)293-306)。细胞在由以下组成的培养基中保持：补充有10％胎牛血清的杜氏(Dulbecco's)MEM/HAM’S F-12(50/50)、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素(2.5μg/ml)、遗传霉素(G418；200μg/ml)和潮霉素B(200mg/ml)。在37℃下在5％CO2潮湿空气中保持细胞培养物。在所有情况下，实验培养物不受选择试剂(潮霉素B，G418)的影响。当达到汇合(3-4天)时，细胞根据需要使用胰蛋白酶/EDTA传代培养并用于实验。将细胞以50,000个细胞/孔的密度接种于96孔黑色的透明底的板中。孵育24小时后，在37℃下将细胞加载补充有以下的培养基持续30min：2.5mM丙磺舒、3μM钙敏感荧光染料Fluo-4AM和0.01％普流尼克酸。然后，吸出加载溶液并加入100μl/孔的测定缓冲液：补充有20mM HEPES的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、2.5mM丙磺舒和500μM亮黑(Aldrich)。N/OFQ、DPDPE、强啡肽A、皮啡肽和PWT2-N/OFQ(如以上实施例2中制备的)的储备溶液(1mM)以去离子水制备并储存于-20℃下。将SB-612111溶解(10mM)于DMSO。实验使用的配体的系列稀释物以HBSS/HEPES(20mM)缓冲液(包含0.03％BSA级分V)来制备。在将两个板(细胞培养物和化合物板)放入FlexStation II(Molecular Device,Union City,CA 94587,US)后，测量荧光变化。以50μl/孔的体积来进行即时(on-line)添加。为了在拮抗剂类型实验中促进药物扩散进孔中，本研究在37℃下实行，并且在拮抗剂注入孔后立刻进行三个周期的混合(来自每孔的25μl，上下移动3次)。
电刺激小鼠输精管-从CD1(30-35g，(Harlan，Italy)或CD1/C57BL6/J-129NOP(+/+)或NOP(-/-)雄性小鼠获取组织。如先前描述的(Calo等人，Eur J Pharmacol.311,(1996)R3-5)制备小鼠输精管。将组织悬浮于5ml包含用95％O2和5％CO2氧化的加热的Krebs溶液(以mM的组成：NaCl 118.5、KCl 4.7、KH2PO41.2、NaHCO325、葡萄糖10和CaCl22.5)的器官浴池中。浴池温度设定在33℃。通过两个铂环电极以1ms持续时间和0.05Hz频率的超大矩形脉冲持续刺激组织。对输精管施加0.3g的静息张力。电诱发的收缩(抽搐)用应变片传感器(Basile 7006,UgoBasile s.r.l.,Varese,Italy)等张收缩性地(isotonically)测量，并用基于个人电脑的采集系统Power Lab(ADInstrument,USA)来记录。在60min的平衡期后，由电场刺激诱发的收缩是稳定的。此时，进行N/OFQ、PWT2-N/OFQ或DPDPE的累积浓度响应曲线(0.5对数单位阶跃)。在一些实验中，激动剂的浓度响应曲线在SB-612111的不存在或存在下来进行(15min预孵育时间)。
行动活性-用于体内研究的所有实验程序遵守欧洲共同体委员会指令(86/609/EEC)和国家规定(D.L.116/92)的标准。使用雄性CD-1小鼠(30–38g，Harlan，Italy)和CD1/C57BL6/J-129NOP(+/+)或NOP(-/-)雄性小鼠。在实验开始之前，将他们以自由采食食物和水在标准条件(22℃，55％湿度，12h光暗周期，7.00am光照)下放在笼(Tecniplast,Italy)中至少5天。根据先前描述的程序(Guerrini等人，J Med Chem.52,(2009)524-529)进行实验。对于这些实验，使用了ANY-maze视频跟踪系统(Ugo Basile，应用版本4.52cβ)。将小鼠放置在正方形塑料笼中(40×40cm)，每笼一只小鼠。平行监测四只小鼠。通过摄像机监测小鼠水平活动，同时通过红外光束阵列测量垂直活动。记录动物行动持续60min。测量的参数是累积运动距离(以米计的测试期间动物运动的总距离)、不动时间(当动物的90％保持在同一个地方最少2.5s时认为它是不动的)、以及竖起的次数(由于垂直运动而光束中断的次数)。脑室内给予N/OFQ和PWT2-N/OFQ(i.c.v.,2μl/小鼠)。根据文献程序(Laursen和Belknap,J Pharmacol Methods.16,(1986)355-357)在轻度异氟烷麻醉(仅足够产生翻正反射的丧失)下在左脑室给予徒手i.c.v.注射。
数据分析和术语-体外数据表示为至少三组独立实验的平均值±sem。在钙动员实验中，使用表示为相比于基线荧光的百分数的最大荧光变化以确定激动剂响应。使用GraphPad Prism软件(5.0)的非线性回归分析允许所得响应的逻辑迭代拟合和激动剂效力和最大效应的计算。激动剂效力给出为pEC50(产生最大可能效力的50％的激动剂的摩尔浓度的以10为底的负对数)。在对抗约对应于其EC80的固定浓度的N/OFQ或PWT2-N/OFQ的抑制响应曲线实验中评估SB-612111拮抗剂性质；拮抗剂效力表示为由以下等式推导的pKB：
pKB＝-log(IC50/([2+([A]/EC50)n]1/n–1))
其中IC50是产生激动剂响应的50％抑制的拮抗剂的浓度，[A]是激动剂的浓度，EC50是产生50％最大响应的激动剂的浓度，以及n是对激动剂的浓度响应曲线的希尔系数。
在组织实验中，SB-612111的拮抗效应已通过在固定浓度的拮抗剂的不存在和存在下进行对激动剂的浓度响应曲线来评估。SB-612111效力由Gaddum Schild等式来推导：
pKB＝-log((CR-1)/[拮抗剂])
假定斜率值一致相等，其中CR表示在拮抗剂的存在和不存在下激动剂效力之间的比值。
体内数据表示为n只动物的平均值±sem。数据使用单向方差分析法(ANOVA)随后是Dunnett事后检验来分析。当p<0.05时，差异被认为是统计学上显著的。
结果
钙动员测定-在稳定表达Gαqi5嵌合蛋白和人NOP重组受体的CHONOP细胞中，N/OFQ和它的PWT2衍生物诱发浓度依赖性的钙释放的激发(图5，左图)。N/OFQ显示高效力(pEC509.39)和最大效应(相比于基线值237±15％)。N/OFQ的PWT2衍生物模拟了肽刺激效应，显示相似的最大效应但略低的效力(pEC508.83)。当在表达Gαqi5蛋白但不表达NOP受体的CHO细胞中测试时，发现N/OFQ和它的PWT2衍生物在最高达1μM时无活性(数据未显示)。抑制响应实验通过测试增加浓度(10pM–10μM)的标准NOP拮抗剂SB-612111对抗约相应于其EC80的固定浓度的激动剂(10nM的N/OFQ和30nM的PWT2-N/OFQ)来进行。SB-612111浓度依赖性地抑制N/OFQ的刺激效应，显示8.01的pKB值，与先前的研究一致(8.16,Camarda等人，NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol.379,(2009)599-607)。激发(challenge)拮抗剂对抗PWT2-N/OFQ的刺激效应获得了相似的结果(pKB8.23)(图5，右图)。
表1.钙动员研究。N/OFQ和其PWT2衍生物在表达人NOP受体和Gαqi5嵌合蛋白的CHO细胞中的效应。
为评估PWT2-N/OFQ作用的选择性，钙动员实验还在表达嵌合G蛋白和经典阿片样受体MOP、DOP和KOP的细胞中来进行。在此系列实验中，使用皮啡肽、DPDPE和强啡肽A分别作为MOP、DOP和KOP的标准激动剂。在表达MOP受体的细胞中，皮啡肽诱发具有9.29的pEC50(CL95％9.19–9.38)的浓度依赖性刺激效应和135±21％的最大效应(表2)。强啡肽A模拟皮啡肽的刺激效应，然而所述强啡肽A效力大约弱300倍。在这些细胞中，发现DPDPE、N/OFQ和PWT2-N/OFQ在最高达1μM时无活性。在表达DOP受体的细胞中，DPDPE诱发具有9.57的pEC50(CL95％9.03–10.11)的浓度依赖性刺激效应和86±14％的最大效应(表2)。强啡肽A也能够在这些细胞中引起钙动员，但是效力弱100倍。所有其他激动剂在最高达1μM时无活性。最后，在KOP细胞中，强啡肽A以具有10.04的pEC50(CL95％9.93–10.16)和225±10％的最大效应的浓度依赖性方式刺激钙释放(表2)。所有其他激动剂在这些细胞中无活性。总之，在使用标准配体的这些实验中获得的结果与来自文献(Reisine,Neuropharmacology34,(1995)463-472)中的结果一致。用PWT2-N/OFQ获得的结果证实，这些化学修饰的应用不影响由天然肽N/OFQ显示的对经典阿片样受体的选择性。
表2.钙动员研究。N/OFQ、其PWT2衍生物和标准阿片样激动剂在表达人NOP或经典阿片样受体和嵌合蛋白的CHO细胞中的效力。
无活性：最高达1μM时无活性。
电刺激的分离的组织实验-在分离的小鼠输精管中，N/OFQ以浓度依赖性的方式抑制对电场刺激的抽搐响应(pEC507.37(CL95％7.29–7.45)，Emax＝88±1％控制抽搐的抑制)(图6)。PWT2-N/OFQ模拟N/OFQ的抑制效应，产生相似的最大效应，但显示高约3倍的效力(图6)。足够有趣，由N/OFQ诱发的抑制效应在将肽加入浴池后立刻发生，并且在洗涤组织后立刻可逆转(图7)。与之不同，PWT2-N/OFQ诱发缓慢的抑制效应，其只有在10min后才达到稳定阶段。更重要的是，由PWT2-N/OFQ诱发的效应对洗涤有相当的抗性(图7)。
如图8中所示，N/OFQ和PWT2-N/OFQ的效应在NOP选择性拮抗剂SB-612111的不存在和存在下在电刺激小鼠输精管中来评估。100nM的SB-612111本身不改变控制抽搐，但产生了对N/OFQ的浓度响应曲线的向右位移，而没有改变由激动剂诱发的最大效应(图8，顶图)。从这些数据中推导出8.48的pKB值。该拮抗剂效力值可以与文献中先前报道的(8.50(Spagnolo等人，J Pharmacol Exp Ther.321,(2007)961-967)重叠。通过激发SB-612111对抗PWT2-N/OFQ获得了相似的结果(pKB8.22)。
表3.N/OFQ和其PWT2衍生物在电刺激的小鼠输精管中的效应。
N/OFQ和PWT2-N/OFQ的效应，以及由选择性DOP受体激动剂DPDPE诱发的那些效应在电刺激的从NOP(+/+)和NOP(-/-)小鼠得到的小鼠输精管中研究。N/OFQ以具有7.68(CL95％7.53–7.83)的效力值和92±2％的最大效应的浓度依赖性方式抑制在从NOP(+/+)小鼠得到的组织中的电诱发的收缩，N/OFQ几乎在从NOP(-/-)动物得到的那些组织中在最高达微摩尔浓度时无活性(图9，顶图)。与之不同，选择性DOP受体激动剂DPDPE在NOP(+/+)和NOP(-/-)组织中产生相似的抑制效应(表4)。这些结果证实了先前的发现(Fischetti等人，Peptides.30,(2009)248-255)。在相同实验条件下，PWT2-N/OFQ在从NOP(+/+)和NOP(-/-)小鼠得到的组织中进行测定。在NOP(+/+)组织中，PWT2-N/OFQ模拟N/OFQ的抑制效应，显示较高的效力(pEC507.92)和相似的最大效应(图9)。在NOP(-/-)组织中，PWT2-N/OFQ保持抑制电诱发的收缩的能力，然而显示出降低大于100倍的效力(图9)。用N/OFQ、PWT2-N/OFQ和DPDPE获得的效力和最大效应的值在表4中总结。
表4.N/OFQ、PWT2超分子聚集体和DPDPE在从NOP(+/+)和NOP(-/-)动物得到的小鼠输精管中的效应
ND:由于浓度响应曲线不完整而不可确定最大效应。
体内研究–已知经脊柱(supraspinally)给予的N/OFQ对啮齿动物的运动活性产生双相效应：在高剂量(nmol范围)，肽引起强烈的抑制效应，而在低剂量(pmol范围)，它可增加运动(综述参见Calo等人，Br J Pharmacol.129,(2000)1261-1283)。在一系列实验中，在CD-1小鼠中评估i.c.v.给予的N/OFQ和PWT2-N/OFQ对自发性运动活性的急性效应。在这些实验中，记录小鼠运动活性，持续120min。N/OFQ产生双相效应：在相对低的剂量(pmole范围)肽产生短持续的刺激效应，而在较高剂量(nmole范围)它产生抑制效应。PWT2-N/OFQ模拟了天然肽的效应，但是效力高约40倍。另外，与天然肽相比，PWT2-N/OFQ显示出缓慢的作用起始和延长的效应。为研究他们体内-N/OFQ作用持续时间的不同，等效剂量的N/OFQ(10nmole)和PWT2-N/OFQ(0.25nmole)的效应在过夜实验中被测量。具体地，小鼠在上午11时被i.c.v.注射，并且从下午3时至第二天的上午9时测量他们的运动活性。如图10中所示，注射了N/OFQ的小鼠显示出与盐水注射的动物相似的运动行为。与之不同，注射了PWT2-N/OFQ的动物显示出在实验的整个时间过程中与增加的不动时间相关的统计学上显著降低的运动距离和竖起行为。这些结果证实了超分子聚集体显示出与非常长的持续效应相关的较高的体内效力。
最后，PWT2-N/OFQ的作用的体内选择性已在敲除研究中研究。用盐水或PWT2-N/OFQ(0.25nmole)注射NOP(+/+)和NOP(-/-)小鼠，并在注射后评估它们的运动活性持续120min。如表5中总结，PWT2-N/OFQ在NOP(+/+)小鼠而不在NOP(-/-)小鼠中产生统计学显著减少的运动距离和竖起。
表5.PWT2-N/OFQ对NOP(+/+)和NOP(-/-)小鼠的运动活性的效应。
根据用于非成对数据的学生t检验，相对于盐水*p<0.05。
总之，体外和体内研究证实了N/OFQ的超分子聚集体表现为对人重组和天然动物NOP受体的有效完全的激动剂。PWT2修饰对选择性有轻微的影响，但其在体内与较高的效力和对作用持续时间的巨大影响相关，所述作用持续时间与天然序列相比乘以数倍。

Claims (8)

1.一种式(VI)的超分子聚集体
其中f是3，q是2，r和s等于1，且Y是1，
并且
X1、X2、X3和X4彼此独立地是式(I)的部分
并且
其中在式(I)中
A-S-是用巯基衍生的活性物质或具有游离的巯基的活性物质
且I是3。
2.根据权利要求1所述的超分子聚集体，其中A是阿片样肽或神经肽S(NPS)。
3.根据权利要求1所述的超分子聚集体，其中A选自由以下组成的组：脑啡肽、皮啡肽、δ啡肽、强啡肽、内吗啡肽、痛敏肽/孤啡肽FQ和神经肽S(NPS)。
4.根据权利要求3所述的超分子聚集体，其中A是痛敏肽/孤啡肽FQ或NPS。
5.一种式PWT2的马来酰亚胺基官能化的核心
6.一种用于制备权利要求1-4中的任一项所述的超分子聚集体的方法，所述方法包括将n个(A-SH)与式(VII)的化合物进行巯基-迈克尔加成反应的步骤
其中f是3，q是2，r和s等于1，且Y是1，
并且
Z1、Z2、Z3和Z4彼此独立地是式(II)的部分
并且I是3。
7.根据权利要求1-4中的任一项所述的式(VI)的超分子聚集体用于制造将活性物质A靶向和任选地递送到靶位点的药剂的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述活性物质A是待被靶向至适合的受体位点的药物。
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