CN105296490A

CN105296490A - 一种特异识别大鼠成骨细胞的寡核苷酸配基的序列和应用

Info

Publication number: CN105296490A
Application number: CN201410347341.6A
Authority: CN
Inventors: 邵宁生; 李慧; 李少华; 丁红梅; 李洁; 黄皑雪; 苏雪婷; 赵强
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2014-07-22
Filing date: 2014-07-22
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明公开了属于分子生物医学技术领域的一种特异识别大鼠成骨细胞的寡核苷酸配基L54的序列和应用。本发明设计L54特异性的序列，采用5’端或3’端修饰、标记(如FITC、生物素或者地高辛)的方法检测L54能够特异识别大鼠成骨细胞。L54作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病的辅助诊断，骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病的治疗，以及用于骨代谢疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。L54作为载体递送药物靶向骨代谢相关疾病靶向治疗方面的应用。本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于临床辅助诊断、骨代谢相关疾病靶向治疗，具有广泛临床应用和基础应用前景。

Description

一种特异识别大鼠成骨细胞的寡核苷酸配基的序列和应用

技术领域

本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及特异识别大鼠成骨细胞的寡核苷酸配基L54的序列和修饰，以及修饰后的L54在识别大鼠成骨细胞方面的应用。本发明涉及L54在生物医药方面的应用。L54作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病的辅助诊断，治疗骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病，以及用于关于骨代谢疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。L54作为载体递送药物靶向骨代谢相关疾病靶向治疗方面的应用。

背景技术

指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialEnrichment)技术，是一种新型的高通量生物文库筛选技术。这种技术运用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，同时结合体外PCR扩增技术，以指数形式富集与靶分子特异性结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合寡核苷酸配基-适配体(aptamer)。由于aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。随机文库中的寡核苷酸序列能形成多样的空间结构，因此SELEX技术可选择的靶分子范围十分广泛，包括金属离子、蛋白多肽、有机染料等，其中蛋白多肽类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒、细菌病原体，甚至完整的哺乳动物细胞也可以通过完整细胞消减SELEX技术筛选出其高亲和力的寡核苷酸配基。SELEX技术作为一种极其有用的分子生物学工具而越来越受到重视，并在基础医学、临床诊断和疾病治疗中都显示了广阔的应用前景。

本发明是通过完整细胞消减SELEX技术获得了一个寡核苷酸配基L54。经鉴定L54能够特异识别大鼠成骨细胞，而不结合其它细胞，对照核酸序列与上述细胞均无结合，目前尚未见能特异结合大鼠成骨细胞的核酸适配体的相关研究报道。

发明内容：

本发明目的在于提出特异识别鼠成骨细胞的寡核苷酸配基L54的序列及其应用领域，包括L54作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病的辅助诊断，治疗骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病，以及用于关于骨代谢疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。L54作为载体递送药物靶向骨代谢相关疾病靶向治疗方面的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

首先由Invitrogen公司合成L54序列，并在5’端或3’端修饰、标记(如FAM、生物素或者同位素)，然后进行应用研究：组织化学或荧光方法检测L54识别大鼠成骨细胞。

本发明优点：

1)与蛋白类的抗体相比，单链的寡核苷酸更加稳定；aptamer可直接体外合成、标记，因此不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。

2)本发明证实L54能够特异识别大鼠成骨细胞。因此，L54序列在临床医学与基础医学的肿瘤研究相关领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。

附图说明：

图1流式细胞仪测定L54与大鼠成骨细胞的结合情况。

图2流式细胞仪测定L54与大鼠骨肉瘤细胞的结合情况。

图3流式细胞仪测定L54与大鼠肠上皮细胞的结合情况。

图4L54与大鼠成骨细胞结合的平衡解离常数(KD值)的测定。

具体实施方式：

下面通过FAM标记的L54对大鼠成骨细胞的识别来进一步描述本发明。

1、合成L54序列(序列表中SEQIDNo.1)和GP30序列(序列表中SEQIDNo.2)，均在5’端标记FAM(Invitrogen公司完成)。

FAM-L54

5’-GTACTTCCGGCGGGTTCTATGGGCCCTGTCTCCCTTCCCAAAAGTGCACGCTAC-3’

FAM-GP30：

5’-GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’

注：N代表A、T、G、C任意一种。

2、流式细胞仪分别测定FAM-L54与大鼠成骨细胞、大鼠骨肉瘤细胞、大鼠肠上皮细胞的结合

2.1将一定浓度的FAM-L54或FAM-GP30溶于50μl孵育缓冲液(1×PBS-1.25mmol/LCaCl₂-0.25mmol/LMgCl₂-0.1μg/μlytRNA-0.1μg/μl鲑鱼精DNA)中，95℃加热5min后迅速置于冰上冷却10min；

2.2分别收集大鼠成骨细胞、大鼠骨肉瘤细胞和大鼠肠上皮细胞，无菌1×PBS洗一次，调整细胞浓度为5×10⁵/管单细胞悬液，加入封闭液(1×PBS-1.25mmol/LCaCl₂-0.25mmol/LMgCl₂-0.1μg/μlytRNA-0.1μg/μl鲑鱼精DNA)于室温封闭30min；

2.3离心去除封闭液，将等量变性处理好的FAM-L54或FAM-GP30与大鼠成骨细胞、大鼠骨肉瘤细胞和大鼠肠上皮细胞37℃孵育1h；

2.4离心去除上清，每管加入500μl1×PBS-1mmolMgCl₂-1.25mmol/LCaCl₂溶液重悬细胞后用流式细胞仪计数测定FAM荧光强度。

3、L54与大鼠成骨细胞结合的平衡解离常数(KD值)的测定

将不同浓度的FAM-ssDNA与筛选靶细胞在封闭液中混匀，于37℃避光共孵育30min，洗涤、离心，弃去上清350μl(1×PBS，1.25mmol/LCaCl2，0.25mmol/LMgCl2)缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测荧光强度值的大小，采用GraphpadPrism4软件绘制结合曲线，选用函数Y＝Bmaxx/(Kd+X)计算适配体与靶细胞的平衡解离常数KD值

实验结果：

通过荧光显微镜和流式细胞仪的检测均可表明L54能特异结合大鼠成骨细胞。

由图1、2、3可以得到结论：流式细胞仪测定结果表明FAM-L54能够特异结合大鼠成骨细胞，而与大鼠骨肉瘤细胞和大鼠肠上皮细胞均不发生结合，对照序列FAM-Gp30与上述几种细胞均无结合。

由图4可以得到结论：L54与大鼠成骨细胞结合的平衡解离常数KD值，约为494.4±133.3nmol/L

总之，L54能够特异识别大鼠成骨细胞，具有广泛临床应用价值。

序列表

Claims

1.一种特异识别大鼠成骨细胞的寡核苷酸配基L54的序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。

2.据权利要求1中所述方法，寡核苷酸适配体L54可以是体外化学合成的，也可以是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。

3.据权利要求1中所述方法，寡核苷酸适配体L54的5’端或3’端可以经FITC、生物素、地高辛等标记。

4.据权利要求1中所述方法，寡核苷酸适配体L54在肿瘤研究领域、临床肿瘤组织切片标本的鉴别、肿瘤生物导向治疗领域中的应用。