CN105250253B - T0901317作为parp1抑制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及N‑(2，2，2‑三氟乙基)‑N‑[4‑[2，2，2‑三氟‑1‑羟基‑1‑(三氟甲基)乙基]苯基]‑苯磺酰胺(简写为T0901317)作为1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂。上述T0901317属于胆固醇类似物并无通常肿瘤药物或其他1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂的细胞毒作用，可以预期其安全性。可以作为治疗胆固醇相关疾病如心血管疾病、肿瘤等疾病的药物而广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及将N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺这种羟化胆固醇类似物作为PARP1抑制剂的应用。
背景技术
N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺，CAS号为293754-55-9，简写为T0901317，化学式为C17H12F9NO3S，分子量为481.33。T0901317是一种有效的、选择性的LXR和FXR激动剂。
上述化合物均属于羟化胆固醇类似物，具有降低胆固醇的作用。在目前已有的研究中主要作为肝脏X受体(LXR)的激动剂，即激活LXR，例如激活基因LXRα(肝脏X受体α亚型)，因此上述药物均被广泛应用于LXR相关的研究中。
1型多聚ADP核糖合成酶，简写为PARP1，PARP1是一种广泛表达于真核细胞的核酶。当细胞内氧化应激引起DNA断裂损伤时，PARP1通过结合断裂DNA发生构象改变而活化。活化的PARP1以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为底物，以其酶促作用通过转移腺苷二磷酸核糖(ADP)饰目标蛋白和自身(即多聚ADP核糖化反应)，从而改变目标蛋白和自身的生物学活性。目前应用于科研中的PARP1抑制剂有数种，其中最为常见的有：3-氨基苯甲酰胺(简写为3AB)，N-(6-氧代-5，6-二氢菲啶-2-基)-2-(N，N-二甲基氨基)乙酰胺盐酸盐(简写为PJ34)。而应用于临床药物试验的研究的PARP1抑制剂有BMN-673、CEP-9722、Rucaparib、KU-0059436、INO-1001等，在肿瘤治疗及主动脉夹层等疾病治疗中有明确疗效。已有的研究认为胆固醇升高与肿瘤的发病率明确相关，但目前尚无胆固醇相关药物对此方面的证据。
发明内容
本发明提供羟化胆固醇类似物N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺的新用途，即作为1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂进行应用。
本发明提供的技术方案如下：
N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺(简写为T0901317)作为1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂。所述T0901317可以抑制1型多聚ADP核糖合成酶的活性。
一种抑制1型多聚ADP核糖合成酶活性的方法，在该方法中，选用N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺作为1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂，通过无细胞1型多聚ADP核糖合成酶酶促反应和/或利用离体细胞实验分别检测上述试剂T0901317对1型多聚ADP核糖合成酶的活性的抑制作用。
通过实验验证，当所述N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺的浓度为1μmol/L至5μmol/L时，N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺对1型多聚ADP核糖合成酶的活性的具有抑制作用。
本发明还提出，N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺可以作为治疗与1型多聚ADP核糖合成酶相关疾病的药物的应用。
本发明还提出，N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺可以作为治疗与1型多聚ADP核糖合成酶相关的心血管疾病药物的应用。
本发明具有的有益效果：
本发明通过实验首次证实了T0901317这种羟化胆固醇类似物不仅可以作为LXR激动剂而且同时对PARP1有抑制作用，上述发现尚未有任何文献报道。上述T0901317作为胆固醇类似物并无通常肿瘤药物或其他PARP1抑制剂的细胞毒作用，可以预期其安全性。可以作为治疗胆固醇相关疾病如肿瘤等疾病的药物而广泛应用。
附图说明
图1-图4为本发明实验检测结果图。
图1和图2，HepG2细胞分别给予T0901317(iii，1，3，5μmol/L)，或烟酸(iv，1，5，10μmol/L)刺激24小时。
图1包括图1A至图1B，分别为PARP1活性检测试剂盒检测测定PARP1活性；3AB(10mmol/L)作为阳性对照，烟酸作为阴性对照。与对照组相比，##P＜0.01。图1A为不同浓度的T0901317对PARP1活性的影响；图1B为不同浓度的烟酸对PARP1活性的影响。
图2包括图2A和图2B；图2A为添加了不同浓度的T0901317，利用蛋白印迹实验检测HepG2细胞全蛋白抽提物中的多聚核糖化蛋白表达程度；图2B为分别给予不同浓度的T0901317的刺激，检测HepG2细胞内的PARP1蛋白表达水平的实验结果。
图3和图4中在无细胞蛋白体系中，将重组组蛋白H1与PARP1，NAD+，DNA和T0901317(1，3，5μmol/L)进行孵育。
图3中PARP1活性检测试剂盒检测测定PARP1活性。与PARP1/NAD+/DNA组相比##P＜0.01。图3包括图3A和图3B；其中图3A为不同浓度的T0901317对PARP1活性的影响；其中图3B为不同浓度的烟酸对PARP1活性的影响。
图4中，利用蛋白印迹实验检测无细胞蛋白体系中孵育体系蛋白的多聚核糖化水平。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例所涉及的方法，若无特别说明，均为本领域常规的实验方法，本领域技术人员采用常规的技术手段可以实现本发明实施例所述的实验方法。
以下实施例分别应用离体细胞实验和无细胞PARP1酶促反应体系研究三种药物对PARP1酶活性的抑制作用。
参考相关的文献(Huang D，Yang C，Wang Y，Liao Y，&Huang K.PARP-1suppressesadiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)ation of PPAR gamma incardiac fibroblasts.Cardiovascular research，2009，81(1)：98-107.)，分别构建了体外无细胞PARP1酶促反应体系及活性测定试验体系，以进行T0901317对PARP1活性的作用效果检测。
实施例采用的N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺(简写为T0901317)购自sigma，型号T2320-5MG。
实施例1利用无细胞PARP1酶促反应体系检测
利用PARP1活性检测试剂盒构建无细胞PARP1酶促反应体系，该反应体系能在体外环境中激活PARP1酶的活性。
实施例使用的PARP1活性检测试剂盒购自Trevigen公司，产地美国，型号为4676-096-K。
PARP1活性检测试剂盒包括缓冲液、PARP1重组蛋白、NAD+、单链断裂DNA、重组组蛋白1(Histone H1)。
按照PARP1活性检测试剂盒进行配置无细胞PARP1酶促反应体系，具体操作步骤如下：在缓冲液中加入50ng PARP1重组蛋白(PARP1protein)、终浓度为10mmol/L NAD+、终浓度为20mg/mL单链断裂DNA后。组成缓冲液的各组分在反应体系中的终浓度分别为：Tris-HCl(pH 8.0)的终浓度为100mmol/L、MgCl2的终浓度为20mmol/L、二硫苏糖醇的终浓度为1mmol/L。配置完成后，于37℃恒温箱中共孵育25分钟。
在上述无细胞PARP1酶促反应体系中，选用重组组蛋白1(Histone H1)作为目标蛋白(所述Histone H1为PARP1重组蛋白的目标蛋白，能被多聚ADP核糖化修饰)，选用3-氨基苯甲酰胺(3AB)作为PARP1抑制剂并同时作为阳性对照药物，选用烟酸(nicotinic acid)作为阴性对照。
在向反应体系加入NAD+前，先加入终浓度为10mmol/L的3-氨基苯甲酰胺(3AB)预孵育5分钟后，再按上述无细胞PARP1酶促反应体系进行多聚ADP核糖化反应。待检测药物组则分别加入不同浓度的T09013171，进行多聚ADP核糖化反应。体系孵育完成后，开始进行多聚ADP核糖化水平测定及PARP1酶活性检测。
在上述无细胞蛋白体系中，将重组组蛋白H1与PARP1重组组蛋白1、NAD+、单链断裂DNA和T0901317(终浓度分别为1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L)进行孵育。
分别采用下述步骤1)和步骤2)中的方法检测上述中的PARP1活性。
1)应用蛋白印迹实验，并用特异性抗多聚ADP核糖链的检测抗体(Anti-PARPolymer Monoclonal Antibody)(购自Trevigen公司，型号为4335-MC-100)，对多聚ADP核糖化程度进行半定量检测，检测方法参见Huang D，Yang C，Wang Y，Liao Y，&HuangK.PARP-1suppresses adiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)ation ofPPAR gamma in cardiac fibroblasts.Cardiovascular research，2009，81(1)：98-107.据此，可对PARP1自身及其对目标蛋白多聚ADP核糖化的水平进行检测。
2)采用PARP1活性检测试剂盒测定PARP1活性，检测步骤参见PARP1活性检测试剂盒的说明书。
实施例2利用离体细胞实验检测
在离体细胞实验中，选择HepG2(来源于美国模式培养物集存库)细胞作为实验细胞。发明人采用不同浓度的T09013171处理HepG2细胞。处理方法参见Huang D，Yang C，WangY，Liao Y，&Huang K.PARP-1suppresses adiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)ation of PPAR gamma in cardiac fibroblasts.Cardiovascular research，2009，81(1)：98-107.
HepG2细胞分别给予T0901317(iii、1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L)或烟酸(iv、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)刺激24小时，上述括号中的浓度均为终浓度。
使用PARP1活性检测试剂盒(购自Trevigen，产地美国，型号为4676-096-K)检测PARP1活性，具体方法参照该试剂盒的说明书。其中，以3AB(10mmol/L)作为阳性对照，烟酸作为阴性对照。实验组与对照组相比，##P＜0.01。
蛋白印迹实验检测HepG2细胞全蛋白抽提物中的多聚核糖化蛋白表达程度。(具体步骤方法见参考文献Huang D，Yang C，Wang Y，Liao Y，&Huang K.PARP-1suppressesadiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)ation of PPAR gamma incardiac fibroblasts.Cardiovascular research，2009，81(1)：98-107.)
实验结果
1、实施例2利用离体细胞实验检测的结果
实施例2中，用不同浓度的LXRα激动剂，即T09013171分别处理HepG2细胞。经PARP活性检测试剂盒检测PARP1活性证实浓度分别为1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L T0901317均可以对细胞内PARP1活性产生浓度依赖性地抑制作用(如图1所示)。
与此同时，使用核糖化(PAR)抗体检测显示，上述浓度的T09013171可显著降低HepG2细胞内蛋白核糖化水平(如图2A所示)。
实施例2利用蛋白印迹实验检测HepG2细胞全蛋白抽提物中的多聚核糖化蛋白表达程度，图2B结果显示，分别给予不同浓度的T0901317的刺激，并不影响HepG2细胞内的PARP1蛋白表达水平。
2、实施例1利用无细胞PARP1酶促反应体系检测结果
实施例1无细胞PARP1酶促反应体系研究发现，LXRα激动剂与PARP1蛋白，重组组蛋白，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及DNA一起孵育，在无细胞蛋白体系中，将重组组蛋白1与PARP1、NAD+、DNA和T0901317(1，3，5μmol/L)分别进行孵育，可以从图3中看出，上述浓度的T0901317浓度赖性地降低了PARP1活性。与PARP1/NAD+/DNA组相比##P＜0.01，具有显著性差异。图4中蛋白印迹实验检测无细胞蛋白体系中孵育体系蛋白的多聚核糖化水平。从图4中也可以获得与图3相一致的结论。
以上这些结果显示，上述LXRα激动剂T0901317能够直接抑制PARP1活性。
近年的研究发现PARP1通过调控多种基因的转录在心血管疾病以及肿瘤的发生的过程中发挥着重要的作用。如：肿瘤的发生已经被证实与PARP1的过度激活密切相关，而使用PARP1的抑制剂可抑制肿瘤的生长。目前已经开展了数个PARP1抑制剂应用于肿瘤治疗的临床药物研究。另亦有大量研究证实心血管疾病的发生发展过程中，PARP1催化活性明显增强，而在大量的心血管疾病动物模型中，给予PARP1抑制剂处理后，可以发现PARP1抑制剂发挥了明显的积极有效的作用。而将PARP1抑制剂应用于心血管疾病治疗的临床药物研究目前还在进行中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.N-(2,2,2-三氟乙基)-N-[4-[2,2,2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺在制备用于利用无细胞1型多聚ADP核糖合成酶酶促反应和/或利用离体细胞检测其对于1型多聚ADP核糖合成酶活性抑制作用的药物中的用途。
2.如权利要求1所述N-(2,2,2-三氟乙基)-N-[4-[2,2,2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺在制备用于利用无细胞1型多聚ADP核糖合成酶酶促反应和/或利用离体细胞检测其对于1型多聚ADP核糖合成酶活性抑制作用的药物中的用途，所述N-(2,2,2-三氟乙基)-N-[4-[2,2,2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺的浓度为1μmol/L至5μmol/L。
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