CN105246841A - 抑制在厌氧还原脱氯期间甲烷的产生 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过使用酶和辅酶抑制剂来限制产甲烷细菌的甲烷产生的方法，这种方法在厌氧还原脱氯期间起作用。利用各种化合物，诸如但不限于红曲米、维生素B10衍生物以及乙磺酸盐来破坏负责产生甲烷的这些不同的酶和辅酶系统。这种方法影响了产甲烷菌和嗜盐细菌对在修复过程期间被注入到土壤和地下水系统中的有机氢供体的竞争。

Description

抑制在厌氧还原脱氯期间甲烷的产生
对相关专利申请的交叉引用
本专利申请是名称为“抑制在厌氧还原脱氯期间甲烷的产生(InhibitionofMethaneProductionDuringAnaerobicReductiveDechlorination)”并且在2013年3月5日由相同的发明人提交的共同未决的专利申请号13/785,840的部分继续申请，在此要求了该专利申请号13/785,840的优先权。
技术领域
本发明涉及造成甲烷产生的不同的酶和辅酶系统的各种抑制剂的使用。本发明利用了红曲米、维生素B10衍生物、以及乙磺酸盐来破坏酶和辅酶系统并且限制产甲烷菌产生甲烷的生产率。
背景技术
包括氯化脂族烃(CAH)在内的卤化挥发性有机化合物(VOC)是美国的超级基金污染场地(Superfundsite)和其它危险废物场地的土壤和地下水中最常出现的污染物类型。在1996年，美国环境保护局(EnvironmentalProtectionAgency，EPA)估计这些场地的清理在未来的几十年间将花费超过450亿美元。
CAH是人造有机化合物。它们通常是由天然存在的烃成分(甲烷、乙烷、以及乙烯)和氯经由各种方法制成的，这些方法用氯原子取代一个或多个氢原子或使氯化化合物选择性地脱氯成更少氯化的状态。CAH被用于多种应用中，包括用作溶剂和脱脂剂以及用于制造原料。CAH包括诸如四氯乙烯(PCE)、三氯乙烯(TCE)、四氯化碳(CT)、氯仿(CF)以及二氯甲烷(MC)之类的溶剂。在历史上对含有CAH的废物的管理已经对土壤和地下水造成污染，CAH存在于美国的许多受污染的地下水场地处。TCE是那些污染物中最普遍的。此外，CAH和它们的降解产物，包括二氯乙烷(DCA)、二氯乙烯(DCE)以及氯乙烯(VC)倾向于存留在地下，从而对公众健康和环境造成危害。
可用于处理地下水中诸如PCE、TCE、顺式-1，2-二氯乙烯(顺式-1，2-DCE)以及VC等氯化烃污染物的具有成本效益的和可靠的技术的选择方案近年来已经摆脱传统的抽水处理法(pump-and-treatprocess)，特别是在以下情况下：
·存在非水相液体(NAPL)、微乳液或高浓度吸附物质，从而导致高溶解相浓度。
·地下水的取用受地表结构或用途的限制。
·当地限制条件禁止诸如空气喷射或自然衰减之类的其它可供使用的技术的实施。
·已经应用了抽水处理(Pump-and-treat)技术，但是已经达到了渐近性去除率。
·污染是广泛的并且浓度对于基于风险的关闭来说是过高的，但是在其它方面是相对低的(通常是100ppb-7500ppb)。
·溶解的CAH迁移穿过属性边界或进入到相邻地表水中导致需要长期修复。
·游离相CAH(DNAPL)垂直迁移到下面的饮用水含水层中是一个问题。
每一处场地的环境化学部分地决定了该场地处氯化溶剂的生物降解速率。地下水中诸如氯乙烯和氯乙烷等氯化溶剂的初始代谢通常涉及被描述为连续还原脱氯的一种生化过程。不同类型和浓度的诸如原生有机物质的电子供体以及诸如氧气和氯化溶剂的电子受体的存在在很大程度上决定了在场地自然衰减期间还原脱氯发生的程度。
实验室研究已经证实多种有机基质将刺激还原脱氯，包括乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、苯甲酸盐、葡萄糖、乳酸盐、甲醇、以及甲苯。廉价的复合基质，如糖蜜、干酪乳清、玉米浆、玉米油、氢化棉籽油珠、固体食物起酥油、牛脂、熔融玉米油人造黄油、椰子油、大豆油、以及氢化大豆油有支持完全的还原脱氯的潜能。
还原脱氯仅在不存在氧气的情况下发生；并且氯化溶剂在进行该过程的微生物的生理机能中实际上取代了氧气。由于在这一生理过程期间使用氯化溶剂，因此它被至少部分地脱氯。修复处理技术通常将除氧剂引入到地下以确保这一过程将立即发生。
常常使用异养细菌来消耗溶解氧，从而降低地下水中的氧化还原电位。此外，由于细菌依靠有机粒子生长，因此它们使碳发酵并且释放多种挥发性脂肪酸(例如乙酸、丙酸、丁酸)，这些挥发性脂肪酸从发酵的场地扩散到地下水污染羽(groundwaterplume)中并且用作包括脱卤菌(dehalogenator)和卤素呼吸(halorespiring)菌种在内的其它细菌的电子供体。铁源通常提供相当大的反应性表面区域，所述表面区域经由化学除氧而刺激直接的化学脱氯以及地下水的氧化还原电位的额外下降。
细菌一般根据以下方面来分类：1)它们获得能量的方式；2)它们需要的电子供体的类型；或3)它们需要的碳源。通常，参与地下的CAH的生物降解的细菌是化能菌(chemotroph)(由化学氧化还原反应获得它们的能量的细菌)并且使用有机化合物作为电子供体和有机碳源(有机异养菌)。然而，细菌根据它们使用的电子受体以及因此将在地下占优势的区域的类型而被进一步分类。引起产生相对更多能量的氧化还原反应的细菌电子受体类别相对于引起产生相对更少能量的氧化还原反应的细菌电子受体类别将占优势。
某些微生物将有助于从所施用的系统中去除氧气和硝酸盐。嗜盐菌是栖息于高盐环境的好盐的生物体。它们主要包括具有平衡环境的渗透压和抵御盐的变性作用的能力的原核微生物和真核微生物。在嗜盐微生物当中有多种异养的和产甲烷的古菌；光合、无机营养和异养细菌；以及光合和异养真核生物。
另一方面，产甲烷菌在无氧环境中起至关重要的环境作用，这是因为它们去除了由其它形式的厌氧呼吸所产生的过量的氢气和发酵产物。产甲烷菌通常在其中除CO2以外的所有电子受体(如氧气、硝酸盐、三价铁以及硫酸盐)已经被耗尽的环境中生长旺盛。
基于热力学方面的考虑，还原脱氯将只是在氧气和硝酸盐这两者均已经从含水层中被耗尽之后发生，这是因为氧气和硝酸盐是比氯化溶剂在能量上更有利的电子受体。几乎任何可以被发酵成氢气和乙酸盐的基质均可以用于提高还原脱氯，这是因为这些材料由脱氯微生物所使用。然而，氢气还是产甲烷细菌的基质，所述产甲烷细菌将它转化成甲烷。通过利用氢气，产甲烷菌与脱氯微生物竞争。
最终，对产甲烷作用的抑制将产生更低的甲烷产生，这积极地影响了主要关注的许多环境问题，并且还将帮助脱卤细菌在原位修复过程中更有效地利用促进还原脱氯的环境条件或氯化挥发性有机化合物(CVOC)。
因此，在本领域中需要一种抑制在厌氧还原脱氯过程期间负责产生甲烷的酶和辅酶系统的方法。
发明内容
为了解决本领域中对抑制在厌氧还原脱氯过程期间负责产生甲烷的酶和辅酶系统的方法的需要，已设计出本发明。
本发明提供了抑制产生甲烷的生物体的甲烷产生的方法，所述方法是通过抑制在甲烷产生中起关键作用的各种酶和辅酶的作用来实现的。在本发明中靶向各种酶和辅酶。发现所使用的抑制剂对存在于所述系统中的其它细菌是无害的。
这种通过使用酶抑制剂限制产甲烷菌的甲烷产生的方法在氯化溶剂的原位修复期间可以是非常有用的。这种方法预期积极地影响产甲烷菌和嗜盐细菌对在修复过程期间被注入到土壤和地下水系统中的有机氢供体的竞争。这种方法还提供了一种用于降低甲烷的排放水平的替代方法，所述甲烷被认为是一种主要的温室气体。在这方面，在详细地阐明本发明的至少一个实施方案之前，应当了解的是，本发明在它的应用方面不限于以下说明中所阐述的构造细节和组件的布置。本发明能够具有其它实施方案，并且能够以不同的方式实施和执行。还应当了解的是，本文中所用的用语和术语是为了描述的目的，而不应当被视作具有限制性。
因而，本领域技术人员将了解的是，作为本公开的基础的构思可以容易地被用作设计用于实现本发明的若干个目的的其它结构、方法以及系统的基础。因此，重要的是，权利要求书被认为包括了这些等同构造，只要它们没有脱离本发明的精神和范围即可。
具体实施方式
具体地说，本文提供了一种用于抑制产甲烷菌的甲烷产生的方法，所述方法包括使所述产甲烷菌与有效量的包含红曲米、维生素B10衍生物以及乙磺酸盐的组合物接触，所述有效量足以引起对甲烷产生的抑制。作为本发明的一个方面，所述方法引起了诸如土壤或地下水的环境介质的还原脱氯。
根据本发明的一个实施方案，所述方法还包括将可发酵的基质添加到环境介质中的步骤。本领域技术人员已知的任何可发酵的基质在本发明的方法内均是可操作的。举例来说，一些有用的可发酵的基质包括但不限于碳水化合物；包括葡萄糖和产生葡萄糖的化合物；乙酸盐；丙酸盐；丁酸盐；苯甲酸盐；乳酸盐；甲酸盐；甲醇；甲苯；糖蜜；干酪乳清；玉米浆；油类，包括玉米油、花生油、椰子油、大豆油、氢化棉籽油珠；固体食物起酥油、牛脂；熔融玉米油人造黄油；丝状植物材料；甲壳质以及氢化大豆。
生物甲烷形成是由产甲烷菌催化的微生物过程。如本文所用的术语产甲烷菌指的是产生甲烷的生物体，包括产生甲烷的细菌和古菌(以往被分类为古细菌)这两者。产甲烷菌的所有菌种的产甲烷途径共同具有甲基向甲烷的转化；然而，甲基的来源不同。大部分的菌种能够使用分子氢(H2)或甲酸盐作为还原剂将二氧化碳(CO2)还原成甲基。利用CO2和H2的产甲烷菌中的甲烷产生途径涉及特异性产甲烷菌酶，所述酶使用独特的辅酶催化独特的反应。
生物合成酶，即4-(β-D-呋喃核糖基)氨基苯-5′-磷酸(β-RFA-P)合酶是催化甲烷蝶呤生物合成中的第一步骤的关键酶。这种酶催化对氨基苯甲酸(pABA)与5-磷酸-α-D-核糖基-1-焦磷酸酯(PRPP)之间的缩合，伴随形成β-RFA-P、CO2以及无机焦磷酸盐(PPi)。这种酶是磷酸核糖基转移酶和脱羧酶并且形成C-核糖核苷，这在磷酸核糖基转移酶和pABA依赖性酶当中是独特的。
β-RFA-P合酶是四氢甲烷蝶呤(H4MPT)的生物合成中的早期步骤，该四氢甲烷蝶呤是产甲烷菌的生长和能量代谢中至关重要的一种修饰的叶酸盐。
甲烷呋喃和H4MPT在CO2向甲基的可逆性还原中充当一碳载体。H4MPT参与甲烷形成中的多个步骤，如在参与氨基酸和核苷酸代谢的一碳反应中。尽管在古菌和一类细菌(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens))中存在H4MPT，但是这两种叶酸盐(叶酸盐和甲烷蝶呤)的生物合成途径是不同的，这表明了它们在细胞的生理机能中起不同的功能作用(Dumitru和Ragsdale，2004)。
辅酶F420或8-羟基-5-脱氮黄素是参与许多放线菌(Actinobacteria)中以及偶尔其它细菌谱系中的产甲烷菌中的氧化还原反应的双电子转移辅酶。它以不同的水平存在于所有的产甲烷型菌种中并且也已经在灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)和组囊藻(Anacystisnidulans)中被鉴定出。所述辅酶的至少四种不同的形式已经有所描述，全部都含有具有由两个、三个、四个或五个谷氨酸残基构成的延伸侧链的脱氮核黄素发色团。辅酶F420-2(即具有由两个谷氨酸残基组成的侧链)似乎是存在于氢营养型产甲烷菌中的辅酶形式，而甲基营养型菌种含有辅酶F420-4和F420-5(Reynolds和Colleran，1987)。
辅酶F420的特征之一在于它充当CO2向甲基的还原中的两个步骤的电子供体。来自史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibactersmitthii)的F420依赖性NADP氧化还原酶催化NADP+与F420之间在产甲烷期间重要的电子转移步骤。在该反应期间，NADP通过从F420接受一个或多个氢负离子(H-)而被还原成NADPH。这是诸如史氏甲烷短杆菌的产甲烷细菌中甲烷形成的重要步骤。因此，NADP氧化还原酶在甲烷的形成中起重要作用(Sharma等，2011)。
辅酶M(CoM)，即2-硫烷基乙磺酸盐是在自然界中已知的最小辅因子。这种辅因子在巯基上被甲基化，从而形成CH3-S-CoM，即甲基还原酶的底物，所述甲基还原酶催化所有产甲烷途径中的最终步骤。辅酶B，即2-[(7-巯基-1-氧代庚基)氨基]-3-膦酰氧基丁酸是甲基-辅酶M还原酶的第二底物，并且由于所述反应，与CoM形成异二硫化物(heterodisulfide)复合体(CoB-S-S-CoM)(Ferry，2002)。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶也是在甲烷短杆菌属菌株中的甲烷产生中非常关键的另一种酶，这是因为古菌是仅有的已知具有生物合成的HMG-CoA还原酶的细菌(Miller和Wollin，2001)。
利用H2作为电子供体使CO2还原成CH4(反应1)是作为本发明的重点的产甲烷途径。
4H2+CO2→CH4+2H2O，△Go′＝-130.4kJ/molCH4(1)
在嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)菌株存在下观测到所述CO2还原途径(Ferry，2002)。
在CO2还原成CH4期间所遵循的步骤如下：首先二氧化碳被还原到甲酰基水平，然后甲酰基被还原到甲醛水平，在随后的步骤中，亚甲基被还原到甲基水平并且最终，甲基被转化成甲烷。所有四个还原步骤均简要地描述于下文中(Ferry，1992)。
1.二氧化碳向甲酰基水平的还原
CO2向甲酰基水平的还原是由甲酰基-甲烷呋喃脱氢酶(FMF)催化的。FMF是所述途径中的第一稳定中间体。酶在相反方向上的活性与嗜热自养甲烷杆菌菌株的所有提取物中甲基紫精或辅酶F420的还原有关。
2.甲酰基水平向甲醛水平的还原
在还原之前，将甲酰基转移到5，6，7，8-四氢甲烷蝶呤中，如反应2中所示，然后通过脱水环化而转化成次甲基衍生物，如反应3中所示。
FMF+H4MPT→5-甲酰基-H4MPT+2MF，△Go′＝-4.4kJ/mol(2)
5-甲酰基-H4MPT+H+→5，10-次甲基-H4MPT++H2O，ΔGo′＝-4.6kJ/mol(3)
利用还原型辅酶F420使5，10-次甲基-H4MPT+还原到甲醛水平示于反应4中。
5，10-次甲基-H4MPT++F420H2→5，10-亚甲基-H4MPT+F420+H+，△Go′＝+6.5kJ/mol(4)
辅酶F420是如上所述的给予或接受氢负离子的必要的双电子载体(氧化还原电位：约-350mV)。5，10-亚甲基-H4MPT脱氢酶活性的消失造成在纯化程序期间或在暴露于空气后对作为电子受体的F420的依赖性增加。
3.亚甲基向甲基水平的还原
5，10-亚甲基-H4MPT还原酶利用还原型F420(F420H2)作为生理性电子供体以进行反应5。
5，10-亚甲基-H4MPT+F420H2→5-甲基-H4MPT+F420，△Go′＝-5.2kJ/mol(5)
这一反应在任何一个方向上进行；然而，生理学上相关的亚甲基还原在热力学上是有利的。由于H2是电子源(反应6)，因此所述还原是放能的并且因此可能与主要的电化学电位的产生有关。
5，10-亚甲基-H4MPT+H2→5-甲基-H4MPT，△Go′＝-14kJ/mol(6)
4.甲基向甲烷的转化
a.甲基向辅酶M的转移
在还原之前，将5-甲基-H4MPT的甲基转移到辅酶M(HS-CoM)中，如反应7中所示。
5-甲基-H4MPT+HS-CoM→CH3-S-CoM+H4MPT，△Go′＝-29.7kJ/mol(7)
b.CH3-S-CoM向甲烷的还原去甲基化
CH3-S-CoM甲基还原酶催化反应8。在所述途径的最终还原步骤中，CoM-S-S-HTP被还原成对应的巯基辅因子(反应9)。
CH3-S-CoM+HS-HTP→CH4+CoM-S-S-HTP，△Go′＝-45kJ/mol(8)
CoM-S-S-HTP+H2→HS-CoM+HS-HTP，△Go′＝-40kJ/mol(9)
本发明提供了用于抑制酶和辅酶的另外的实施方案，所述酶和辅酶如上所述是产甲烷过程的不可缺少的部分。所靶向的酶是甲烷蝶呤，并且所靶向的辅酶是辅酶F420以及辅酶A和辅酶M。
生物合成酶，即4-(β-D-呋喃核糖基)氨基苯-5′-磷酸(β-RFA-P)合酶催化甲烷蝶呤生物合成中的第一步骤。甲烷蝶呤的还原形式，即H4MPT参与产甲烷中的多个步骤；它还代替四氢叶酸的功能，所述四氢叶酸是真核生物和细菌中主要的一碳载体。鉴于H4MPT在产甲烷菌的生长和能量产生中的重要性，对RFA-P合酶的抑制应当特异性地阻止甲烷蝶呤的生物合成并且从而阻止产甲烷，而对其它细菌的代谢没有不利的影响。许多研究人员已经进行研究来支持上述假设(Dumitru等，2003)。在甲烷蝶呤生物合成的第一步骤期间，RFA-P合酶催化磷酸核糖基焦磷酸酯(PRPP)和pABA转化成CO2、无机焦磷酸盐以及β-RFA-P。
一些研究人员对产甲烷型RFA-P合酶进行了部分纯化和表征，并且来自闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)的酶被纯化至均一，克隆并且异源性地过表达。所述反应经由氧基碳正离子中间体和它与pABA的加合物进行(Rasche和White，1998)。然而，最重要的是，其它研究小组(Dumitru等，2003)集中在设计作为pABA的结构类似物的竞争性抑制剂。抑制RFA-P合酶的pABA类似物具有高度选择性，这是因为氨基是大部分的pABA依赖性反应中的亲核体，而环碳4是RFA-P合酶催化的反应中的亲核体。
由Dumitru等(2003)所提出的抑制剂在产甲烷菌的纯培养物中损伤RFA-P合酶活性并且抑制产甲烷。向培养物中供给过量的天然底物pABA减轻了所述抑制作用，这表明RFA-P合酶是细胞靶标。所述抑制剂对产乙酸型细菌的生长没有不利影响。
必须指出的是，pABA还更广泛地被称为维生素B10。维生素B10是复合维生素B的一部分并且被认为是水溶性维生素。pABA是蝶酰谷氨酸酯的组分；它曾经被认为是维生素并且被命名为维生素B-x，这是因为它作为维生素原用于一些细菌。
Dumitru等(2003)合成了各种抑制剂，所有这些抑制剂均是pABA的N-取代的衍生物，并且使用PFA-P合酶来测定它们的抑制常数。结果表明在RFA-P合酶中pABA的结合位点在氨基附近具有相对大的疏水袋。测试所述pABA类似物中的每一种抑制产甲烷菌马氏甲烷杆菌(M.marburgensis)(原先被称为嗜热自养甲烷杆菌)的产甲烷作用和生长的能力。在生长完全受到抑制的马氏甲烷杆菌培养物的顶空中测量到很少量的甲烷。在100nM，目前最强效的抑制剂，即4-[(2-吡啶甲基)氨基]苯甲酸完全抑制了马氏甲烷杆菌的产甲烷菌生长和甲烷形成。将培养基补充以pABA完全逆转了抑制作用，这表明pABA与抑制剂之间在细胞靶标处的竞争性相互作用，所述细胞靶标最有可能是RFA-P合酶。
产乙酸作用是在许多的无氧生境中与产甲烷作用竞争的一种厌氧的和氢营养型细菌过程。测试所述抑制剂中的每一种对产乙酸型细菌热醋穆尔氏菌(M.thermoacetica)的生长的影响。甲烷蝶呤并不是细菌存活所必需的；因此，在此所述的RFA-P合酶抑制剂中没有一种在高达1mM的浓度下影响了热醋穆尔氏菌的生长(Dumitru等，2003)。
测试所述抑制剂对甲烷形成和挥发性脂肪酸(VFA)产生的影响。5mM的4-(乙氨基)苯甲酸酯或9mM的4-(异丙基氨基)苯甲酸酯完全抑制了甲烷的产生。5mM的4-(2-羟基乙氨基)苯甲酸酯将甲烷的产生抑制到对照水平的2.5％。作为对照，1mM的溴代乙磺酸盐(一种甲基-辅酶M还原酶抑制剂)在所有实验中均完全抑制了(P＜0.01)甲烷的产生(Dumitru等，2003)。
还测试了有效抑制剂中的一些对VFA产生的影响。以完全阻止产甲烷的浓度添加RFA-P合酶抑制剂没有抑制VFA的产生。举例来说，当将7mM的4-乙氨基苯甲酸酯添加到人工瘤胃系统中时，相对于未暴露于抑制剂的对照，乙酸盐(P＜0.05)和丙酸盐(P＜0.10)水平升高。这些结果与使用产乙酸型细菌的纯培养物进行的研究是一致的，并且表明所述抑制剂对其它细菌没有不利影响(Dumitru等，2003)。
Sharma等(2011)测试了洛伐他汀(Lovastatin)和康帕克汀(Compactin)(美伐他汀(Mevastatin))在产甲烷期间对来自史氏甲烷短杆菌的F420依赖性NADP氧化还原酶所具有的潜在抑制作用。基于他们的研究结果，发现洛伐他汀和康帕克汀(美伐他汀)这两种化合物均有效作为F420依赖性NADP氧化还原酶蛋白质的潜在抑制剂。
根据本发明，本发明的组合物内的天然存在的他汀类药物(statin)发挥了抑制产生甲烷的生物体的途径内的甲烷产生的功能。一种这样的天然存在的他汀类药物是洛伐他汀，它可以从红曲米以及其它来源中获得。洛伐他汀(C24H36O5)是真菌生长繁殖期(次生相)的次生产物并且是酶3-羟基-3-乙基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶(人类的胆固醇产生途径中的关键酶)的抑制剂。人类的胆固醇形成与古菌的细胞膜形成之间存在相似性，这是因为古菌的细胞膜中磷脂的脂质侧是类异戊二烯链。类异戊二烯形成是胆固醇产生途径(甲羟戊酸途径)的中间步骤并且HMG-CoA还原酶也是产生它的关键酶。因此，作为HMG-CoA还原酶的抑制剂，洛伐他汀抑制了古菌中类异戊二烯的产生并且因此抑制了胆固醇的合成和膜的形成。Wolin和Miller(2005)证实洛伐他汀显著地减少了纯产甲烷细菌的生长和活性而对纤维分解细菌没有任何负面影响。
如上所述，F420H2-NADP是在催化NADP+与F420之间的电子转移步骤期间起作用，从而通过接受来自F420的一个或多个氢负离子(H-)将NADP还原成NADPH的辅酶中的一种。
Sharma等(2011)确定了来自史氏甲烷短杆菌的F420依赖性NADP氧化还原酶的三维模型结构。基于他们的F420依赖性NADP氧化还原酶的蛋白质模型，他们检测到这些残基构成了配体结合位点袋，并且在进一步研究之后，他们发现配体F420结合在蛋白质腔处。抑制剂化合物洛伐他汀和康帕克汀(美伐他汀)与天然配体F420相比对模型蛋白质显示出更大的亲和力。它们与F420共用相同的腔并且由相似的残基围绕。换句话说，抑制剂化合物洛伐他汀和康帕克汀(美伐他汀)非常有效地阻断用于产生甲烷的活性位点，这是因为酶不能与底物结合，从而使得甲烷产生减少。洛伐他汀是从土曲霉(Aspergillusterreus)的培养物中分离的真菌代谢物并且康帕克汀(美伐他汀)是来自短密青霉菌(Penicilliumbrevicopactum)的抗真菌代谢物。Sharma等(2011)确定洛伐他汀和康帕克汀(美伐他汀)可以用作F420依赖性NADP氧化还原酶蛋白质的强效抑制剂以阻断它的活性位点。
研究人员已经发现红曲米，一种通过使酵母(紫红曲霉(Monascuspurpureus))在水稻上发酵而制成的亚洲主食，含有诸如洛伐他汀的他汀类药物的活性成分。因此，研究已经证实红曲米可以成功地抑制关键酶羟基甲基戊二酸单酰-SCoA(HMG-CoA)还原酶，从而引起对产甲烷活性的抑制。
Miller和Wolin(2001)还使用洛伐他汀来抑制关键前体甲羟戊酸酯的形成。甲羟戊酸酯是由羟甲基戊二酸单酰-SCoA(HMG-CoA)的还原而形成的。基于他们的结果，他们发现洛伐他汀抑制甲烷短杆菌的生长和CH4的产生。实际上，每毫升培养基4nmol对生长产生50％的抑制作用并且每毫升培养基≥10nmol的浓度完全抑制生长。甲烷形成也被显著抑制。同时，非产甲烷菌的群体没有受到影响。
辅酶M(CoM；HSCH2CH2SO3 -)是存在于所有产甲烷菌中，但是不存在于其它细菌或古菌中的辅因子(Liu和Whitman2008)。CoM参与甲烷生物合成的最终步骤，其中由CoM所带有的甲基由甲基-CoM还原酶还原成甲烷。涉及这一组的产甲烷抑制剂通常包括2-溴代乙磺酸盐(BES)、2-氯代乙磺酸盐(CES)、2-巯基乙磺酸盐(MES)、以及2，4-二氧四氢蝶啶(Liu等，2011)。这些抑制剂可以竞争性地制约在使用H2和CO2的产甲烷菌中在甲烷形成期间的最终还原步骤时的甲基转移反应。在正常情况下，这些化合物可以相对低的浓度抑制所有组的产甲烷菌。CoM和BES的传统结构类似物已经被广泛使用并且在微生物研究中被认为是产甲烷菌特异性抑制剂。Conrad等(2000)报道10mMBES是抑制水稻根系中的厌氧产甲烷菌的最佳浓度。在厌氧消化器的高温环境中，通过使用至少50mM的BES实现了对产甲烷的完全抑制。与乙酸分解型产甲烷菌相比，抑制氢营养型产甲烷菌需要更高的BES浓度(Zinder等，1984)；然而，类似的系统只需要10mM的BES来抑制产甲烷过程(Siriwongrungson等，2007)。其它研究证实在土壤中5mM-20mM的浓度(Wüst等，2009)确实有效抑制产甲烷。MES和CES也具有相似的抑制作用并且用于降低连续流产甲烷固定膜柱中的产甲烷活性(Bouwer和McCarty1983)。各种报道证实蝶呤化合物2，4-二氧四氢蝶啶[2，4-(1H，3H)-蝶啶二酮]以0.6mM的浓度完全抑制多种产甲烷型古菌的生长并且对于嗜热自养甲烷杆菌菌株马尔堡(Marburg)菌株具有杀细菌性(Nagar-Anthal等，1996)。
因此，上文被认为是仅说明了本发明的原理。此外，由于许多的修改方案和变化方案将容易被本领域技术人员想到，因此并不期望将本发明限于所示的和所描述的确切构造和操作，并且因此，可以采用落入本发明的范围的所有合适的修改方案和等同方案。
实施例
“甲烷抑制剂RYR”的有效性的工作台测试
目的
实验室研究的目的在于评价甲烷抑制剂RYR(MIRYR)的有效性，所述甲烷抑制剂RYR是由本文的发明人所研发的本发明的组合物。所述产品被设计成在其中产甲烷菌被建立并且具有活性的环境中抑制甲烷的产生。
材料和方法
利用两个厌氧反应器，即对照反应器和测试反应器。将这两个反应器用含有活性产甲烷群体的生物质处理的过期的膳食补充剂接种。每周对反应器进料一次，并且以厌氧序批式反应器的形式操作，如由Cassidy等(2008a、2008b)所述，该文献以引用的方式并入本文。[CassidyDP，HirlPJ，BeliaE.(2008a).在厌氧序批式反应器中由乙醇共产物产生甲烷(Methaneproductionfromethanolco-productsinanaerobicsequencingbatchreactors)，WaterScience&Technology.58(4)：789-793；CassidyDP，HirlPJ，BeliaE.(2008b).在厌氧序批式反应器中由干酒糟及其可溶物(DDGS)的可溶部分产生甲烷(Methaneproductionfromthesolublefractionofdistillers′driedgrainswithsolubles(DDGS)inanaerobicsequencingbatchreactors)，WaterEnvironmentResearch.80(6)：570-575]。
在启动的第一周期间，所述反应器仅容纳产甲烷型培养物而没有土壤。在一周之后，添加粉砂，从而产生具有20重量％的固体浓度的浆液。将反应器用粉砂再操作一周，以确保沙不会影响产甲烷活性。
生物反应器具有2.5L的容积，容纳2L的浆液。所述反应器是气密的，并且特别被设计用于厌氧反应。将所述反应器维持在实验室温度22℃-24℃。通过每周一次供给膳食补充剂来操作反应器。在进料之后目标初始化学氧化要求(chemicaloxidationdemand，“COD”)浓度是2000mg/L。在整个这周期间，如下测量所产生的生物气体的体积。定期将注射器插入到反应器顶部的填有隔膜的端口中以采集甲烷含量的气体样品。然后通过将生物气体样品注射到气相色谱仪-火焰离子化检测器(GC-FID)中来对所述生物气体样品的甲烷含量进行定量。所述反应器具有专用的探针以测量pH值和氧化还原电位(“ORP”)。在每个周期之后(即在进料之前)，将探针插入反应器中以测量总溶解固体(“TDS”)，并且采集样品以测量COD。在采样和进料期间关闭混合器以使向反应器内容物中的氧气引入减到最低程度。
最初向测试反应器中给予40g/L浓度的甲烷抑制剂RYR(MIRYR)。在一周以后，向对照给予20mg/L的MIRYR。
结果
研究的前两周是启动阶段，并且后两周是测试阶段。启动阶段在两个反应器中建立了产甲烷群体。在启动的第一周期间，在没有粉砂的情况下操作反应器，并且在第二周时，在存在粉砂(20重量％)的情况下对它们进行操作。测试阶段开始于向测试反应器中给予MIRYR(40g/L)。在测试阶段的第一周期间，将对照保持为适当的对照，没有添加MIRYR。由于40mg/L剂量的MIRYR在测试反应器中减少了甲烷的产生，因此决定在测试阶段的第二周期间向对照反应器中给予20g/L的MIRYR。测试阶段持续了17天。
表1列出了在研究期间在对照反应器和测试反应器中所测量的生物气体产生的体积、pH值、以及COD的浓度、ORP和TDS。在反应器中在每个进料周期(即每一周)所产生的生物气体的体积在72mL-82mL的范围内。值得注意的是，气体的体积没有受到在启动阶段的第2周期间粉砂的引入的影响。在测试阶段的第一周内向测试反应器中添加40mg/L的MIRYR以及在测试阶段的第二周期间添加20mg/L的MIRYR对反应器中生物气体的体积没有明显影响。在每个序批式反应器周期后COD的测量值在56mg/L至108mg/L的范围内。在每个周期向反应器中供给2000mg/L，因此表1中的COD浓度表明COD由厌氧培养物所消耗。pH值在6.1至6.4的范围内。ORP值均接近-300mV，这是产甲烷条件特有的。反应器中的TDS在约1200mg/L至1250mg/L的范围内。
表1：在整个研究期间在对照反应器和测试反应器中生物气体体积、pH值、以及COD浓度、ORP和TDS的列表。
表2列出了在17天研究阶段期间在反应器中所产生的生物气体中所测量的甲烷含量。图1示出了表2中所列的甲烷浓度的图表。在启动阶段期间，甲烷浓度从约55％至70％变动，这表明了活性产甲烷型培养物。测试反应器中40mg/L的MIRYR剂量在11天之后使生物气体的甲烷含量从62％减少到低于检测限度(0.05％)。到第17天为止，当拆除反应器时，在测试反应器中甲烷浓度仍低于检测限度。在第7天时对照反应器中20mg/L的MIRYR剂量到第17天时(即在10天之后)使生物气体的甲烷含量从65％减少到低于检测限度(0.05％)。在测试阶段期间，在测试反应器和对照反应器中所产生的生物气体的体积没有明显变化(表1)，只有生物气体的甲烷浓度发生变化。
表2：在测试阶段期间(即在给予甲烷抑制剂之后)在生物气体中所测量的甲烷浓度(％)的列表。
活性 时间(天) 对照(％) 测试(％)
接受给药的测试(40mg/L) 0 57 62
2 61 47
4 68 32
6 59 20
接受给药的对照(20mg/L) 7 65 13
9 51 6
11 31 0
13 22 0
15 8 0
17 0 0
图1：表2中所列的甲烷浓度的图表。
应当了解的是，本发明不限于所公开的实施方案和实施例，而是意图涵盖所附权利要求书的精神和范围内所包括的各种修改方案和等同布置。

Claims (15)

1.一种用于抑制产甲烷菌的甲烷产生的方法，所述方法包括使所述产甲烷菌与有效量的组合物接触，所述组合物包含红曲米、维生素B10衍生物或乙磺酸盐或所述红曲米、维生素B10衍生物或乙磺酸盐的任何组合，所述有效量足以引起对甲烷产生的抑制。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述产甲烷菌位于环境介质中。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述环境介质是土壤或地下水。
4.如权利要求3所述的方法，所述方法引起所述土壤或地下水的还原脱氯。
5.如权利要求1所述的方法，其中包含维生素B10衍生物的所述抑制组合物阻断所述甲烷产生途径中的4-(β-D-呋喃核糖基)氨基苯-5'-磷酸(β-RFA-P)合酶。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制组合物阻断所述甲烷产生途径中的3-羟基-3-乙基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制组合物阻断所述甲烷产生途径中的8-羟基-5-脱氮黄素(辅酶F420)。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制组合物是天然存在的他汀类药物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述天然存在的他汀类药物是洛伐他汀。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述洛伐他汀的来源是红曲米。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制组合物阻断所述甲烷产生途径中的2-硫烷基乙磺酸盐(辅酶M)。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述辅酶M抑制组合物是选自以下各项的乙磺酸盐：2-溴代乙磺酸盐(BES)、2-氯代乙磺酸盐(CES)、2-巯基乙磺酸盐(MES)、或2,4-二氧四氢蝶啶。
13.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括将可发酵的基质添加到所述环境介质中的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述可发酵的基质是油，所述油包括植物油、花生油、玉米油或鱼油。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述可发酵的基质是碳水化合物，所述碳水化合物包括葡萄糖或可发酵的产生葡萄糖的化合物。
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