CN105238870B - 一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒 - Google Patents

一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明提供的引物序列如SEQ ID:1‑4所示，通过在NCBI的嗜水气单胞菌ATCC7966株基因序列库中检索氨基糖苷类耐药基因序列并设计特异性引物，能够对嗜水气单胞菌aac(6’)‑Iz、aph等氨基糖苷类耐药基因进行快速检测。本发明还公开了包含上述引物的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒，能在实验室内快速、准确地检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素相关耐药基因。

Description

一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物及试剂盒。
背景技术
氨基糖苷类抗生素是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，包括链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素等，按化学结构可把氨基糖苷类抗生素分为链霉胺类和2-脱氧链霉胺类。
氨基糖苷类抗生素抗菌谱较广，对许多革兰阴性菌、革兰阳性菌及结核分枝杆菌有抗菌作用，可以作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成的多个环节并破坏细菌细胞膜的完整性。此外，氨基糖苷类抗生素还可通过离子吸附作用附着于细菌菌体表面，造成细胞膜缺损，使膜通透性增加；氨基糖苷类抗生素导致翻译错误所形成的异常蛋白质也可能插入细胞膜，增加膜的通透性。
氨基糖苷类抗生素是广谱、高效抗生素，适合治疗由革兰阴性菌引起的严重感染，对肠杆菌科细菌有较强的抗菌活性，同时对假单胞菌属、气单胞菌属、产碱杆菌属等细菌也有一定作用，但对肠球菌属和链球菌属无效。
随着氨基糖苷类抗生素广泛而大量的使用，细菌对该类抗生素逐渐产生了抗药性，耐药菌的出现较大的限制了该类药物的应用，从而导致治疗失去效果。抗生素耐药性是由抗生素药物的不当使用造成的，细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药主要由氨基糖苷修饰酶引起，其耐药机制主要由靶位改变、通透性降低或转运能力丧失、钝化酶的产生等。临床上细菌对氨基糖苷类产生耐药的最重要原因是钝化酶的产生，即抗生素的氨基或羟基被酶修饰后与核糖体结合不紧密而不能进入下一阶段发挥抗菌作用，使得细菌在抗生素存在的情况下仍能存活。在细菌胞质内对抗生素进行修饰的氨基糖苷类钝化酶主要有氨基糖苷乙酰转移酶(aac)、氨基糖苷磷酸转移酶(aph)、氨基糖苷核苷转移酶(ant)等，而在嗜水气单胞菌中存在的钝化酶主要是aac(6’)-Iz和aph。
细菌耐药性检测可以分为常规表型检测(即药敏试验)和耐药基因检测，其中，前者首先需要从临床样品中分离纯化菌株，而有许多生长缓慢或对营养有特殊需求的菌株无法通过常规药敏试验检测其耐药性。近年来，聚合酶链式反应(PCR)已广泛应用于细菌耐药基因检测中并取得了很大进展，其操作相对简单，可在实验室内实现快速、准确检测。但是，针对嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因还没有开发出成熟的PCR试剂盒，目前的检测方法效率比较低、检测精度差、 特异性不强。为了克服上述缺陷，本发明设计了用于嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测的引物组合物，能够快速、准确地对耐药基因进行检测。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种快速、准确、操作简便的检测试剂盒，实现对嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因aac(6’)-Iz、aph的快速检测。
为解决上述技术问题，本发明采用如下引物对：
(1)扩增aac(6’)-Iz耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示；
(2)扩增aph耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
上述2对引物对在一次检测中共同使用。
上述检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物在制备嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的检测试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒，试剂盒包括如下试剂：
(1)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶1U、10×PCR反应缓冲液、Mg2+1.5mM、dNTP 200μM；
(2)引物混合液：将SEQ ID NO:1-4所示的4种引物混合，用ddH2O溶解，每条引物的浓度为2.5μM；
(3)阳性对照：分别含有aac(6’)-Iz、aph耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA的水溶液；
(4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液。
本发明的一个方面是提供了一种检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物组合物，其特征在于，包括如下引物对：
(1)扩增aac(6’)-Iz耐药基因的引物对，其核苷酸序列为
F1：5’-CCCATCTCAACGCCTTTC-3′(SEQ ID NO:1)；
R1：5’-AAGAAGACGACCCGCTCC-3′(SEQ ID NO:2)；
和/或
(2)扩增aph耐药基因的引物对，其核苷酸序列为
F2：5’-GCGATTCCCTCTTGTTG-3′(SEQ ID NO:3)；
R2：5’-GCAGGCGAAGGTCTCA-3′(SEQ ID NO:4)；上述2对引物对在一次检测中单独或共同使用。
本发明的另一个方面是提供了一种上述检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物组合物在制备检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的试剂中的应用。
本发明的再一个方面是提供了一种嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述是试剂盒包含如上所述的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类 耐药基因的引物组合物。
进一步地，该试剂盒还包括如下试剂：
(1)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP；
(2)阳性对照：分别含有aac(6’)-Iz、aph耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA的水溶液；
(3)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液；
所述引物组合物中的引物以ddH2O溶解，每种引物的浓度为2.5μM。
进一步地，阳性对照中含耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA浓度为10ng/μL，阴性对照中大肠杆菌基因组DNA的浓度为20ng/μL。
本发明的再一个方面是提供了一种上述嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒在检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因中的应用
本发明的再一个方面是提供了一种非诊断和治疗目的的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药性的方法，将样品进行PCR扩增，以上述的引物组合物对样品进行扩增，所得PCR样品进行检测，具有扩增结果的即为样品具有耐药性，否则测对氨基糖苷类敏感。
本发明的再一个方面是提供了一种非诊断和治疗目的的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药性的方法，将样品进行PCR扩增，包括如下步骤：
(a)PCR反应液的制备：从-20℃冰箱中取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟内，按检测样本数(n)配置PCR反应液XμL；
(b)X＝(9μL PCR反应液+4μL引物组合物混合液+5μL ddH2O)×(样本数n+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
振荡混匀后，3000rpm离心10s，按每份18uL分装到0.2mL PCR反应管中备用；
(c)加样：向分装好试剂的反应管中，分别加入细菌样本DNA模板2μL，阳性对照孔加入2μL阳性对照品，阴性对照孔加入2μL阴性对照品，空白对照孔加入2μLddH2O，加样过程要求冰上操作，3000rpm离心10s，放入PCR仪进样槽；
(d)PCR扩增：进行嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测，反应条件如下：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃10min；反应体积设为20μL，设定后运行；
(e)凝胶电泳检测：采用常规方法制备1.2％琼脂糖凝胶后放入加有TAE缓冲液的电泳槽中待用；将PCR样品取出后加入3μL上样缓冲液后混匀，取5μL样品加入胶孔中于90V电压下电泳30min，电泳完成后取出凝胶置于凝胶成像仪中拍照并记录结果；结果中具有条带说明样品对氨基糖苷类药物耐药，不具有条带则表明对氨基糖苷类药物敏感；
所述引物组合物如上所示。
上述嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒在检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果：
(1)通过在NCBI的嗜水气单胞菌ATCC7966株基因序列库中检索氨基糖苷类耐药基因序列并设计特异性引物，能够对嗜水气单胞菌aac(6’)-Iz、aph等氨基糖苷类耐药基因进行快速检测。
(2)本发明所述的引物序列和试剂盒具有操作简便、快速、准确、成本低廉等优点，可用于辅助临床快速诊断嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素的耐药情况，为临床治疗提供参考依据。
附图说明
图1为阳性对照品和空白对照品检测结果图，其中，M：DL2000分子量标准；泳道1：阳性对照品；泳道2：空白对照品。
图2为阴性对照品检测结果图，其中，M：DL2000分子量标准；泳道1-5分别以杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。
图3为2例嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药基因检测结果图，其中M：DL2000分子量标准；泳道1、2分别以2株嗜水气单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：合成引物对
检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类2种耐药基因aac(6’)-Iz、aph的核苷酸序列。2对特异性引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成：
扩增aac(6’)-Iz耐药基因的引物对：
F1(SEQ ID NO:1)：5’-CCCATCTCAACGCCTTTC-3′；
R1(SEQ ID NO:2)：5’-AAGAAGACGACCCGCTCC-3′；
扩增aph耐药基因的引物对：
F2(SEQ ID NO:3)：5’-GCGATTCCCTCTTGTTG-3′；
R2(SEQ ID NO:4)：5’-GCAGGCGAAGGTCTCA-3′。
实施例2：试剂盒的制备方法。
(1)PCR反应液：包括DNA聚合酶1U、10×PCR反应缓冲液2μL、Mg2+1.5mM、dNTP 200μM，-20℃保存；
(2)引物混合液：将SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成后，混合于一管中，用ddH2O溶解，每条引物的终浓度为2.5μM，-20℃保存；
(3)阳性对照：分别含有aac(6’)-Iz、aph耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA的水溶液；
(4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液；同时以杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌基因组DNA的水溶液为模板检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因引物的特异性。
实施例3：检测方法。
仪器：BioRad PCR检测仪(S1000)、Sigma低温高速离心机(3K15)、IKA漩涡混匀仪(lab dancer)、BioRad电泳仪(PowerPac HV)、BioRad凝胶成像仪(Universal Hood II)；
(1)嗜水气单胞菌基因组DNA模板的制备：参考公开的文献，采用相关的商品化细菌基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书制备细菌基因组DNA，作为PCR反应模板备用。
(2)以步骤(1)所述基因组DNA为模板，利用2对特异性引物进行嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因aac(6’)-Iz、aph的扩增检测，具体包括如下步骤：
(2a)PCR反应液的制备：从-20℃冰箱中取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟内，按检测样本数(n)配置PCR反应液XμL；
(2b)X＝(9μL PCR反应液+4μL引物混合液+5μL ddH2O)×(样本数n+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。
振荡混匀后，3000rpm离心10s，按每份18uL分装到0.2mL PCR反应管中备用。
(2c)加样：向分装好试剂的反应管中，分别加入细菌样本DNA模板2μL，阳性对照孔加入2μL阳性对照品，阴性对照孔加入2μL阴性对照品，空白对照孔加入2μLddH2O，加样过程要求冰上操作，3000rpm离心10s，放入PCR仪进样槽。
(2d)PCR扩增：BioRad PCR仪进行嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测，反应条件如下：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃10min。反应体积设为20μL，设定后运行。
(2e)凝胶电泳检测：采用常规方法制备1.2％琼脂糖凝胶后放入加有TAE缓冲液的电泳槽中待用。将PCR样品取出后加入3μL上样缓冲液后混匀，取5μL样品加入胶孔中于90V电压下电泳30min，电泳完成后取出凝胶置于凝胶成像仪中拍照并记录结果。
实施例4：临床嗜水气单胞菌样品检测
将本发明所述的试剂盒用于10例嗜水气单胞菌样本氨基糖苷类耐药基因检 测，检测结果与菌株耐药谱进行比对，检测结果如表1所示：
表1嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测结果
样本编号 试剂盒检测结果 菌株氨基糖苷类耐药谱
1 阳性 耐药
2 阴性 敏感
3 阴性 敏感
4 阴性 敏感
5 阴性 敏感
6 阳性 耐药
7 阴性 敏感
8 阳性 耐药
9 阴性 敏感
10 阴性 敏感
利用本发明提供的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的试剂盒分析10例样本得到的检测结果与样本耐药谱结果一致。图1-3为本发明的部分检测图，图1为阳性对照品和空白对照品检测结果图，在阳性对照品检测结果中可见两条目的条带，分别为aph基因的485bp和aac(6’)-Iz基因的304bp；图2为阴性对照品检测结果图，大肠杆菌检测结果为阴性，同时可见在气单胞菌属其他种如杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌基因组DNA中均无目的条带扩增；图3为2例嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药基因检测结果图，可见有清晰的485bp和304bp两条目的条带。由此可见，本发明的引物组合物的特异性高，与其他类似基因组无重合。
10例样品中，3例为氨基糖苷类耐药基因阳性，其余7例为阴性，且检测结果与菌株对氨基糖苷类抗生素的耐药谱一致。
本发明提供的试剂盒对嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的正确率为100％，效率也大幅提高。
本试剂盒具有操作简便、快速、准确、成本低廉等优点，可用于辅助临床快速诊断嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素的耐药情况，以改善治疗方案，减少抗生素的滥用。该技术方案门槛低，适用于其他菌株耐药基因的检测，具有较好的应用前景。

Claims (9)

1.检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物组合物，其特征在于，包括如下引物对：
(1)扩增aac(6’)-Iz耐药基因的引物对，其核苷酸序列为
F1：5’-CCCATCTCAACGCCTTTC-3'(SEQ ID NO:1)；
R1：5’-AAGAAGACGACCCGCTCC-3'(SEQ ID NO:2)；
和
(2)扩增aph耐药基因的引物对，其核苷酸序列为
F2：5’-GCGATTCCCTCTTGTTG-3'(SEQ ID NO:3)；
R2：5’-GCAGGCGAAGGTCTCA-3'(SEQ ID NO:4)；上述2对引物对在一次检测中共同使用。
2.权利要求1所述的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物组合物在制备检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的试剂中的应用。
3.一种嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述是试剂盒包含如权利要求1所述的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因的引物组合物。
4.根据权利要求3所述的一种嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括如下试剂：
(1)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP；
(2)阳性对照：分别含有aac(6’)-Iz、aph耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA的水溶液；
(3)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液；
所述引物组合物中的引物以ddH2O溶解，每种引物的浓度为2.5μM。
5.根据权利要求4所述的嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照还包含杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌基因组DNA的水溶液。
6.根据权利要求4所述的嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒，其特征在于，阳性对照中含耐药基因的嗜水气单胞菌基因组DNA浓度为10ng/μL，阴性对照中大肠杆菌基因组DNA的浓度为20ng/μL。
7.根据权利要求3-6任一项所述的嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测试剂盒在非诊断和治疗目的的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因中的应用。
8.一种非诊断和治疗目的的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药性的方法，将样品进行PCR扩增，以权利要求1所述的引物组合物对样品进行扩增，所得PCR样品进行检测，具有扩增结果的即为样品具有耐药性，否则对氨基糖苷类敏感。
9.一种非诊断和治疗目的的检测嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药性的方法，将样品进行PCR扩增，包括如下步骤：
(a)PCR反应液的制备：从-20℃冰箱中取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用；加样前10分钟内，按检测样本数(n)配置PCR反应液XμL；
(b)X＝(9μL PCR反应液+4μL引物组合物混合液+5μL ddH2O)×(样本数n+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
振荡混匀后，3000rpm离心10s，按每份18uL分装到0.2mL PCR反应管中备用；
(c)加样：向分装好试剂的反应管中，分别加入细菌样本DNA模板2μL，阳性对照孔加入2μL阳性对照品，阴性对照孔加入2μL阴性对照品，空白对照孔加入2μLddH2O，加样过程要求冰上操作，3000rpm离心10s，放入PCR仪进样槽；
(d)PCR扩增：进行嗜水气单胞菌氨基糖苷类耐药基因检测，反应条件如下：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃10min；反应体积设为20μL，设定后运行；
(e)凝胶电泳检测：采用常规方法制备1.2％琼脂糖凝胶后放入加有TAE缓冲液的电泳槽中待用；将PCR样品取出后加入3μL上样缓冲液后混匀，取5μL样品加入胶孔中于90V电压下电泳30min，电泳完成后取出凝胶置于凝胶成像仪中拍照并记录结果；结果中具有条带说明样品对氨基糖苷类药物耐药，不具有条带则表明对氨基糖苷类药物敏感；
所述引物组合物如权利要求1所示。
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