CN105229173A - Egfr突变血液测试 - Google Patents

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Abstract

评价主体中的实体瘤癌症状态的改良方法涉及检测主体血液中的肿瘤相关突变。

Description

EGFR突变血液测试
提供了评价主体中的实体瘤癌症（例如NSCLC）状态的改良方法，其涉及在主体血液中的肿瘤相关突变检测，所述肿瘤相关突变例如在EGFR核酸序列中。本发明进一步提供了鉴定用于靶向药物疗法的候选非小细胞肺癌（NSCLC）患者的方法，其包括：检测来自患者的血液中一种或多种突变的表皮生长因子受体（EGFR）序列的存在或不存在；将NSCLC患者的转移状态评价为M1a或M1b；并且基于至少检测到的患者血液中的一种或多种突变EGFR序列的存在，以及患者中的NSCLC的转移状态，将患者鉴定为用于靶向药物疗法的候选者。
发明背景
影响各种细胞增殖途径的种系和体细胞突变可以影响患者中的癌症发展。例如，对具有此类突变的细胞赋予生长优势的体细胞突变的获得视为癌性肿瘤的出现和进展中的重要因素。因为许多此类突变得到鉴定，所以开发了靶向由突变基因编码的蛋白质的疗法，以及靶向其中涉及这些突变基因的信号传导途径的疗法。因为这些靶向疗法在临床实践内实现，所以发现对靶向疗法赋予抗性的突变在患者的癌性肿瘤中发展且累积，随着时间过去致使疗法无效且使得必须改变治疗过程。
其中体细胞肿瘤突变已知起重要作用的实体瘤癌症的一个实例是肺癌，其是许多国家包括美国中的癌症相关死亡率的主因。大约75%的肺癌病例属于非小细胞肺癌（NSCLC），其具有大约12%的总体5年存活率。标准手术治疗以及化学疗法和放射疗法在NSCLC领域中是可用的。然而，大多数NSCLC病例最初在不宜手术的晚期时被诊断，并且复发在手术、化学疗法、放射疗法及其他治疗后是常见的。相应地，NSCLC的治疗和诊断是有挑战性的医学问题。解决该问题的一种尝试是开发靶向药物疗法，其干扰表皮生长因子受体（EGFR）的信号传导。其为酪氨酸激酶的生长因子受体家族成员的EGFR，涉及与细胞分裂相关的信号传导途径，并且牵涉NSCLC发展和进展。
抑制EGFR的酪氨酸激酶活性的小分子药物埃罗替尼和吉非替尼得到评估且批准用于治疗晚期的NSCLC。然而，发现这些药物在大多数NSCLC患者中是无效的，但在其肿瘤含有体细胞EGFR突变的患者子集中最有效，所述体细胞EGFR突变导致EGFR的酪氨酸激酶活性中的增加。这类突变通常被称为“活化”。还发现了在NSCLC患者中导致对酪氨酸激酶抑制剂疗法抗性的体细胞EGFR突变。这类突变通常被称为“抗性”。 在酪氨酸激酶抑制剂治疗过程期间，EGFR中的抗性突变在NSCLC患者中趋于上升。在不能通过酪氨酸激酶抑制剂疗法例如埃罗替尼和吉非替尼有效治疗的NSCLC的情况下，化学疗法或可能的其他靶向疗法可以用于延长存活。为了改善选择用于NSCLC患者的有效治疗的机率，因此重要的是测定患者的NSCLC肿瘤含有的体细胞EGFR突变对酪氨酸激酶抑制剂疗法是赋予敏感性还是抗性。
发明概述
本文描述的是评价患有实体瘤癌症的主体状态的改良方法，其包括检测患有实体瘤癌症的主体血液中的一种或多种肿瘤核酸突变的存在或不存在；并且基于检测到的一种或多种肿瘤核酸突变的存在或不存在，评价患有实体瘤癌症的主体的状态。改良方法可以涉及通过对血样或从血样中分离的总基因组DNA执行定量实时聚合酶链反应（PCR），检测一种或多种肿瘤核酸突变，其中所述血样得自患有实体瘤癌症的主体。本文还描述的是检测得自患有实体瘤癌症的主体的血样中的肿瘤突变的存在或不存在的改良方法，其包括使用对于突变的核酸序列特异性的引物，对血样执行定量实时聚合酶链反应（PCR），以生成PCR循环阈值。在本文描述的改良方法的一些实施方案中，考虑到患有实体瘤癌症的主体的转移状态，以便改善得自主体的血样中的突变肿瘤核酸序列的检测灵敏度。在一些其他实施方案中，得自患有实体瘤癌症的主体的血样中的一种或多种肿瘤核酸突变的存在或不存在的检测涉及：测定在血液中循环的突变序列的量，并且基于检测的量监控主体的癌症的状态。
本文描述的是评价患有远端转移NSCLC的主体状态的方法，其包括：检测来自患有远端转移期NSCLC的主体血液中的一种或多种突变EGFR核酸序列的存在或不存在；并且基于检测到的一种或多种突变EGFR核酸序列的存在或不存在，评价患有远端转移期NSCLC的主体的状态。本文还描述的是评价患有NSCLC的主体状态的方法，其包括：检测主体血液中的一种或多种突变EGFR核酸序列的存在或不存在；并且基于检测到的一种或多种突变EGFR序列的存在或不存在，评价主体的状态。本文还描述的是鉴定用于靶向药物疗法的候选NSCLC患者的方法，其包括：检测来自患者的血液中的一种或多种突变EGFR核酸序列的存在或不存在；将NSCLC患者的转移状态评价为M1a或M1b；并且基于至少检测到的患者血液中的一种或多种突变EGFR序列的存在，以及患者中的NSCLC的转移状态，将患者鉴定为用于靶向药物疗法的候选者。本文还公开的是评价患有实体瘤癌症的主体状态的方法，其包括检测来自患有实体瘤癌症主体的血液中的一种或多种肿瘤相关的突变核酸序列的存在或不存在；并且基于检测到的一种或多种突变的肿瘤相关核酸序列的存在或不存在，评价患有远端转移实体瘤癌症的主体的状态。此外，本文公开的是检测血样中的肿瘤相关突变的存在或不存在的方法，该方法包括：使用对于突变的核酸序列特异性的引物，对血样执行定量实时聚合酶链反应（PCR），以生成PCR循环阈值；并且将循环阈值与对照值相比较，其中所述对照值考虑到样品中的基因组DNA浓度，并且其中如果循环阈值低于对照值，则肿瘤相关突变存在于样品中，并且如果循环阈值高于对照值，则肿瘤相关突变不存在于样品中。还设想了治疗患有实体瘤癌症例如NSCLC的患者或主体的方法，并且包括在本文描述的方法的范围内。
本发明的实施方案的一些实例是评价患有实体瘤癌症的人主体状态的方法，其包括：定量得自患有实体瘤癌症的主体的样品中的核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变的量，其中所述主体已完成一个癌症疗法周期。在上述方法的一些实施方案中，癌症疗法包含一种或多种化学疗法和酪氨酸激酶抑制剂的施用。在一些实例中，酪氨酸激酶抑制剂是埃罗替尼或吉非替尼。本发明的实施方案的一些其他实例是评价患有实体瘤癌症的人主体状态的方法，其包括：在主体已经历癌症治疗之前，定量得自患有实体瘤癌症的主体的样品中的核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变的量。这些及其他实例可以组合到本发明的方法的实施方案中。上述方法的一些实施方案进一步包括：基于样品中的核酸序列的一种或多种癌症相关体细胞突变的量，评估主体中的实体瘤癌症的后果。后果可以是总体存活或无进展存活。在上述方法的一些更多实施方案中，癌症相关的体细胞突变的量高于阈值水平，并且该方法进一步包括主体的进一步治疗。进一步治疗可以包含手术、化学疗法、靶向药物疗法或其任何组合。例如，进一步治疗可以包含给主体施用化学治疗药物。在本文描述的方法的任何或所有实施方案中，样品可以是血浆样品。根据本文描述的方法的一些实施方案，核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变包含活化突变。根据本文讨论的方法的一些更多实施方案，核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变包含抗性突变。本文描述的本发明的一些实施方案是其中评价包括监控主体中的实体瘤癌症的方法。本文讨论的本发明的一些实施方案是这样的方法，其中如果样品中的核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变中的至少一种的数量超过阈值，则评价包括给主体施用靶向药物疗法。在此类实施方案的一些实例中，核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变是活化突变，并且靶向药物疗法是酪氨酸激酶抑制剂。在上述实施方案的一些其他实例中，如果检测到核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变数量中的增加，则评价进一步包括增加给主体施用的靶向药物疗法的剂量。在本文描述的方法的任何或所有实施方案中，检测可以包括执行定量实时聚合酶链反应。本文描述的方法的一些实施方案进一步包括对主体执行诊断程序。诊断程序的一个实例是放射学评估。在本文描述的方法的实施方案中，定量核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变的量可以在选自下述的核酸序列中执行：EGFR序列、KRAS序列、ALK序列、ALK融合物序列、ROS1、ROS1融合物序列、c-MET序列、PIK3CA序列、NRF2序列、FGFR1-3序列、AKT1序列、AKT1融合物序列、BRAF序列、包含V600E置换的序列、NRAS序列、TMPRSS2:ERG融合物序列、SPOP序列、RET序列、融合物序列、PPAR-γ序列、PPAR-γ融合物序列、IDH-1序列、IDH-2序列和FGFR3序列。在本文描述的方法的示例性实施方案中，一种或多种癌症相关体细胞突变是EGFR核酸序列中的一种或多种体细胞突变。在本文描述的方法的再一个示例性的实施方案中，实体瘤癌症是肺癌。在本文描述的方法的再一个示例性的实施方案中，实体瘤癌症是NSCLC，并且核酸序列是EGFR序列。在一些实例中，EGFR核酸序列中的一种或多种体细胞突变选自框内外显子19缺失、L858R、L861Q、G719X、T790M、S678I和框内外显子20插入。
定义
如本文使用的，术语“主体”通常指主体，例如但不限于患有实体瘤癌症例如NSCLC的个人。应当理解患有实体瘤癌症的主体可以是患有已知癌症的患者，意指癌症在执行本发明的方法的实施方案之前检测到。癌症患者可以是复发的癌症患者。例如，患有NSCLC的患者可以是其中在执行本发明的方法的实施方案之前检测到NSCLC的患者。NSCLC患者可以是复发患者。
术语“再发生的”、“再发生”、“复发的”、“复发”和相关术语用于指在治疗后恢复的癌症，以及经历癌症恢复的患者。
术语“实体瘤癌症”在本文中用于指示特征在于在组织和器官中形成癌性肿瘤，或异常增殖细胞的凝聚团块的癌症。应当理解通过实体瘤癌症形成的一些肿瘤可以是囊肿，意指流体填充的组织袋。术语“实体瘤癌症”在本文中用于使形成肿瘤的癌症区别于所谓的血液癌症或血液学恶性肿瘤，其由造血（形成血液的）细胞形成且影响血液、骨髓和淋巴结。实体瘤癌症的实例是癌，或来源于上皮细胞的癌症，肉瘤，或起于结缔组织的癌症，生殖细胞肿瘤例如精原细胞瘤和无性细胞瘤，母细胞瘤或来源于前体细胞或胚胎组织的癌症。实体瘤癌症的一些非限制性实例是肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑癌例如成胶质细胞瘤和膀胱癌。血液学恶性肿瘤的实例是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病。
术语“疗法”在本文中与术语“治疗”同义使用。如本文使用的，术语“癌症疗法”涵盖各种类型的癌症疗法或治疗，包括手术、放射疗法、化学疗法和靶向药物疗法。疗法可以包括一种或多种类型的疗法。例如，疗法可以包括化学疗法和靶向药物疗法的组合。术语“疗法”和“治疗”可以与术语“周期(cycle)”或“时期(period)”结合使用。疗法或治疗可以经过某一时间段施用一次或多次，随后为在其过程中不施用治疗或疗法的时期。疗法周期可以持续数天或数周（在一个实例中，四周）。可以施用一个或多个疗法或治疗周期。例如，可以施用一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个疗法或治疗周期。疗法在不同周期过程中可以是相同的或不同的。例如，疗法类型和/或剂量可以从周期到周期不同。在疗法周期过程中，疗法可以在单天、连续几天或者作为门诊患者或住院患者继续施用。疗法可以持续数分钟、数小时或数天，取决于具体方案。疗法周期可以每周、每两周或每月重复一次。疗法周期可以包括一个或多个疗法期间。例如，疗法周期可以以每月一次间隔进行限定，其中两个每两周一次化学疗法期间分类为一个周期。一个或多个疗法周期可以统称为疗法“过程”。
“靶向疗法”或“靶向药物疗法”指通过干扰癌发生和肿瘤生长所需的特异性分子，而不是像化学疗法一样简单干扰所有快速分裂的细胞，来干扰癌细胞生长的药物疗法。靶向药物疗法的实例是酪氨酸激酶抑制剂（TKI）疗法，其使用可逆的酪氨酸激酶抑制剂，来抑制在某些类型的癌症中促进细胞增殖的酪氨酸激酶的活性。例如，埃罗替尼也称为Tarceva®，或吉非替尼也称为Iressa®，靶向EGFR的酪氨酸激酶活性，并且用作NSCLC的靶向疗法。靶向疗法的另一个实例是间变性淋巴瘤激酶（ALK）抑制剂疗法。
如本文使用的，术语“靶向药物疗法”并不限于上述疗法，而是可以涵盖干扰特异性靶的任何药物疗法，例如干扰EGFR信号传导的疗法。靶向药物疗法包括但不限于可逆的酪氨酸激酶抑制剂疗法，不可逆的酪氨酸激酶抑制剂疗法，抗体疗法，或任何形式的基于小分子、大分子或核酸的疗法，例如基因疗法或小干扰RNA疗法。
术语“肿瘤相关突变”在本文中用于指示核酸序列中的突变，其影响主体中的实体瘤癌症发展。例如，肿瘤相关突变可以活化细胞增殖，因此导致恶性肿瘤的出现或肿瘤生长的扩大。肿瘤相关突变可以对肿瘤赋予促进其扩散遍及主体全身的特性，称为转移。肿瘤相关突变还可以与癌症对癌症疗法的敏感性或抗性相关。术语“肿瘤相关的”可以用于提及包含一种或多种肿瘤相关突变的核酸或核酸序列，例如表达“肿瘤相关的突变核酸序列”中。例如，在提及含有此类突变的核酸或核酸序列中，如在表达“核酸序列中的癌症相关体细胞突变”中，术语“癌症相关突变”可以与术语“肿瘤相关突变”互换使用。应当理解肿瘤相关或癌症相关突变可以在无细胞核酸，以及各种类型的细胞中的核酸中发现，所述各种类型的细胞包括但不限于肿瘤细胞、转移细胞和浸润细胞。肿瘤相关突变或癌症相关突变可以是体细胞突变。
术语“评价（assess）”、“评价（assessment）”、“评价（assessing）”和相关术语在本文中用于提及癌症、癌症状态或患有癌症的主体的状态以及一些其他背景下。这些术语可以指示（但不限于）基于检测到的主体血液中的突变核酸序列的存在或不存在，推断癌性肿瘤中的癌症相关突变的存在或不存在。取决于上下文，术语“评价（assess）”、“评价（assessment）”、“评价（assessing）”和相关术语还可以涵盖推荐或执行任何另外的与评估主体肿瘤中的癌症相关突变的存在或不存在有关的诊断程序，评估主体癌症治疗的潜在有效性，以及推荐或执行此类治疗，监控主体的癌症，或与癌症治疗或诊断相关的任何其他步骤或过程。例如，评估主体中的癌症预后，或评估癌症主体的预后落入术语“评价（assess）”、“评价（assessment）”、“评价（assessing）”和相关术语的范围内。这些术语还涵盖基于主体肿瘤中的癌症相关突变核酸的检测结果，不推荐或不推荐且执行或不执行治疗或诊断程序，以及推荐或不推荐且执行或不执行姑息治疗或临床关怀。
术语“预后（prognosis）”、“预后（prognostication）”、“预后的”、“预测（prediction）”、“预测（predict）”、“预测的”和相关术语在本文中用于提及癌症和癌症患者，以指示估计主体中的癌症发展和癌症治疗后果的过程和结果，包括转移、缓解和复发的概率，以及存活癌症主体的概率。术语“预后（prognosis）”、“预后（prognostication）”、“预后的”、“预测（prediction）”、“预测（predict）”、“预测的”和相关术语包括在术语“评价（assess）”、“评价（assessment）”、“评价（assessing）”和相关术语的范围内。应当理解可以使用癌症预后和后果预测的各种量度，例如存活概率，并且预后和/或预测经常表示为估计量或概率，并且不一定是精确的。
术语“预后因素”或“预测因素”在癌症研究和医学领域中可以互换使用，但还可以指示至少部分不同的含义。在癌症诊断和治疗领域中采用的预后或预测因素一般为影响癌症发展、癌症治疗或癌症患者存活的因素。“预后因素”的一个定义是患者的情形或状况或特征，其可以用于估计从癌症恢复的机率或疾病复发的机率。预后因素还可以定义为与没有疗法或应用标准疗法的后果相关的因素。换言之，因素可以是（但无需是）是否应用疗法的癌症后果的预后。癌症预后因素的一些非限制性实例是疾病的分期、等级、扩散，以及主体的年龄和健康。“预后因素”的一个定义是可以用于预测特定治疗的临床利益，或主体中的癌症是否响应特异性治疗的状况或发现。预测因素还可以描述增加个体发展癌症或癌症复发的危险的某些事物。预测因素可以定义为与对特定疗法的应答或应答缺乏相关的因素，并且暗示对特定疗法的差异应答，取决于生物标记物的状态。在临床试验背景下，预后因素可以通过比较对照组中的后果进行评估，而预测因素可以通过治疗组中的预测后果进行评估。应当理解后果可以使用不同标准进行评估，并且取决于评估中使用的后果标准，待评估因素的预后和/或预测特征可以改变。预后和预测因素的讨论例如在Clark，“Prognostic factors versus predictive factors: Examples from a clinical trial of erlotinib” Molecular Oncology 1:406-412（2008）中提供。
术语“后果（outcome）”或“后果（outcomes）”及相关术语和表达在本文中用于癌症诊断和治疗的背景下，一般用于指示可以测量且与癌症相关的任何特异性结果或效应。后果的实例包括但不限于减少的痛苦、减少的肿瘤大小和疾病的改善。再一个后果实例是“存活”。存活更一般为患者在癌症诊断或治疗后生活或以某一状态（例如缓解）生活的时间长度。在患者组例如在临床试验过程中观察的那些的背景下，癌症患者的“存活率”可以用作存活的量度。存活率可以表示为研究或治疗组中的人百分比，其在他们诊断有疾病例如癌症或起始疾病例如癌症的治疗后仍活了某一时间段。前述“存活率”还可以被称为“总体存活率”（OSR）。存活率通常陈述为五年存活率，其为在其诊断或治疗起始后活了五年的研究或治疗组中的人百分比。存活还可以计算为在其过程中50%患者存活的平均时间段。可以使用除OS外的各种类型的存活量度，实例为无进展存活（PFS）或无疾病存活（DFS）。DFS可以定义为癌症治疗结束后患者存活，而无该癌症的任何体征或症状的时间长度。DFS还可以被称为无复发存活和RFS。RFS可以定义为在癌症治疗过程中和在癌症治疗后患者伴随疾病生活的时间长度，但疾病未变得更糟或未进展。当应用于组时，DFS、PFS和OS以及其他存活量度可以表示为如上文讨论的“率”，并且还可以表示为概率。通常根据其测定患者中的实体瘤癌症的“进展”的标准是实体瘤疗效评估标准（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors）（RECIST），其是限定在治疗过程中癌症患者何时改善（“应答”）、保持原样（“稳定”）或恶化（“进展”）的一组公布的规则。RECIST标准例如在Therasse H.P.等人，“New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors” Journal of the National Cancer Institute，92:206-216（2000）中得到讨论。然而，应当理解经修饰的RECIST标准或其他标准可以用于本文描述的一些实施方案中。
如本文使用的，表达“血液中检测（detect in blood）”、“血液中的检测（detection in blood）”、“血液中的检测（detecting in blood）”和相关表达，指找到或发现血液的液体级分例如血浆或血清样品中的核酸序列的动作或结果。
术语“局部转移”指这样的过程或过程结果，其中源于癌性肿瘤的癌细胞穿透且浸润局部区域中的周围正常组织，通常在相同或相邻的一个或多个器官中，形成新的肿瘤。例如，“局部转移”转移期NSCLC意指存在转移，但在胸腔外器官中未检测到转移。提及NSCLC，术语“局部转移”涵盖转移期“M1a”。
术语“远端转移”指其中癌症扩散至对于原发性肿瘤部位遥远的组织和器官的过程或过程结果。例如，在NSCLC背景下使用的术语“远端转移”意指转移存在，并且在胸腔外器官中检测到。提及NSCLC，术语“远端转移”涵盖转移期“M1b”。
术语“检测（detect）”、“检测（detecting）”、“检测（detection）”和相关术语在本文件中用于泛指发现或测定某些事物的存在或不存在，以及程度、数量或水平或出现概率的过程。该术语必然地涉及物质的物理转化例如核酸扩增。例如，当用于提及EGFR突变时，术语“检测”可以指示EGFR突变的存在、不存在、水平或数量，以及存在或不存在的概率或可能性的发现或测定。应当理解当用于提及肿瘤相关突变时，表达“检测存在或不存在”、“存在或不存在的检测”和相关表达包括定性和定量检测。定量检测包括对其执行检测过程的样品中的突变核酸序列的水平、数量或量测定。
当用于提及核苷酸或氨基酸序列时，术语“突变”或“突变序列”可以与术语“变体”、“等位基因变体”、“变异”或“多态性”互换使用。例如，当讨论本发明的方法时，短语“检测突变”、“检测突变序列”、“检测多态性”或“检测序列变异”可以互换使用。
附图简述
图1是在EGFR的酪氨酸激酶结构域中发现的一些已知EGFR突变的图示，改编自Sharma等人，Nat. Rev. Cancer，7:169（2007）。
图2是举例说明关于在不同水平的基因组DNA的存在下，使用反应混合物MMX1、MMX2和MMX 3，用COBAS® EGFR Mutation Test试剂盒获得的实时PCR交叉点（Cp）值的实验数据的图。X轴代表基因组DNA水平（ng/反应），并且Y轴代表对应于反应中实现的Cp的循环数。
图3是示意性显示关于靶核酸定量的示例性校准曲线的图。
图4是NSCLC治疗时间线和样品收集的图示。
图5是举例说明两个示例性NSCLC患者的血浆样品中的EGFR突变的检测的图。在X轴上的第0周对应于图3中的埃罗替尼治疗起始前的时间点CP0。
图6是基于EGFR活化突变的血液测试，关于存在有NSCLC患者的患者治疗和诊断的决策制定过程的图示。
图7是基于EGFR活化突变的血液测试，关于复发NSCLC患者的治疗和诊断的决策制定过程的图示。
图8是关于NSCLC患者的治疗和诊断的决策制定过程的图示。
图9是与NSCLC患者的治疗后果研究有关的临床研究设计的图示。
图10是在图9中举例说明的临床研究过程期间获得的样品概括的图示。
图11是代表用于定量PCR样品中的靶核酸的校准曲线的图：小图A - 内部对照靶；小图B– Ex19Del靶；小图C– L858R靶；小图D – T7890M靶。
图12是在基线、C3和PD时间点获得的所有数据点的点图，其举例说明关于测试TKI敏感突变的血浆样品中的无细胞（Cf）DNA分布的数据；在样品中检测到的DNA量（拷贝/ml血浆）在Y轴上标绘；在X轴上分开标绘的是组合在一起的全部样品（“全部”）、突变阴性样品（“pMut-”）和突变阳性样品（“pMut+”）。
图13是在基线、C3和PD时间点获得的所有数据点的点图，其举例说明关于测试TKI敏感突变的样品中的cf DNA和突变的EGFR DNA序列分布的数据；在样品中检测到的DNA量（拷贝/ml血浆）在Y轴上标绘；在X轴上分开标绘的是cf DNA（cf-DNA）；Ex19Del缺失以及L858R和T790M置换的数据。
图14是在基线、C3和PD时间点获得的所有数据点的点图，其举例说明关于测试TKI敏感突变的样品中的突变的EGFR DNA分布的数据；在样品中检测到的DNA量（拷贝/ml血浆）在Y轴上标绘；在X轴上分开标绘的是Ex19Del、L858R和T790M检测结果的数据，其中突变阳性样品和突变阴性（由-标记）样品分开分组。
图15是在基线、C3和PD时间点获得的所有数据点的点图，其举例说明关于测试TKI敏感突变的样品中的突变的EGFR DNA分布的数据；在样品中检测到的突变体DNA相对于检测到的总基因组DNA的比（Mut%）在Y轴上标绘；在X轴上分开标绘的是Ex19Del、L858R和T790M检测结果的数据，其中突变阳性样品和突变阴性（由-标记）样品分开分组。
图16是举例说明在下述三个不同时间点获得的样品中，关于Ex19Del和L858R突变检测到的，并且对于各个患者标绘（患者ID编号显示于X轴上）的突变DNA量（拷贝/ml）的数据的图：基线（菱形）、C3（“循环3” - 正方形）和PD（三角形）；数据对于仅用化学疗法（“仅化疗” – 小图A）以及化学疗法和TKI疗法（“化疗+特罗凯” – 小图B）组合治疗的患者分成两个小图；在每种样品中检测到的突变DNA量（拷贝/ml）在Y轴上标绘。
图17是举例说明在下述三个不同时间点获得的样品中，关于Ex19Del突变检测到的，并且对于各个患者标绘（患者ID编号显示于X轴上）的突变DNA量（拷贝/ml）的数据的图：基线（菱形）、C3（“循环3” - 正方形）和PD（三角形）；数据对于仅用化学疗法（“仅化疗” – 小图A）以及化学疗法和TKI疗法（“化疗+特罗凯” – 小图B）组合治疗的患者分成两个小图；在每种样品中检测到的突变DNA量（拷贝/ml）在Y轴上标绘。
图18是举例说明在下述三个不同时间点获得的样品中，关于L858R突变检测到的，并且对于各个患者标绘（患者ID编号显示于X轴上）的突变DNA量（拷贝/ml）的数据的图：基线（菱形）、C3（“循环3” - 正方形）和PD（三角形）；数据对于仅用化学疗法（“仅化疗” – 小图A）以及化学疗法和TKI疗法（“化疗+特罗凯” – 小图B）组合治疗的患者分成两个小图；在每种样品中检测到的突变DNA量（拷贝/ml）在Y轴上标绘。
图19是举例说明关于在临床研究过程中的三个不同时间点（“基线”、 C3和PD – 说明在正文中进一步提供）获得的总无细胞（cf）DNA的数据的点图；检测到的DNA量（拷贝/ml）在Y轴上标绘，并且在X轴上对于不同时间点和临床研究的两臂（arm）中加入的患者分组（仅化学疗法的疗法臂– “仅C”；化学疗法和TKI疗法的组合– “C+T臂”）。
图20是举例说明关于在临床研究过程中的三个不同时间点（“基线”、 C3和PD – 说明在正文中进一步提供）获得的突变DNA的数据的点图；检测到的DNA量（拷贝/ml）在X轴上标绘，并且在Y轴上对于三个时间点和临床研究的两臂中加入的患者分组（仅化学疗法的疗法臂– “仅C”；化学疗法和TKI疗法的组合– “C+T臂”）。
图21是举例说明关于在临床研究过程中的三个不同时间点（“基线”、 C3和PD – 说明在正文中进一步提供）获得的Ex19Del 突变（小图A）和L858R突变（小图B）的突变DNA的数据的点图；检测到的DNA量（拷贝/ml）在Y轴上标绘，并且在X轴上对于临床研究的两臂中加入的患者分组（仅化学疗法的疗法臂– “仅C”；化学疗法和TKI疗法的组合– “C+T”）。
图22显示了举例说明基于基线血浆样品（小图A）和组织样品（小图B），分类为突变阳性的患者的无进展存活（PFS）的比较概率的线图。该图对于临床研究的两臂中加入的患者（仅化学疗法的臂– “GC-安慰剂”；组合化学疗法＋TKI疗法臂– “CG-埃罗替尼”）显示。
图23显示了举例说明基于基线血浆样品（小图A）和组织样品（小图B），分类为突变阴性的患者的无进展存活（PFS）的比较概率的线图。该图对于临床研究的两臂中加入的患者（仅化学疗法的臂– “GC-安慰剂”；组合化学疗法＋TKI疗法臂– “CG-埃罗替尼”）显示。
图24显示了举例说明基于基线血浆样品（小图A）和组织样品（小图B），分类为突变阳性的患者的总体存活（OS）的比较概率的线图。该图对于研究的两臂中加入的患者（仅化学疗法的臂– “GC-安慰剂”；组合化学疗法＋TKI疗法臂– “CG-埃罗替尼”）显示。
图25显示了举例说明基于基线血浆样品（小图A）和组织样品（小图B），分类为突变阴性的患者的总体存活（OS）的比较概率的线图。该图对于临床研究的两臂中加入的患者（仅化学疗法的臂– “GC-安慰剂”；组合化学疗法＋TKI疗法臂– “CG-埃罗替尼”）显示。
图26显示了举例说明基于在C3时间点获得的血浆样品，分类为突变阳性（虚线）和突变阴性（实线）的患者的无进展存活（C3 mut+）和总体存活（C3 mut-）的比较概率的线图。
图27显示了举例说明基于在组合化学疗法+TKI疗法臂中的C3时间点获得的血浆样品，分类为突变阳性（C3 mut+）和突变阴性（C3 mut-）的患者的无进展存活（小图A）和总体存活（小图B）的比较概率的线图。
发明详述
本发明的实施方案的主题在此处以满足法定要求的特异性描述，但该描述不一定预期限制权利要求的范围。请求保护的主题可以以其他方式体现，可以包括不同的要素或步骤，并且可以与其他现有或未来技术结合使用。该描述不应解释为暗示在各个步骤或要素之中或之间的任何特定次序或排列，除非明确描述了各个步骤或要素排列的次序。
肿瘤细胞中的体细胞突变可以影响癌症发展和后果。一种检测此类体细胞突变的方法是就与癌症发生相关的突变体序列的存在，测试通过活组织检查或手术获得的肿瘤样品。然而，肿瘤组织样品可能无法立即用于测试。为了避免癌症相关突变检测中的延迟和适当治疗的选择以及为了降低侵入性，开发用于检测癌症患者的肿瘤中的突变的更方便和更少侵入性的方法是有利的。肿瘤细胞在患有实体瘤癌症的患者的血液中循环。能够在癌症患者的血样中检测体细胞肿瘤突变，包括NSCLC患者中的EGFR突变的检测。然而，由于循环突变序列的少量、血液中循环的非突变序列的本底和基因组DNA（gDNA）的高水平，所述gDNA源于破碎的白血细胞（WBC），难以使此类检测可靠地适应有意义的临床和诊断用途。源于血样中的肿瘤细胞的突变核酸序列的检测，例如NSCLC患者中的EGFR突变的检测，具有不准确的缺点，例如相对高的假阴性检测率，并且可能需要繁琐的分析技术，其可能涉及例如在检测前分离血液循环肿瘤细胞，或在检测前富集样品中的突变DNA序列的含量。尤其是由于高本底DNA水平，定量检测可能甚至更困难。本文描述的是检测癌症患者的血液中的突变肿瘤核酸序列的改良方法，例如检测NSCLC患者的血液中的突变EGFR核酸序列，以使得此类检测方法可用于临床和诊断实践中的癌症评价。
本发明人发现通过对得自患有实体瘤癌症的主体的血样或从血样中分离的基因组DNA执行实时定量PCR，可以快速且准确地执行在患有实体瘤癌症的主体血液中循环的肿瘤相关的突变核酸序列的检测。通过改良处理且分析定量PCR数据的方法，本发明人实现出乎意料的在患有实体瘤癌症的主体血液中循环的肿瘤相关的突变核酸序列的测量的有效性改善。本发明人发现通过测量在主体血液中循环的肿瘤相关的突变核酸序列的类型和量，可以有利地评价主体中的实体瘤癌症状态。本发明人还发现：如果考虑到此类主体中的癌症的转移状态，则基于在主体血液中循环的突变核酸序列的检测，在患有实体瘤癌症的主体中的肿瘤相关突变的检测可以得到显著改善。
此外，本发明人发现患有实体瘤癌症的主体中的肿瘤相关突变的检测结果，例如主体血液中的肿瘤相关的突变核酸序列的检测结果，可以用作用于评价主体中的实体瘤癌症的预后和/或预测因素，包括疗法应答和癌症后果的评价。在一个实例中，本发明人发现检测导致癌症患者中的靶向药物疗法抗性的体细胞突变的存在或出现可用于监控抗癌疗法的有效性，并且评价疾病进展。在另一个实例中，本发明人发现在抗癌疗法期间和/或在抗癌疗法之后，例如在主体已完成一个化学疗法周期之后，一次或多次检测主体血液中的肿瘤相关的突变核酸序列，可以用于评价主体中的实体瘤癌症状态，并且基于检测结果选择适当的癌症治疗。
本发明人在NSCLC患者血液中循环的EGFR突变序列的检测，以及与NSCLC诊断和治疗的有关实验数据的临床应用的示例性背景下应用其发现。为了将关于血液检测到的突变EGFR序列的信息应用于NSCLC患者的治疗和诊断，本发明人辨别关于患者血液中的突变EGFR核酸序列出现的实验数据的各个方面之间的关联，例如患者血样中检测到的突变EGFR核酸序列的存在、不存在、类型或量，以及在NSCLC治疗和诊断领域中使用的预后标准和临床后果测量。关于突变EGFR核酸序列的实验信息随后应用为疾病发展和治疗后果的预后或预测因素，以及用于指导NSCLC患者的治疗、诊断和行为选择。本发明人的发现一般还应用于实体瘤相关的突变，其影响主体中的各种实体瘤癌症的发展。在患有实体瘤癌症的主体血液中循环的肿瘤相关的突变序列的准确和灵敏检测，以及因此生成的实验数据应用于医学和诊断实践，通过改善癌症评价来改善实体瘤癌症患者的医疗护理，在一些情况下，降低诊断程序的侵入性，帮助选择用于每个患者的最有效治疗，并且还通过降低不必要治疗和诊断程序的量。
考虑到主体的转移状态检测血液中的肿瘤相关突变
在一个实例中，本发明人已发现如果考虑到NSCLC主体的转移状态，则基于在主体血液中循环的突变EGFR序列的检测，在NSCLC主体中的EGFR突变的检测可以得到显著改善。特别地，本发明人已发现在NSCLC主体的子集，具有远端转移NSCLC的那些主体中，通过扩增血液中存在的核酸检测到的EGFR突变的存在或不存在准确地预测主体的NSCLC肿瘤中的EGFR突变的存在或不存在。鉴于血液测定对于患有远端转移的主体可靠的发现，阴性结果即在血样中未发现EGFR突变足以确定主体不携带EGFR突变，并且因此不需要侵入性活组织检查来证实阴性结果。相比之下，在不含远端转移NSCLC的NSCLC主体中，虽然血液中的可检测EGFR突变的存在充当主体的NSCLC肿瘤中的EGFR突变存在的准确预测物，但血液中的可检测EGFR突变的不存在不能充当主体的NSCLC肿瘤中的EGFR突变不存在的准确预测物。
上述发现一般可以应用于患有实体瘤癌症的主体血液中的肿瘤相关突变的检测。得自患有远端转移实体瘤癌症的主体的血样中的肿瘤相关突变的不存在的检测足以确定主体不携带该突变，并且因此不需要任何另外的程序例如侵入性活组织检查，来证实阴性结果。相比之下，如果主体患有不含远端转移的实体瘤癌症，则血液中的肿瘤相关突变的存在的检测充当主体的肿瘤中的突变存在的准确预测物，而血液中的可检测突变的不存在的检测不能充当主体的肿瘤中的突变不存在的准确预测物。相应地，本文描述的是检测患有实体瘤癌症的主体血液中的肿瘤相关突变的存在或不存在的方法，以便评价主体的状态。上述方法的一些实施方案是检测患有非小细胞肺癌（NSCLC）的主体血液中的表皮生长因子受体（EGFR）中的突变存在或不存在的方法，以便评价主体的状态。
肿瘤相关突变可以影响癌症治疗的有效性。例如，肿瘤EGFR突变影响某些NSCLC治疗的有效性，所述NSCLC治疗例如靶向EGFR的治疗，例如酪氨酸激酶抑制剂疗法，包括但不限于埃罗替尼和吉非替尼。通过使用本文描述的方法，可以准确地评价主体中的癌性肿瘤的突变状态，并且应用于关于适当疗法（如果存在的话）或另外的诊断程序的选择和施用的决策制定过程。
在本文描述的发现之前，高假阴性误差率限制基于血液的的肿瘤相关突变的检测在临床和诊断背景下的应用，因为它需要基于血样发现为突变阴性的患者的肿瘤组织的另外测试。本文描述的方法的一些实施方案通过基于其转移状态区分实体瘤癌症主体来解决上述问题。特别地，本文描述的方法掺入且应用下述发现：在先前描述的基于血液的诊断程序中观察到的高假阴性率在患有转移性NSCLC远端转移（例如M1b转移状态）的主体中未观察到。M1b转移状态NSCLC主体中的EGFR突变的血液检测因此可以用作NSCLC监控和测定NSCLC的诊断和治疗的进一步指导的可靠诊断程序。
本文描述的方法的实施方案并不限于NSCLC主体的诊断和治疗，但一般可应用于患有各种实体瘤癌症的主体的诊断和治疗。此外，本文描述的方法的实施方案并不限于患有远端转移的实体瘤癌症的主体。根据本文描述的方法的一些实施方案，还可以评价患有远端转移的主体中的实体瘤癌症的状态。评价涉及推断主体的肿瘤组织是否含有使用下述标准在血液中检测到的突变。患有实体瘤癌症但不含远端转移的主体血液中的突变序列的存在指示主体的肿瘤组织含有血液中检测到的突变的高可能性。因此，如果突变体序列在不含远端转移的主体（例如不患有转移或仅患有局部转移的主体中）血液中检测到，基于主体的肿瘤中的突变的存在的高可能性，可以制定进一步的诊断和治疗决策。然而，患有实体瘤癌症但不含远端转移的主体血液中的序列的不存在无法可靠地指示主体的肿瘤组织不含在血液中检测到的突变。如果在此类主体的血液中未检测到突变体序列，则另外的诊断程序保证确定主体的肿瘤中的突变的存在。
例如，当评价患有实体瘤癌症的主体状态的方法的上述实施方案应用于NSCLC主体时，则可以执行下述决策制定过程。患有NSCLC但不含远端转移的主体血液中的突变EGFR序列的存在，指示主体的NSCLC肿瘤组织含有在血液中检测到的EGFR突变的高可能性。因此，如果EGFR突变体序列在不含M1b期的转移NSCLC的主体血液中检测到，则基于主体的肿瘤中的EGFR突变存在的高可能性，可以制定进一步的诊断和治疗决策。然而，不含远端转移的NSCLC主体血液中的序列的不存在无法可靠地指示主体的NSCLC肿瘤组织不含在血液中检测到的EGFR突变。如果在此类主体的血液中未检测到EGFR突变体序列，则另外的诊断程序保证确定主体的NSCLC肿瘤中的突变的存在。
通过检测主体血液中的肿瘤相关的突变序列监控主体中的实体瘤癌症的方法
本文描述的评价患有实体瘤癌症的主体状态的方法包括诊断方法，其使用主体血液中的肿瘤相关突变的检测，来监控主体中的实体瘤癌症的状态和进展。在上述方法的实施方案内包括的是诊断方法，其使用NSCLC主体的血液中的EGFR突变的检测，来监控主体中的NSCLC状态和进展。
根据上述方法的测定可以是对从主体中提取的血液或血浆样品执行的体外测定。测定可以用于监控癌症疗法效应，且制定关于癌症疗法选择的决策。例如，本文描述的方法可以在肿瘤摘除手术之前、在肿瘤摘除手术过程中和/或在肿瘤摘除手术之后用于主体，以监控手术的有效性。该方法还可以在任何癌症疗法之前、在任何癌症疗法过程中和/或在任何癌症疗法之后使用。例如，该方法可以在癌症疗法之前使用，以测定疗法在特定主体中的有效性的可能性，或将主体鉴定为癌症疗法的合适候选者。该方法可以在癌症疗法过程中或在癌症疗法之后使用，以测定疗法的有效性以及监控对癌症疗法的抗性的出现。该方法还可以在癌症缓解期间使用，以监控癌症复发和进展。
在一些实施方案中，该方法采用肿瘤相关突变的定性检测，以测定主体血液中的肿瘤相关突变的存在或不存在或性质。在一些实施方案中，该方法采用肿瘤相关突变的定量测定，以测定主体血液中存在的突变序列的量。定性或定量测定或其组合可以被称为“突变负荷”的测定或检测，并且可以用于评价主体中的实体瘤癌症状态，包括癌症的严重性。在主体血液中的肿瘤相关突变的突变负荷可以通过下述进行表征：主体血液中的肿瘤相关突变数目（即，检测到多少不同的突变）、主体血液中检测到的肿瘤相关突变的量（在主体血液中循环的突变肿瘤相关核酸的数量）、或前述的组合。应当理解，在一些情况下，在患有肿瘤相关癌症的主体血液中检测到的肿瘤相关突变的突变负荷与主体中的癌症严重性和/或进展关联。突变负荷还可以与对主体施用的癌症疗法的有效性或其缺乏关联。
在本文描述的监控实体瘤癌症的方法的一个实施方案中，检测到的突变负荷是在得自实体癌患者的血样中的至少一种活化肿瘤相关突变和至少一种抗性肿瘤相关突变的数量。例如在一种或多种癌症疗法的过程期间，随着时间过去检测突变负荷。因此，可以测定癌症主体的突变负荷中随着时间过去的变化。检测到的至少一种活化肿瘤相关突变的数量或数量变化可以充当癌症进展、严重性和/或对患者施用的一种或多种疗法的成功或其缺乏的指示剂。基于检测到的突变负荷，可以执行关于患者中的实体瘤癌症治疗的决策制定过程。
出乎意料的是，通过应用本文描述的方法，在主体中的临床体征或症状出现之前，或在体征或症状变得可通过其他检测技术和程序检测之前，可以可靠地识别或测定患者中的实体瘤癌症的进展、严重性或分期，以及癌症对某些疗法的敏感性。在一些情况下，在主体中的实体瘤癌症的临床体征或症状出现之前一个或多个（意指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，或由这些整数界定的任何间隔）周或月，可以评价主体中的实体瘤癌症状态。因此可以基于在主体血液中发现的肿瘤相关的突变负荷来制定临床决策。例如，基于主体检测到的突变负荷，可以起始、停止或改变癌症疗法。在另一个实例中，基于主体的肿瘤相关突变负荷，可以调整例如增加或减少癌症疗法剂量。
在一个举例说明性实例中，测定患有NSCLC的主体血液中的EGFR突变的突变负荷，且用于临床决策制定过程中。在一些举例说明性实例中，突变负荷的定量测量用于监控NSCLC患者中的EGFR突变的定量动态变化，并且这些数量变化用于指导临床决策。基于检测到的主体血液中的一种或多种活化EGFR突变的数量变化，疗法例如靶向EGFR疗法可以得到指示且施用于主体。例如，如果检测到的一种或多种EGFR突变的量高于阈值水平，则疗法可以得到指示且施用于主体。在另一个实例中，如果检测到的一种或多种EGFR活化突变的量高于阈值水平，则基于活化EGFR突变负荷来测定靶向EGFR疗法的剂量。例如，基于检测到的EGFR突变的更高突变负荷，则可以推荐使用可逆的酪氨酸激酶抑制剂（“可逆的TKI疗法”）的靶向EGFR疗法的更高剂量。在可逆TKI疗法过程期间监控NSCLC主体的状态。活化EGFR突变负荷的减少，或在一些情况下的活化EGFR突变负荷维持指示可逆TKI疗法的成功，指示它可以继续，或在一些情况下，可以停止。EGFR突变负荷中的增加指示可逆TKI疗法的有效性中的减少。抗性EGFR突变的出现或抗性EGFR突变负荷的增加还指示可逆TKI疗法的有效性中的减少或潜在减少。当检测到TKI疗法的有效性中的减少或潜在减少时，可以制定各种临床检测，例如增加可逆TKI疗法的剂量，施用不同疗法例如化学疗法和/或放射疗法，施用不同的靶向疗法例如不可逆的TKI疗法，或前述的任何组合。临床决策可以包括起始、停止或选择不执行治疗或诊断程序的决策，进入姑息治疗或临床关怀的决策，或停止所有治疗和程序的决策。
在评价实体瘤癌症状态的方法的一些实施方案中，检测且定量患有NSCLC的主体血液中的EGFR突变的突变负荷，并且检测和定量结果用于调查、评价或监控NSCLC患者。在该背景下，检测和定量结果用于制定就NSCLC患者而言的临床决策，包括治疗决策和诊断决策。在一些情况下，EGFR突变负荷检测和定量可以用于代替其他诊断程序，例如CT扫描和放射学评价，以评价、调查或监控患者中的NSCLC。在一些其他情况下，EGFR突变负荷评价可以与其他诊断程序结合使用，以评价、调查或监控患者中的NSCLC。与NSCLC监控中使用的其他诊断技术和程序，例如活组织检查、放射学评价或其他成像技术，例如CT扫描相比较，在NSCLC主体的血液中的EGFR突变核酸序列的检测可以对患者具有更低的危险、更少的侵入性或更低的成本，或这些优点的组合。相应地，NSCLC主体的血液中的EGFR突变核酸的检测可以比至少一些其他诊断技术和程序更频繁执行，与其中不执行NSCLC主体的血液中的EGFR突变核酸的检测的情形相比较，其可以允许癌症进展的较早检测和疗法对主体的较早施用。NSCLC主体的血液中的EGFR突变核酸的检测可以在各个时间点（“检测时间点”）执行，所述各个时间点的实例在本文件的“作为实体瘤癌症评价的预后或预测因素的肿瘤相关突变”部分中讨论。下文讨论的示例性情形举例说明本文描述的方法的一些实施方案。
NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测可以用于监控患者中的NSCLC，代替其他诊断技术例如放射学（X射线）或成像技术例如CT扫描，或者与其他诊断技术例如放射学（X射线）或成像技术例如CT扫描组合。NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测结果可以用于指导诊断决策。例如，如果与较早检测时间点相比较，在治疗循环期间或在治疗循环完成后，在患者中检测到EGFR突变核酸的增加，则可以制定执行另外的诊断程序、改变诊断程序或两者的决策。例如，如果与较早检测时间点相比较，在治疗循环期间或在治疗循环完成后，在患者中检测到EGFR突变核酸的增加，则可以制定更紧密地监控患者的决策。即使不执行或执行放射学或成像评价，也可以制定上述决策，但无法证实疾病进展。其中上述实例可能出现的一种情形是：在TKI抑制剂治疗结束后监控患者中的疾病进展，以检测所谓的“爆发效应（flare effect）”，其意指在TKI抑制剂治疗停止后，肿瘤开始非常快速生长。
在这个及其他实例中，更紧密地监控患者或更紧密的监控可以意指可以对患者实施另外的诊断程序，例如放射学评价（X射线）或其他成像程序（例如CT扫描），如果未检测到EGFR突变核酸中的增加时，则不执行所述另外的诊断程序。更紧密地监控患者还可以意指：与如果未检测到EGFR突变核酸中的增加，将执行的这些诊断程序中的一种或多种的频率相比较，可以对患者实施更频繁的诊断程序例如EGFR突变核酸的检测、放射学评价（X射线）或其他成像评价（例如通过CT扫描）。更紧密的监控可以允许临床医生在其最早时间点捕获疾病进展。
当NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测用于监控患者中的NSCLC时，NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测结果还可以用于指导治疗决策。例如，如果与较早检测时间点相比较，在治疗循环期间或在治疗循环完成后，在患者中检测到EGFR突变核酸的增加，则可以制定继续治疗的决策，例如施用相同疗法的另一个循环，或与先前治疗循环相比较，修改下一个循环中施用的疗法。即使通过其他诊断程序未检测到NSCLC进展，也可以制定上述决策。如果与较早检测时间点相比较，在治疗循环期间或在治疗循环完成后，在患者中检测到EGFR突变核酸的减少，则可以制定下述决策：不施用相同疗法的另一个循环，或与先前治疗循环相比较，修改下一个循环中施用的疗法。例如，如果检测到EGFR突变核酸中的增加，并且在治疗循环中仅施用化学疗法，在所述治疗循环期间或在所述治疗循环之后检测到EGFR突变核酸中的增加，则可以制定施用TKI抑制剂疗法例如埃罗替尼疗法，代替或加上下一个循环中的化学疗法的决策。在另一个实例中，如果检测到EGFR突变核酸中的增加，并且在治疗循环中仅施用TKI疗法，在所述治疗循环期间或在所述治疗循环之后检测到EGFR突变核酸中的增加，则可以制定在下一个循环中施用化学疗法加上TKI疗法的决策。在再一个实例中，如果检测到EGFR突变核酸中的增加，并且在治疗循环中施用TKI疗法和化学疗法的组合，在所述治疗循环期间或在所述治疗循环之后检测到EGFR突变核酸中的增加，则可以制定在下一个循环中增加化学疗法的剂量、TKI疗法的剂量或两种疗法的剂量的决策。如果检测到EGFR突变核酸中的减少，并且在治疗循环中施用TKI疗法和化学疗法的组合，在所述治疗循环期间或在所述治疗循环之后检测到EGFR突变核酸中的减少，则可以制定在下一个循环中减少化学疗法、TKI疗法或两者的剂量的决策。如果与先前检测点相比较，在治疗循环过程中或在治疗循环完成后，检测到EGFR突变核酸中的减少，则可以制定下述的决策：不施用下一个治疗循环、或比其中未检测到EGFR突变核酸中的减少的情形下更晚施用下一个治疗循环。在另外一个实例中，如果与先前检测时间点相比较，在治疗循环过程中或在治疗循环完成后，在患者中检测到EGFR突变核酸中的增加，则可以制定比其中未检测到EGFR突变核酸中的增加的情形下更早起始下一个治疗循环的决策。其中上述实例可能出现的一种情形是：在TKI抑制剂治疗结束后监控患者中的疾病进展，以检测“爆发效应”。如果在TKI疗法治疗循环结束后检测到突变的EGFR突变核酸中的增加，则可以制定立即重新开始TKI疗法的决策。
NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测可以用于评价或调查患者中的NSCLC，代替其他诊断技术例如放射学（X射线）或成像技术例如CT扫描，或者与其他诊断技术例如放射学（X射线）或成像技术例如CT扫描组合。NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测结果可以用于指导诊断决策。例如，如果患者血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于在特定检测时间点的阈值水平，则可以制定执行另外的诊断程序、改变诊断程序或两者的决策。例如，如果在治疗循环结束后，患者血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于阈值水平，则可以制定更紧密地监控患者的决策。其中上述实例可能出现的一种情形是：在TKI抑制剂治疗结束后监控患者中的疾病进展，以检测“爆发效应”。
当NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测用于调查或评价患者中的NSCLC时，NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的检测结果还可以用于指导治疗决策。例如，如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于在特定检测时间点，例如在治疗循环期间或在治疗循环完成后的阈值水平，则可以制定继续治疗的决策，例如施用相同疗法的另一个循环，或与先前治疗循环相比较，修改下一个循环中施用的疗法。即使通过其他诊断程序未检测到NSCLC进展，也可以制定上述决策。如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为低于在特定检测时间点，例如在治疗循环期间或在治疗循环完成后的阈值水平，则可以制定下述决策：不施用另一个治疗循环，或与先前治疗循环相比较，修改下一个循环中施用的一种或多种疗法。例如，如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于在治疗循环期间或在治疗循环之后的检测时间点的阈值水平，并且在治疗循环中仅施用化学疗法，则可以制定施用TKI抑制剂疗法例如埃罗替尼疗法，代替或加上下一个循环中的化学疗法的决策。在另一个实例中，如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于在治疗循环期间或在治疗循环之后的检测时间点的阈值水平，并且在治疗循环中仅施用TKI疗法，则可以制定在下一个循环中施用化学疗法加上TKI疗法的决策。在再一个实例中，如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于在治疗循环期间或在治疗循环之后的检测时间点的阈值水平，并且在治疗循环中施用TKI疗法和化学疗法的组合，则可以制定在下一个循环中增加化学疗法、TKI疗法或两者的剂量的决策。如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为低于在治疗循环期间或在治疗循环之后的检测时间点的阈值水平，并且在治疗循环中施用TKI疗法和化学疗法的组合，则可以制定在下一个循环中减少化学疗法、TKI疗法或两者的剂量的决策。在另外一个实例中，如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于在治疗循环期间或在治疗循环之后的检测时间点的阈值水平，则可以制定比其中未检测到高于阈值水平的EGFR突变核酸的情形下更早起始下一个治疗循环的决策。其中上述实例可能出现的一种情形是：在TKI抑制剂治疗结束后监控患者中的疾病进展，以检测“爆发效应”。 如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为高于在TKI治疗循环之后的检测时间点的阈值水平，则可以制定立即重新开始TKI疗法的决策。如果NSCLC患者的血液中的EGFR突变核酸的水平测定为低于在治疗循环期间或在治疗循环之后的检测时间点的阈值水平，则可以制定下述决策：不施用下一个治疗循环，或比其中未检测到EGFR突变核酸中的低于阈值水平的情形下更晚施用下一个治疗循环。
作为实体瘤癌症评价的预后或预测因素的肿瘤相关突变
根据本文描述的方法的一些实施方案，患有实体瘤癌症的主体中的一种或多种肿瘤相关突变的检测结果，用作主体中的实体瘤癌症后果的预后和/或预测因素。本发明人发现肿瘤相关的突变核酸序列的检测结果与主体的实体瘤癌症后果，包括癌症疗法应答关联。通过将得自癌症主体的血浆样品中的肿瘤相关的突变核酸序列的检测掺入与实体瘤癌症的诊断和治疗相关的方法内，本发明人对实体瘤癌症的治疗和诊断应用其发现。本文描述的方法的一些实施方案通过就肿瘤相关的突变核酸序列测试患者的血浆样品，掺入患者血液中的肿瘤相关突变的检测和/或定量。根据上述方法的检测可以是对从主体中提取的血液或血浆样品执行的体外检测。患有实体瘤癌症的主体血液中检测到的突变负荷可以用作就癌症发展和后果而言的预后因素和/或预测因素。根据采用本发明发现的有用应用的治疗和诊断方法，检测结果可以用于检测后的步骤中，以预测实体癌发展、患者后果、癌症疗法的效应，以及用于选择治疗和诊断程序，且指导实体瘤癌症患者的行为选择。
在特定实例中，通过将NSCLC患者的血液中的突变EGFR序列的检测和/或定量掺入与NSCLC诊断和治疗相关的方法内，本发明人的发现可以应用于NSCLC的治疗和诊断，因此使用EGFR突变作为NSCLC癌症评价的预后或预测因素。EGFR序列的检测可以通过经由合适的分析技术就突变的EGFR序列测试样品来执行。一种此类实例的技术是定量PCR，例如实时定量PCR，其可以适当地用于本文描述的各种治疗和诊断方法中，并且可以掺入本文件的“肿瘤相关突变的改善检测”部分中所述的一种或多种改良技术。
根据本发明的方法的实施方案，其通常将本发明人的发现应用于与实体瘤癌症的治疗和诊断例如NSCLC的治疗和诊断相关的方法，血浆样品中检测到的突变序列的存在、不存在、量或类型可以分开或组合充当就实体瘤癌症后果和对疗法的应答而言的预后和/或预测因素，所述疗法包括化学疗法和靶向药物疗法（例如TKI疗法）。根据本发明的实施方案的方法可以采用肿瘤相关突变的定量和/或定性检测，以测定主体血液中的肿瘤相关突变的存在或不存在或性质。定性或定量测定或其组合可以被称为“突变负荷”的测定或检测，其为在本文件中的其他地方以说明实例描述的术语和概念。本文件中其他地方描述的“突变负荷”测定的原则和实例还可以应用于该部分中所述的方法。例如，在NSCLC患者中例如在得自NSCLC主体的血浆样品中，检测到的EGFR序列的突变负荷，可以充当就NSCLC癌症后果和对疗法的应答而言的预后和/或预测因素，所述疗法包括化学疗法和靶向药物疗法。
突变负荷可以在一个或多个时间点，例如在一种或多种癌症疗法过程之前、在一种或多种癌症疗法过程过程中、或在一种或多种癌症疗法过程之后的一个或多个点进行检测。例如，突变负荷可以在癌症诊断起始时或接近于癌症诊断起始，但在任何治疗或疗法起始前进行检测。突变负荷可以在治疗循环过程中、在治疗循环结束后、或在治疗循环之间进行检测。突变负荷可以在缓解过程中的一个或多个点，或在复发过程中的一个或多个点进行检测。应当理解，在一些情况下，在仅一个点例如在治疗循环过程中检测到的突变负荷，可以充当实体瘤癌症后果的预后和/或预测因素。在其他情况下，在组合评估的两个或更多个时间点检测到的突变负荷，可以充当就实体瘤癌症后果而言的预后和/或预测因素。在一个或多个时间点的检测可以用于监控癌症进展或特定治疗的成功，并且制定适当的临床决策，如本文件的部分“通过检测主体血液中的肿瘤相关突变序列监控主体中的实体瘤的癌症的方法”中讨论的。
在其下进行检测的时间点可以基于在该点获得的结果的预测和/或预后价值加以选择，或在一些情况下，它可以为了方便起见而选择，例如以与另一个或多个诊断或治疗程序一致。例如，组织样品中的突变检测可能必须在活组织检查的时间点进行，因为这是肿瘤组织样品通过使用本发明的程序提取的时间。血液或血浆中的突变负荷的检测可以在不同时间点进行，并且可以频繁进行，因为对于患者存在很少的危险。在其下获得用于检测的样品以便执行根据本文描述的方法的实施方案的检测步骤的时间点的一个实例（“检测时间点”）是在其下对主体进行初始诊断程序的时间点。该时间点可以与在其下执行初始活组织检查、放射学评价或其他诊断程序例如CT扫描的时间点一致。在该时间点检测到的突变的EGFR突变核酸的水平可以充当癌症进展（或进展缺乏）针对其衡量的“基线”水平。检测时间点的再一个实例是在起始癌症治疗前的时间点。检测时间点的其他实例是在治疗循环过程中的时间点、在治疗循环结束后的时间点和在治疗过程结束后的时间点。
例如，当实体瘤癌症患者施用几个治疗循环时，检测时间点可以在第一治疗循环过程中，在第一治疗循环结束后但在第二治疗循环起始前（如果施用第二治疗循环），在第二治疗循环过程中，在第二治疗循环结束后但在第三治疗循环起始前（如果施用第三治疗循环），在第三治疗循环过程中，在第三治疗循环结束后但在第四治疗循环起始前（如果施用第四治疗循环），并且就下面的治疗循环例如第四、第五、第六或后续循环而言依此类推。应当理解可以执行一个或多个上述时间点的检测。还应当理解在根据本发明的实施方案的方法中可以采用其他时间点。
在本文描述的监控实体瘤癌症的方法的一些实施方案中，待检测的突变负荷是得自实体瘤患者的血样中的至少一种活化肿瘤相关突变的存在、不存在或数量。检测到的突变负荷，例如至少一种活化肿瘤相关突变的存在、不存在或数量，充当就一种或多种实体瘤癌症后果而言的预后和/或预测因素。后果的非限制性实例是肿瘤大小、肿瘤转移、疗法成功，其可以导致患者进入缓解，患者存活（包括但不限于总体存活、无疾病存活和无进展存活），其可以作为指定时间段的存活概率进行测量，癌症复发，肿瘤“爆发”或患者死亡。基于待检测的突变负荷，执行关于就实体瘤癌症患者而言的进一步动作的一种或多种决策。关于此类进一步动作的决策的实例是选择替代靶向疗法，起始、停止或选择不执行治疗或诊断程序的决策，进入姑息治疗或临床关怀的决策，或停止所有治疗和程序的决策。
例如，本文描述的方法在肿瘤摘除手术之前、在肿瘤摘除手术过程中和/或在肿瘤摘除手术之后，使用主体的突变负荷检测作为手术有效性的预后和/或预测因素。该方法还可以在任何癌症疗法之前、在任何癌症疗法过程中和/或在任何癌症疗法之后，用作疗法有效性的预后和/或预测因素。例如，在特定主体中执行疗法例如化学疗法、TKI疗法或其组合后，该方法可以用于测定存活包括OSS和PS的概率。例如通过基于突变负荷的检测结果，测定癌症后果是否被治疗或疗法有利地影响，该方法还可以用于将主体鉴定为癌症疗法的合适候选者。该方法可以用于测定疗法的未来过程，其可以涉及例如施用另外的疗法周期或修改疗法方案。基于检测到的突变负荷的后果概率可以在特定患者中测定超过一次，并且可以用于监控实体瘤癌症进展和治疗有效性。该方法还可以在癌症疗法过程中或在癌症疗法之后使用，以测定治疗后护理的合适选择和时间线。例如，如果测定可能的存活长度，则基于测定可以推荐患者作出关于姑息治疗或临终关怀的安排。
出乎意料的是，通过使用根据本文描述的方法的肿瘤相关突变的定量检测，可以测定患者中的实体瘤癌症的后果概率。因此可以基于定量一种或多种肿瘤相关的突变核酸序列的量来制定临床决策。在一些情况下，本文描述的方法可以有利地降低或最小化对实体瘤癌症患者执行的复杂、昂贵或侵入性诊断和治疗程序数目，同时提供诊断数据用于提供信息的临床决策制定过程。本文描述的方法可以降低癌症治疗和诊断的成本，减少患者不适和负担，并且导致更提供信息的临床决策制定过程。在一些其他情况下，本文描述的方法可以比其他方法更早地检测癌症进展，因此允许临床医生制定关于待用于特定癌症患者的治疗和诊断程序的更早决策，潜在改善癌症后果。
在举例说明性实例中，患有NSCLC的主体中的EGFR活化突变的突变负荷在一个治疗循环之前或在一个治疗循环过程中进行测定，所述治疗循环可以包括化学疗法、TKI疗法或这些疗法的组合。在治疗循环过程中，例如在六个循环中的第三循环过程中，检测到的活化EGFR突变的突变负荷，用作就TKI疗法成功而言的预测事实，并且在一些情况下，充当就是否使用TKI疗法的患者存活而言的预后因素。在另一个实例中，患有NSCLC的患者中的EGFR活化突变的突变负荷在基线时、或在任何治疗起始前进行测定，所述治疗可以包括化学疗法、TKI疗法或这些疗法的组合。在基线时检测到的活化EGFR突变的突变负荷用作EGFR突变阳性患者就TKI治疗成功而言的预测因素，所述TKI治疗成功通过PFS、OS或两者进行测量。基于可获得的证据，例如临床试验的结果，关于检测到的突变负荷的实验数据得到解释，且用作患者中的NSCLC后果的预后和/或预测因素。例如，关于在特定时间点检测到的突变负荷的实验数据可以用作特定患者的可能后果的预后因素或预测对疗法的应答。在一个实例中，在疗法周期过程中检测到的EGFR活化突变的突变负荷充当特定患者的OS的预后因素，其对于具有检测到的EGFR活化突变的突变负荷的患者评估为更久，无论化学疗法是单独使用还是与TKI疗法结合用于患者的治疗。在另一个实例中，在组合化学疗法和TKI疗法的疗法周期过程中，在患者中检测到的EGFR活化突变的突变负荷充当NSCLC患者中的TKI疗法成功的预测因素，所述TKI疗法成功表示为增加的PFS和OS。在特定患者中评估可能后果时，根据本文件的部分“通过检测主体血液中的肿瘤相关的突变序列监控主体中的实体瘤癌症的方法”中讨论的示例性指导，可以制定临床决策。
肿瘤相关突变的改善检测
在本文描述的方法的实施方案中，通过合适方法例如定量扩增或核酸测序来检测核酸序列。定量扩增的方法公开于例如美国专利号5,210,015；5,804,375；6,127,155；6,180,349；6,033,854；和5,972,602，以及例如Holland等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280（1991），Gibson等人，Genome Research 6:995-1001（1996）；DeGraves等人，Biotechniques 34（1）:106-10，112-5（2003）；Deiman B等人，Mol Biotechnol. 20（2）:163-79（2002）中。扩增可以进行“实时”监控。尽管可以使用标准的桑格双脱氧法或其他更古老的核苷酸测序方法，但当使用高流通量测序，例如“下一代测序”方法，例如HiSeq™、MiSeq™或Genome Analyzer（各自可得自Illumina）、SOLiD™或Ion Torrent™（各自可得自Life Technologies）和454™测序（来自Roche Diagnostics）时，测序可以是特别有效的。例如，在高流通量测序中，使用多重模板和多重引物的平行测序反应允许基因组或基因组的大部分的快速测序。参见例如WO 03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007、WO 2005/003375、WO 00/06770、WO 00/27521、WO 00/58507、WO 01/23610、WO 01/57248、WO 01/57249、WO 02/061127、WO 03/016565、WO 03/048387、WO 2004/018497、WO 2004/018493、WO 2004/050915、WO 2004/076692、WO 2005/021786、WO 2005/047301、WO 2005/065814、WO 2005/068656、WO 2005/068089、WO 2005/078130和Seo等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2004）101: 5488-5493。在一些实施方案中，扩增子通过选自下述的方法之一进行测序：碱基掺入法例如焦磷酸测序法（美国专利号6,274,320、6,258,568和6,210,891）；氢离子检测法（ISFET）（例如美国专利号8,262,900）、或染料终止子检测法（美国专利号7,835,871、8,244,479、8,315,817和8,412,467）。还可以采用深度测序技术和仪器（即能够数字序列读出的技术和仪器）。非限制性地，仪器的实例包括GS仪器家族（454 Life Sciences，Branford，Conn.）；ION PROTON®和PGM™（Life Technologies，Grand Island，N.Y.）；HISEQ®和MISEQ®（Illumina，San Diego，Cal.）或者其任何改良和修饰。
在本文描述的方法的一些实施方案中，采用定量PCR。定量PCR一般指允许定量在PCR反应起始时使用的靶核酸序列的量的方法。定量PCR技术使用各种方法进行定量。定量PCR方法的一个实例是“实时PCR”，其还可以被称为“实时定量PCR”。尽管一些来源同义使用术语“实时PCR”和“定量PCR”，但这并非本文件的情况。此处，术语“定量PCR”涵盖所有基于PCR的技术，其允许定量初始存在的靶核酸序列。术语“实时PCR”用于指示定量PCR技术子集，其允许在PCR反应自始至终或实时检测PCR产物。实时PCR的原理一般在Holland等人（1991）和Held等人“Real Time Quantitative PCR” Genome Research 6:986-994（1996）中得到描述。一般地，实时PCR测量在每个扩增循环时的信号。常规实时PCR技术依赖在每一个扩增循环完成时发出信号的荧光团。此类荧光团的实例是在与双链DNA结合后，在限定波长下发出荧光的荧光染料，例如SYBR绿。由于PCR产物的累积，在每个扩增循环过程中的双链DNA中的增加因此导致荧光强度中的增加。在实时PCR中使用的另一个荧光团实例是序列特异性荧光报道探针。此类探针的实例是TaqMan®探针和FRET探针。TaqMan®探针含有荧光团和荧光猝灭剂，所述荧光猝灭剂降低由荧光团发出的荧光。在PCR的延伸阶段过程中，探针通过DNA聚合酶的核酸外切酶活性切割，释放荧光团。荧光团释放导致荧光信号中的增加，其与PCR产物的量成比例。FRET探针采用荧光共振能量转移（FRET）。两种标记的序列特异性探针设计为在PCR退火期过程中与PCR产物结合，其导致从供体荧光团到受体荧光团的能量转移。这导致在退火阶段过程中的荧光增加，其与PCR产物的量成比例。
序列特异性报道探针的使用提供了以高特异性的靶序列检测，并且允许即使在非特异性DNA扩增的存在下的定量。基于不同着色的标记的特异性探针，荧光探针还可以用于多路测定中 - 用于在相同反应中检测几种基因。例如，多路测定可以使用在相同PCR反应混合物中由各种荧光团标记的几种序列特异性探针，所述各种荧光团包括但不限于FAM、JA270、CY5.5和HEX。
根据本发明的方法可以适当地用于检测突变EGFR序列的一个多路测定实例是等位基因特异性PCR，此类测定可以用COBAS® EGFR Mutation Test试剂盒（Roche Molecular Diagnostics，Indianapolis，Ind.）执行，其采用等位基因特异性EGFR引物，以在序列的野生型变体的存在下，检测核酸序列中的突变。等位基因特异性PCR是其中选择性扩增且检测PCR反应混合物中存在的核酸序列变体的技术。等位基因特异性PCR采用至少一种“等位基因特异性引物”。术语“等位基因特异性”引物一般指仅在核酸序列的特异性变体存在于反应混合物时，其延伸才在PCR反应中发生的引物。换言之，等位基因特异性引物以这样的方式进行设计，使得它们区分核酸变体，并且选择性扩增包括待检测变体的核酸模板。
本文描述的方法的一些实施方案采用得自患有实体瘤癌症的主体的血样中的肿瘤相关突变的改良检测方法。在一个实例中，检测患有NSCLC的主体血液中的一种或多种EGFR突变的步骤包括检测得自主体的样品中的一种或多种突变的NSCLC核酸序列。检测可以包括使样品或从样品中分离的核酸例如总基因组DNA与一种或多种等位基因特异性引物和PCR的其他组分例如酶和核苷酸接触，在允许选择性扩增突变的核酸序列的条件下，使所得到的反应混合物温育，并且检测扩增产物的存在。在本文描述的方法的实施方案中，等位基因特异性PCR可以与实时定量PCR组合，以改善突变的肿瘤相关核酸序列的检测。
在执行突变体序列的PCR扩增之前，检测血样中的肿瘤相关突变的常规方法通常采用另外的步骤，用于增加样品中的突变序列含量。例如，在一种常规方法中，在PCR扩增前执行从主体的血样中分离肿瘤细胞，以改善肿瘤相关突变的检测灵敏度。在另一种常规方法中，在PCR扩增前对与突变的肿瘤相关序列对应的非突变DNA序列实施核酸酶消化，以便最小化非突变序列的本底。本文公开的是改良的检测方法，其采用定量PCR，并且可以检测得自患有实体瘤癌症的主体的血样中的肿瘤相关突变，并且有利地，不需要在执行实时定量PCR之前用于分离肿瘤细胞、肿瘤DNA，或增加样品中的突变序列含量的另外步骤。
如上文讨论的，实时PCR依赖在PCR反应过程期间的可测量参数例如荧光的检测。可测量参数的量与PCR产物的量成比例，其允许“实时”观察PCR产物的增加。一些实时PCR方法允许基于可观察的PCR反应进展来定量输入DNA模板。所涉及的数据的分析和处理在下文进行讨论。在核酸扩增测定背景下的“生长曲线”或“扩增曲线”是函数曲线图，其中自变量是扩增循环数，并且应变量是在每个扩增循环时测量的扩增依赖性可测量参数，例如由荧光团发出的荧光。通常，扩增依赖性可测量参数是在杂交后，或在探针被核酸聚合酶的核酸酶活性水解后，由探针发出的荧光量，参见Holland等人，（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280和美国专利号5,210,015。在典型的聚合酶链反应中，当使用线性标度时，生长曲线包含指数生长区段，随后为平台，导致S形扩增曲线。生长曲线的特征在于“交叉点”值或“Cp”值，其还可以被称为“阈值”（或Ct值），其为其中实现可测量参数的预定量级的循环数。更低的Cp值代表更快速的扩增完成，而更高的Cp值代表更缓慢的扩增完成。当扩增效率相似时，更低的Cp值反映更高的靶核酸起始量，而更高的Cp值反映更低的靶核酸起始量。当已知浓度的对照核酸用于生成“标准曲线”，或在各个已知浓度的对照核酸下的一组“对照”Cp值时，通过比较靶和对照核酸的Cp值，变得能够测定样品中的靶核酸的绝对量。
通过实时定量PCR的检测准确度因此取决于许多参数的正确选择。需要正确测定的一种参数是其中Cp值与核酸起始量具有线性关联的范围，以对数拷贝数表示。该范围可以被称为实时PCR测定的“有效范围”或“测定线性范围”。
本发明人已发现含有一般不知道含有肿瘤相关突变的基因组DNA的血样仍可以在一些基因组DNA浓度下生成扩增信号。在一些实施方案中，该本底信号水平因此是信号必须下降至低于其才有效，即视为与本底不同的截断值。如上所述，本底扩增水平随着基因组DNA浓度而改变。相应地，在一些实施方案中，肿瘤相关突变的存在或不存在的测定包括比较阈值与对照值，其中所述对照值是依赖性的，并且基于样品中的基因组DNA浓度而改变。因此，如果样品的循环阈值低于对照值，则样品视为含有肿瘤相关突变，并且如果样品的循环阈值等于或高于对照值，则结果不指示肿瘤相关突变的存在，并且可以被称为“阴性结果”）。在一些实施方案中，例如NSCLC pM1b转移期患者关于EGFR突变的测试，此类阴性结果以高可能性指示患者肿瘤中的EGFR突变的不存在。在一些其他实施方案中，例如除pM1b外的转移期（例如M0或pM1a）的NSCLC患者的就EGFR突变测试，此类阴性结果可能不指示患者肿瘤中的EGFR突变的不存在，并且应考虑患者的肿瘤组织的重新测试。
在一些实施方案中，对照值是在其下出现在不存在靶DNA的情况下的非特异性扩增的最高Cp值或范围，并且可以被称为“突破”值。在一些实施方案中，对照值事实上是来自样品的阳性值必须落入其内以便加以考虑的值范围。换言之，该范围代表在本底信号的通常范围外的可能信号水平。在一些实施方案中，对照范围在上述突破值和阳性对照的循环阈值之间。在一些实施方案中，对照值基于内部对照的扩增，例如并非频繁突变的突变基因座的另一个区域。
本文描述的改良的实时定量PCR方法通过下述建立有效的循环阈值（Ct）范围：在实时PCR反应混合物中的各个基因组DNA水平下，生成用于对照DNA的标准曲线，并且基于在其中观察到测定线性的范围，选择有效的循环阈值范围。根据本文描述的改良方法的一些其他实施方案，测定关于定量实时PCR反应的对照或截断值，低于其在不存在靶DNA的情况下的非特异性扩增不太可能干扰反应混合物中存在的靶DNA的定量检测。在一些其他实施方案中，本文描述的改良方法采用用于定量反应混合物中存在的靶DNA的校准曲线，其考虑到样品中存在的各种基因组DNA量。上文讨论的实时PCR测定的各种改良组合可以掺入检测血样、或基因组DNA中的另一个靶基因座中的肿瘤相关突变的改良方法内，因此导致出乎意料的此类检测的准确度增加。
计算和比较
本文描述的方法（例如样品信号与对照值或范围）的计算和比较可以涉及基于计算机的计算和工具。工具可以有利地以计算机程序的形式提供，所述计算机程序可通过常规设计的通用计算机系统（在本文中被称为“主机”）执行。主机可以配置有许多不同硬件部件，并且可以以许多尺度和样式（例如台式PC、笔记本电脑、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机）制备。可以包括标准部件例如显示器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机附着至网络时，联接可以经由任何合适的传输媒体（例如，有线、光学和/或无线媒体），以及任何合适的通信协议（例如TCP/IP）提供；主机可以包括合适的联网硬件（例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡）。主机可以实现各种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS或任何其他操作系统。
用于实现本发明的方面的计算机代码可以以各种语言书写，包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他脚本或编程语言，其可以在主机上执行或可以汇编以在主机上执行。代码还可以以低级语言例如汇编语言或机器语言进行书写或分布。
主机系统有利地提供了用户经由其控制工具操作的界面。在本文描述的实例中，软件工具作为脚本（例如使用PERL）实现，其执行可以通过用户从操作系统例如Linux或UNIX的标准命令行界面启动。本领域技术人员应当理解命令可以适当地适应操作系统。在其他实施方案中，可以提供图形用户界面，允许用户使用指点装置来控制操作。因此，本发明并不限于任何具体的用户界面。
掺入本发明的各种特点的脚本或程序可以在各种计算机可读媒体上编码用于储存和/或传递。合适媒体的实例包括磁盘或磁带、光存储媒体例如光盘（CD）或DVD（数字通用盘）、闪速存储器，和适合经由与各种协议一致的有线、光学和/或无线网络包括因特网传递的进位信号。
可应用于本发明的实施方案的一般考虑
患有实体瘤癌症例如NSCLC的主体可以患有实体瘤癌症，其在执行根据本发明的实施方案的方法之前未被诊断。例如，在意欲诊断实体瘤癌症的其他诊断程序之前或完成过程中，主体可以就血液中的肿瘤相关突变例如EGFR突变体序列的存在进行测试。此类诊断程序的实例是各种成像技术或在活组织检查过程中获得的样品的组织学分析。类似考虑应用于患有实体瘤癌症的主体的转移状态和癌症分期。在根据本发明的实施方案的方法之前，与根据本发明的实施方案的方法同时，或在根据本发明的实施方案的方法之后，可以测定NSCLC的转移状态例如M1a或M1b状态和癌症分期，其不受对主体执行的各种诊断步骤和操作的次序限制。
本文描述的方法可以采用合适的诊断程序，加上主体血液中的突变肿瘤相关序列的检测，以便准确地评价主体中的实体瘤癌症的状态。适当地选择另外的诊断程序，以改善主体中的实体瘤癌症的评价准确度，并且可以包括但不限于各种成像技术、活组织检查、组织学分析、序列分析及其他程序。
本文描述的方法并不限于纯诊断程序，而是还可以掺入各种治疗步骤，因此采用本文描述的诊断发现对治疗实体瘤癌症的改良方法的应用和使用，所述实体瘤癌症的一个实例是NSCLC。在一个实施方案中，基于患有实体瘤癌症的主体血液中的肿瘤相关突变的存在或不存在，例如NSCLC主体血液中检测到的肿瘤相关EGFR突变的存在或不存在，适当地选择且施用或执行适当的癌症治疗和诊断程序。本文描述的癌症治疗可以包括手术或非侵入性治疗，例如药物或放射疗法。
肿瘤相关突变
根据本文描述的方法检测的肿瘤相关突变是在患有实体瘤癌症的主体的肿瘤中发现的突变，并且影响主体中的实体瘤癌症发展。例如，肿瘤相关突变可以影响癌症的出现、进展或复发，以及癌症对癌症疗法的应答性或敏感性。可以根据本文描述的方法检测的肿瘤相关突变的一个实例是原癌基因中的突变，这将其转换成癌基因。另一个实例是肿瘤抑制基因中的突变，其导致其功能的丧失或减少。可以根据本发明的方法进行检测的突变并不限于蛋白质编码基因中的突变，而是还可以包括非编码核酸序列，例如调节元件、编码非编码RNA的序列以及其他非编码序列中的突变。蛋白质编码核酸序列的肿瘤相关突变可以是框内缺失或插入以及置换。例如，待检测的突变的EGFR序列通常是含有一种或多种框内核苷酸缺失或插入的核酸序列，以及导致EGFR的突变氨基酸序列的核苷酸置换。肿瘤相关突变可以导致蛋白质融合物。可以在患者的血液中得到检测且用于监控癌症出现、进展、复发，以及监控癌症疗法的肿瘤相关突变的一些实例，包括但不限于下述突变：EGFR突变，KRAS突变包括KRAS密码子12、13、61和146中的突变，ALK突变包括ALK融合物，ROS1包括ROS1融合物，c-MET突变，PIK3CA（PI3K-CA）突变，NRF2突变，FGFR1-3突变，AKT1突变包括AKT1融合物，BRAF突变包括V600E置换，NRAS突变，TMPRSS2:ERG融合物，SPOP突变，RET融合物，PPAR-γ融合物，IDH-1突变和IDH-2突变。应当理解一些上述突变与一些而不必是全部实体瘤癌症相关。相应地，一些上述肿瘤相关突变的检测可以更合适于某些癌症的评价。例如，下述突变的检测可以适合肺癌评价：EGFR突变、KRAS突变、ALK融合物、ROS1融合物、c-MET突变、PIK3CA（PI3K-CA）突变、NRF2突变和FGFR1-3突变。在另一个实例中，AKT1突变包括融合物的检测可以适合于乳腺癌评价。在再一个实例中，KRAS突变例如密码子12、13、61和146的突变，BRAF置换V600E，NRAS突变，PIK3CA（PI3K-CA），EGFR细胞外结构域热点突变的检测可以用于结肠直肠癌评价。TMPRSS2:ERG融合物和SPOP突变的检测可以用于前列腺癌评价。BRAF突变、NRAS突变、RET融合物和PPAR γ融合物的检测可以用于甲状腺癌评价。IDH-1和IDH-2中的突变的检测可以用于成胶质细胞瘤评价，而FGFR3中的突变的检测可以用于膀胱癌检测。应当理解肿瘤相关突变和癌症类型的相关的上述列表并非详尽的或限制性的。
非小细胞肺癌
肺癌是在肺组织中形成的实体瘤癌症。大多数肺癌在内衬气道的上皮细胞中开始。这类癌症被称为“非小细胞肺癌”（NSCLC）。另一种较不普遍类型的肺癌被称为“小细胞肺癌”，其在非上皮肺细胞例如神经细胞或激素生产细胞中开始。肺癌分类成NSCLC和小细胞对于确定适当治疗是重要的。肺癌也依据分期进行描述，所述分期描述患者体内的癌症程度。在目前临床实践中，肺癌通常根据由国际抗癌联盟（International Union Against Cancer）（UICC）开发且维持的恶性肿瘤分类法（Classification of Malignant Tumors）（TNM）进行分期。TNM分类法考虑到肿瘤大小以及它是否已侵入附近组织、区域淋巴结的牵涉和远端转移、或癌症从一个机体部分扩散到另一个。根据目前的TNM，肺癌分类分成五期。0期也称为原位肺癌，意指癌症不侵入肺外的组织。I期肺癌是小肿瘤，其未扩散到任何淋巴结且可以完全被手术摘除。基于肿瘤的大小，将I期分成两个亚期，A和B。小肿瘤例如小于3 cm 的那些分类为IA期。3至5 cm之间的I期肿瘤通常分类为IB期肺癌。II期通常指更大的肿瘤，其中亚期IIA描述已扩散至淋巴结的更大肿瘤（宽超过5 cm，但小于7 cm），或者可能已侵入或未侵入肺中的附近结构但未扩散至淋巴结的更大肿瘤（宽超过7 cm）。
当肺癌转移时，在脱离肺肿瘤后，它通过血液或淋巴管扩散。III期描述难以摘除的癌症肿瘤，因为它们扩散到肺外的组织。III期癌症分类为IIIA或IIIB期。对于许多IIIA期癌症和几乎所有IIIB期癌症，肿瘤难以摘除且有时不可能摘除。例如，IIIB期肺癌可以扩散到位于胸部中心的淋巴结，或侵入肺中的附近结构。IV期通常描述通过转移过程已扩散到另一个肺中的超过一个区域、围绕肺或心脏的流体或机体的远侧部分的肺癌。术语“IVA期”可以用于描述在胸部内扩散的肺癌，而当它扩散到胸部外时，可以使用术语“IVB期”。一般而言，手术对于大多数III或IV期肺癌是不成功的。肺癌还可以是不可能摘除的，如果它扩散到锁骨上的淋巴结，或如果癌症已生长到胸部内的重要结构例如心脏、大血管或导向肺的主要呼吸管。III或IV期肺癌可以描述为“晚期的肺癌”或“晚期肺癌”。
晚期的或晚期肺癌可以依据其转移状态或转移期进行表征。例如，所谓的转移期M0和M1可以用于指癌症的转移状态。M0转移状态通常指示在患者中未检测到肺肿瘤的转移。M1状态通常指示检测到转移。M1转移状态可以进一步细分成M1a和M1b期。转移期M1a通常用于描述其中一个或多个分开的肿瘤结节在对侧肺叶中出现的转移肺癌，具有胸膜结节或者恶性胸膜或心包流出物的肺癌肿瘤。主体中的NSCLC癌症的转移状态可以通过各种诊断程序进行测定，包括成像技术例如PET扫描，或通过活组织检查获得的组织样品的组织学检查。转移期M1b通常用于描述在胸腔外器官中具有远端转移的肺癌。
上皮生长因子受体
上皮生长因子受体（EGFR）也称为HER-1或Erb-B1，是涉及一些患者中的NSCLC发展和进展的癌基因。EGFR是Erb家族的膜结合受体蛋白质。EGFR包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其具有酪氨酸激酶活性。EGFR在其单体状态中是失活的。配体的结合导致EGFR与其他EGFR家族成员的同二聚化和异二聚化，随后为分子间酪氨酸磷酸化。衔接子或信号传导分子与磷酸化的EGFR结合，其触发下游细胞内信号传导级联。由EGFR触发的信号传导级联的实例是Akt、STAT和MAPK级联。EGFR通过几种机制促进各种癌症的生长，所述几种机制包括但不限于EGFR扩增和EGFR的突变活化。
抑制EGFR的酪氨酸激酶抑制活性的抗癌治疗药物得到开发。两种此类药物为小分子吉非替尼和埃罗替尼，其属于喹唑啉衍生物类别。吉非替尼和埃罗替尼两者均显示抑制EGFR酪氨酸磷酸化。在导致吉非替尼和埃罗替尼批准的临床研究中，药物显示延长相对小的非小细胞肺癌（NSCLC）患者子集在化学治疗后的存活。后续研究揭示EGFR酪氨酸激酶结构域中的突变存在于一部分NSCLC患者中，并且这些突变与对吉非替尼和埃罗替尼的临床应答性相关。与针对吉非替尼和埃罗替尼的抗性相关的EGFR突变也得到鉴定。NSCLC患者中的EGFR突变区域及其与吉非替尼和埃罗替尼疗法的联系领域中的早期开发的讨论例如在Pao和Miller，Journal of Clinical Oncology，23:2556-2568（2005）和Rosell等人，Clin. Cancer. Res. 12:7222-7231中发现。NSCLC患者中的EGFR突变的存在或不存在因此可以充当适合于评价患者中的NSCLC状态的标记物，例如测定特定患者的NSCLC是否潜在响应EGFR定向疗法。
与针对已知靶向药物疗法的药物敏感性或抗性相关的已知EGFR突变一般位于EGFR的酪氨酸激酶结构域中。一些已知突变在图1和表1中举例说明。这些突变中的一些分类为“活化突变”，其增强EGFR信号传导。一些活化EGFR突变与针对靶向药物疗法例如酪氨酸激酶抑制剂疗法的敏感性相关，并且有时被称为“敏化”突变。此类突变的实例是框内缺失EGFR外显子19，以及一些氨基酸置换，例如L858R、L861Q和在G719处的置换，有时被称为G719X，其包括但不限于G719A、G719C和G719S。
其他EGFR突变与针对酪氨酸激酶抑制剂疗法的抗性相关，并且通常在治疗过程中出现。此类突变可以被称为“抗性”突变，其实例为框内EGFR外显子20插入以及T790M和S678I氨基酸置换。本文描述的方法采用在患有NSCLC的主体血液中的EGFR突变包括活化和抗性突变的检测。
实施例
实施例 1
核酸分离和 PCR 扩增
所有样品均得自肺癌（NSCLC）患者。根据制造商的说明书，利用COBAS® DNA Sample Preparation Kit（Roche Molecular Diagnostics，Indianapolis，Ind.）执行核酸分离。根据制造商的说明书，使用COBAS® EGFR Mutation Test试剂盒（Roche Molecular Diagnostics），在COBAS®仪器上执行实时等位基因特异性PCR扩增。简言之，COBAS®试剂盒含有三种反应混合物，MMX1、MMX2和MMX3，用于等位基因特异性实时PCR检测人EGFR基因中的各种突变。MMX1包含引物和6-羧基荧光素（FAM）标记的探针，用于人EGFR基因的外显子19中的多重缺失（称为Ex19Del）和置换突变S768I（JA270信号）。MMX2包含用于置换突变L858R（FAM信号）和突变T790M（JA270信号）的引物和探针。MMX3包含用于置换突变L861Q（FAM信号）、一组置换突变G719X（HEX信号）和在人EGFR基因的外显子20中的多重插入（Ex20Ins）（JA270信号）的引物和探针。每个反应进一步包含靶向人EGFR基因的外显子28（Cy5.5信号）的内部对照（IC）引物和探针。
实施例 2
建立用于定量 DNA 靶的校准曲线
为了校准测定，使用COBAS® EGFR Mutation Test试剂盒，对各种基因组DNA量实施实时PCR扩增。测试十二个基因组DNA水平：0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、125、250和500 ng/反应。在每个基因组DNA水平下，120个重复PCR测定与内部对照（IC）引物和探针一起在试剂盒中包括的三种不同多路PCR反应混合物（MMX1、2和3，参见实施例1）中运行。所得到的标准曲线显示于图2中。在图2上，X轴代表基因组DNA水平，并且Y轴代表对应于反应中实现的交叉点（Cp）的循环数。基于由图2举例说明的实验数据，内部对照值的有效范围（IC Cp范围）设为20-32。在所选择的有效Cp范围内，对于测试的所有反应混合物均观察到测定线性。
实施例 3
建立定量 PCR 测定的截断限值
对于每种反应混合物，使用来自在以后PCR循环时出现的不存在真正靶的情况下的非特异性扩增（其被称为“突破扩增”）的数据，建立有效IC Cp范围内的可测量范围。对于每种反应混合物，对于至少一组引物和探针观察到突破扩增。对于每种反应混合物内的每种靶，测定CpR值，其为内部对照信号和突破信号之间的差异，计算为在相同反应中观察到的突破Cp和内部对照Cp之间的差异。例如，对于Ex19del靶（图2中举例说明的），突破在测试的更高基因组DNA水平下出现，但CpR在这些水平下是一致高的。观察到的最小CpR选择为截断值。如实施例2中讨论的，仅当IC值Cp在有效范围内，并且CpR值（靶和对照信号之间的差异）降到17.7的截断值以下时，靶Ex19del信号才视为阳性的（检测到突变）。
可替代地，截断可以简单地设为在校准实例中观察到的最低突破Cp。如表2中举例说明的，对于S768I靶，仅当IC值在有效范围内，并且靶Cp值低于34个循环的突破阈值时，靶信号才视为阳性的（检测到突变）。
实施例 4
建立在野生型基因组 DNA 靶的存在下定量突变体靶的校准曲线
为了约计含有癌细胞和正常细胞的患者样品，以及基因组DNA，通过测定可检测的每种突变体靶的各种量（参见实施例1）与野生型基因组DNA的各种量组合。含有T790M突变的靶核酸的不同量（2、4、8、50、100或200 ng/反应）与野生型基因组DNA本底的不同量（0.25、0.5、1.0、2.0、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250和500 ng/反应）组合。在实验中获得的靶特异性Cp随后针对输入靶DNA的量进行作图。将在不同靶DNA水平下获得的T790M特异性探针（JA270 Cp）的信号求平均值，并且针对样品中存在的T790M突变体靶的对数拷贝数作图。所得到的校准曲线显示于图3中。
实施例 5
检测肺癌（ NSCLC ）患者的血液中的突变体 EGFR DNA
在NSCLC患者经历化学疗法之后以及在埃罗替尼靶向疗法之前和过程中，从其中收集血浆样品。样品收集的时间线在图4中示意性举例说明。样品每四周以图4中指示为CP0-4的时间点进行收集。样品收集不一定在时间点CP4停止。DNA从收集的血浆样品中分离，且依照制造商的说明书，使用COBAS®试剂盒实施实时PCR扩增（参见实施例1）。对于举例说明性目的，图5示意性显示在两个示例性患者（“病例A”和“病例B”）的血浆中的EGFR的活化外显子10缺失（Ex19Del）和T790M活化置换的测量水平。在两个患者中，在初始诊断时获得的肿瘤组织样品先前已测定为含有活化EGFR突变（Ex19del），但不含抗性突变（T790M）。使用实施例5中所述的校准曲线测量突变体DNA序列的量，其以拷贝数表示且在图5中所示的图的Y轴上标绘。在病例A和B中，如通过合适的成像技术检测的，在血液中的突变体DNA量中的增加与NSCLC的进展关联，并且还指示针对埃罗替尼疗法的抗性的上升。
实施例 6
在具有不同转移状态的 NSCLC 患者血液中的 EGFR 突变检测
进行两项研究，其使NSCLC患者的血浆中的EGFR突变检测与患者的转移状态关联。在第一项研究（研究I）中，从二十八个IV期NSCLC患者中收集血浆样品和匹配的组织样品。测定组织样品和血样的突变状态。关于检测到的突变的数据与患者的转移状态相比较。研究I实验数据概括于表3和4中。
在第二项研究（研究II）中，从十七个IV期NSCLC患者中收集血浆样品和匹配的组织样品。测定组织样品和血样的突变状态。关于检测到的突变的数据与患者的转移状态相比较。研究II实验数据概括于表5-I、5-II和6中。
在研究I和研究II中，观察到组织和血浆样品中的EGFR突变检测之间的阳性一致对于具有远端转移（转移状态pM1b）的患者显著高于不具有远端转移（转移状态pM1a）的患者。关于不同转移状态的NSCLC患者血液中的活化EGFR突变检测的研究I和研究II数据的概括示意性显示于表7中。
实施例 7
检测初始诊断的 NSCLC 患者血液中的 EGFR 突变的利益
EGFR活化突变在200个患者的血液中进行检测，所述患者初始诊断为IIIB期到IV期NSCLC。检测一般根据较早实施例中所述的程序执行。活化EGFR突变在20%的患者血液中检测到。抗性EGFR突变在携带活化EGFR突变的患者子集中检测到。这些患者的转移状态通过PET扫描进行测定。50%的患者测定为具有pM1a转移状态，并且50%测定为具有pM1b转移状态。基于血液中的活化EGFR突变的检测及其在pM1b患者而不是pM1a患者中的肿瘤组织中的存在之间的高阳性一致的了解，推荐靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI）疗法，且施用于在血液中具有可检测的EGFR活化突变的pM1b和pM1a患者，而无需另外的诊断程序。靶向TKI疗法不推荐用于在血液中不含可检测的EGFR活化突变或具有可检测抗性突变的pM1b患者（另外的诊断程序视为不必要的）。在血液中不含可检测的EGFR活化突变的pM1a患者导向肿瘤组织的活组织检查，伴随活组织检查样品中的后续突变检测，以便测定这些患者是否为EGFR疗法的候选者。200个患者的上述决策制定过程在图6中示意性举例说明。在该决策制定过程下， 200个患者中仅94个需要活组织检查，随后为组织突变检测，一般测定它们是否为TKI靶向疗法的候选者。
实施例 8
检测复发 NSCLC 患者的血液中的 EGFR 突变的利益
EGFR活化突变在200个复发患者的血液中进行检测，所述患者患有IIIB期到IV期NSCLC。检测一般根据较早实施例中所述的程序执行。活化EGFR突变在20%的患者血液中检测到。这些患者的转移状态通过PET扫描进行测定。40%的患者测定为具有pM1a转移状态，并且60%测定为具有pM1b转移状态。基于血液中的活化EGFR突变的检测及其在pM1b患者而不是pM1a患者中的肿瘤组织中的存在之间的高阳性一致的了解，推荐靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI）疗法，且施用于在血液中具有可检测的EGFR活化突变的pM1b和pM1a患者，而无需另外的诊断程序。靶向TKI疗法不推荐用于在血液中不含可检测的EGFR活化突变的pM1b患者（另外的诊断程序视为不必要的）。在血液中不含可检测的EGFR活化突变的pM1a患者导向肿瘤组织的活组织检查，伴随活组织检查样品中的后续突变检测，以便测定这些患者是否为EGFR疗法的候选者。200个患者的上述决策制定过程在图7中示意性举例说明。在该决策制定过程下， 200个患者中仅74个需要活组织检查，随后为组织突变检测，一般测定它们是否为TKI靶向疗法的候选者。
实施例 9
检测 NSCLC 患者的血液中的 EGFR 突变的利益
EGFR活化突变在200个复发患者的血液中进行检测，所述患者患有IIIB期到IV期NSCLC。检测一般根据较早实施例中所述的程序执行。决策制定过程在图8中示意性举例说明。
表 1 ：EGFR突变的实例。
表 2 ：用于建立定量PCR测定的可测量范围的截断限值的示例性实验数据概括。
表 3：研究I实验数据的概括。
表 4 ：在组织样品中具有可检测突变的患者的研究I实验数据的概括。
表 5-I ：研究II实验数据的概括。
表 5-II：研究II实验数据的概括。
表 6：研究II实验数据的概括。
表 7：在不同转移状态的NSCLC患者血液中的活化EGFR突变检测的研究I和研究II数据概括。
实施例 10
临床研究
进行临床研究用于评估NSCLC患者中的治疗后果。研究设计在图9中示意性举例说明。患有先前未经治疗的IIIB/IV期NSCLC的451患者加入该研究中。将患者分成通过癌症分期、组织学、吸烟状态分层的两个大致对等的组，且指定治疗方案。如下文更详细地讨论的，使用三种治疗方案：吉西他滨+卡铂、顺铂+埃罗替尼或顺铂+安慰剂。两个患者组指定至两个不同的研究臂：组合疗法臂，意指化学疗法和TKI疗法的组合，和化学疗法臂。在四周治疗期时，加入组合疗法臂（“CE臂”）的患者在每个治疗循环的第1和8天时施用1,250 mg/m2 吉西他滨，加上在第1天时的75 mg/m2 卡铂 AUC=5或顺铂，加上在第15–28天时的150 mg/天的埃罗替尼（Tarceva®）。化学疗法臂（“C臂”）的患者在每个治疗循环的第1和8天时施用1,250 mg/m2 吉西他滨，加上在第1天时的75 mg/m2 卡铂 AUC=5或顺铂，加上在第15–28天时的安慰剂。上述疗法对于每组重复6个治疗循环（“治疗阶段”）。在维持阶段时，加入组合疗法臂中的患者施用150 mg/天的埃罗替尼，直至出现进行性疾病。化学疗法臂的患者施用安慰剂，直至出现进行性疾病，在该点起始以150 mg/天的埃罗替尼施用。根据RECIST定义进行性疾病（PD）。
在疗法施用前的研究开始时（“基线”），从许多研究参与者中收集基线组织和血浆样品。还在治疗循环3结束时（“C3”）和进行性疾病期（“PD”）时，从许多患者中收集血浆样品。在研究过程中变得可用的样品数量和类型概括于图10中。对于451个患者中的305个可获得在基线、C3和PD时的可分析样品，所述患者同意收集和分析其血浆样品（67.6%）。
在血浆样品中的突变体靶DNA的检测通过qPCR进行，所述qPCR一般根据实施例1-4中所述的程序。组织样品为根据常规程序制备且贮存的福尔马林固定、石蜡包埋的组织（FFPET）样品。血样为根据常规程序制备且贮存的血浆样品。对于每种组织测试使用一个FFPET切片，并且对于每种血液测试使用一份2 ml血浆样品。来自组织样品和血样的核酸分离和测试基本上如实施例1-4中所述进行。测试分别使用适应FFPET和血液测试的COBAS ® EGFR Mutation Test Kits进行。
实施例 11
EGFR 突变发生率
测定血浆EGFR突变阳性组织和血浆样品的发生率。对于血浆样品，突变阳性样品的总体发生率在基线时为35%（106/305），在C3时为15%（47/305），并且在PD样品收集点也称为“时间点”时为27%（81/305）。在患者中检测到的EGFR突变序列的详细分布显示于表8中。对于TKI敏化突变，发生率对于组织样品为40.2%，对于基线血浆样品为32.2%，对于C3血浆样品为13.0%，并且对于PD血浆样品为23.9%。对于TKI抗性突变，发生率对于组织样品为5.4%，对于基线血浆样品为2.0%，对于C3血浆样品为1.4%，并且对于PD血浆样品为3.7%。
表 8：EGFR突变分布（样品数目）。
实施例 12
肿瘤和血浆样品之间的一致性
对于加入临床研究中的238个患者，对于肿瘤和基线血浆样品两者（“匹配对”）可获得EGFR分析结果。肿瘤和基线血浆样品之间的EGFR TKI敏化突变检测的一致性测量如下：灵敏度 - 75%（72/96个患者）；特异性 - 96%（137/142个患者）；阳性预测值 - 94%（72/77个患者）；阴性预测值 - 85%（137/161个患者）；总体一致性 - 88%（209/238个患者）。TKI敏化突变的一致性数据概括于表9中。
表 9 ：肿瘤和血浆样品的TKI敏化突变的一致性数据。
实施例 13
在具有不同转移状态的患者中的肿瘤和血浆样品之间的一致性
确定与不含远端转移的患者相比较，关于TKI敏化突变的肿瘤和血浆样品之间的一致性在具有远端转移的患者中更高。转移状态对于具有可用组织和基线血浆样品的233个患者可获得。转移状态在基线时间点进行测定。表10（A-C）显示了基于转移状态，组织和基线血浆样品的一致性数据的概括。在M1b患者亚组中的血浆EGFR突变测定的灵敏度为91%（41/45个患者），特异性为98%（47/48个患者），并且总体一致性为95%（88/93个患者）。在M1a患者亚组中，血浆EGFR突变测定的灵敏度为60%（29/48个患者），特异性为95%（83/87个患者），并且总体一致性为83%（112/135个患者）。
表 10：关于TKI敏化突变的肿瘤和血浆样品与转移状态之间的一致性数据
A. 基于患者转移状态的数据概括
B. 具有M1a转移状态的患者中的肿瘤和组织样品之间的一致性
患者突变状态 pMUT+患者 pMUT-患者
tMUT+患者 29 19
tMUT-患者 4 83
C. 具有M1a转移状态的患者中的肿瘤和组织样品之间的一致性
患者突变状态 pMUT+患者 pMUT-患者
tMUT+患者 43 4
tMUT-患者 1 50
实施例 14
血浆样品中的靶 DNA 检测
用于定量DNA靶的标准曲线显示于图11中。EGFR血浆突变阳性和血浆突变阴性患者中的无细胞（cf）DNA分布通过图12和表11举例说明。该实施例中讨论的实验结果显示检测在检测范围内是线性的。应当理解Cp可以用于代替用于定量DNA靶的标准曲线的DNA拷贝数。
表 11：在患者中通过COBAS®检测到的总无细胞DNA（拷贝/ml）分布（数据集显示于图12中）。
通过pMUT+患者的COBAS®血浆样品检测到的DNA水平的数据在图13和表12中举例说明。数据举例说明FASTACT-2临床试验群体中的每种突变体的检测范围。
举例说明在突变阳性和突变阴性患者的血浆中通过COBAS®测试检测的突变DNA水平的比较数据显示于图14和15以及表13和14中。图14和表13代表关于DNA水平（拷贝/ml）的数据，而图15和表14代表就野生型DNA而言，关于样品中检测到的靶DNA的相对量（Mut%），即检测到的突变体DNA相对于检测到的总基因组DNA（gDNA）的Mut%比。数据显示对于每种突变体，在FASTACT-2临床试验群体中如以Mut%表示的检测范围。
表 12 ：MUT+患者的血浆样品中检测到的DNA水平（拷贝/ml）（相应的数据集在图13中举例说明）。
表 13 ：在突变阳性（“阳性”）和突变阴性（“阴性”）患者的血浆样品中检测到的DNA水平（拷贝/ml）（相应的数据集在图14中举例说明）。
表 14 ：在突变阳性（“阳性” ）和突变阴性（“阴性”）患者的血浆样品中检测到的DNA水平（检测到的突变体DNA相对于检测到的总DNA的%）（相应的数据集显示于图15中）。
实施例 15
在不同时间点的血浆样品分析
对于451个患者中的305个（67.6%）可获得在基线、C3和PD时间点各自时的可分析血浆样品。在基线、C3和PD时的血浆EGFR突变阳性样品的发生率分别为35%（106/305）、15%（47/305）和27%（81/305）。100个突变阳性患者的98个显示为在基线时间点具有外显子19缺失（Ex19Del）或L858R置换（C臂 - 51；CE臂 - 47）。在C3时间点，C臂患者中的21个（41%）丧失EGFR突变阳性，并且C臂患者中的39个（83%）丧失突变阳性。在PD时间点，C臂中的21个患者中的8个以及CE臂中的39个患者中的18个重新获得突变阳性。这些数据显示患者突变负荷在治疗过程中不断改变。
199个患者在基线时为突变阴性的（C臂中的103个患者和CE臂中的96个患者）。在这些患者中，基于血浆结果，12个患者在PD时间点变成突变阳性。对于这12个患者中的6个，组织结果是可获得的，并且指示所有6个患者在组织样品中均具有与在PD时间点收集的血浆样品中检测到的那些相同的一个或多个突变。这些数据显示患者突变负荷在治疗和疾病进展过程中是动态的。数据分析的结果通过图16-18和表15-20举例说明。
表 15：关于在三个时间点的血浆样品中的不同突变发生率的数据概括。
表 16：关于在三个时间点的血浆突变阳性和突变阴性患者的发生率的数据概括。
表 17：关于在PD期时检测为突变阳性的六个患者中检测到的突变的数据概括。
表 18：关于在基线时间点为血浆Ex19Del和/或L858R阳性的患者的数据概括。
表 19 ：关于在基线时为Ex19Del阳性的患者的数据概括。
表 20 ：关于在基线时为L858R阳性的患者的数据概括（在C3时的四个样品和在PD时间点的一个样品估计为L858R阳性的，但由于这些样品中存在的cf DNA的高本底而不包括在概括中）。
实施例 16
经过临床研究过程，在血浆样品中检测到的 DNA 水平的动态数量变化
评估经过研究过程，在血浆样品中检测到的DNA水平的动态数量变化。图19和表21举例说明了经过研究过程，总血浆cf DNA中的动态数量变化。图20和表22举例说明了经过研究过程，在突变的靶DNA的总水平中的动态数量变化。图21和表23举例说明了经过研究过程，在EGFR外显子19和21中的靶突变DNA中的动态数量变化。经过研究过程，在临床研究的C和CE臂两者中均观察到血浆EGFR靶序列的总水平中的大幅度下降。然而，血浆中的EGFR突变DNA的检测水平仅在C臂中在PD时反弹至高水平，并且在CE臂中保持很低。本实施例中讨论的数据显示患者突变负荷在治疗过程中是动态的。还显示TKI在治疗患有EGFR阳性肿瘤的患者时更有效。
表 21：在临床研究过程中的三个时间点检测到的总血浆cf DNA的水平。
表 22：在三个时间点检测到的总EGFR突变DNA的水平。
表 23：在三个时间点检测到的外显子19和21中的总EGFR突变DNA的水平。
实施例 17
突变状态和治疗后果之间的关联
进行数据分析，以便检测NSCLC患者的血浆和组织样品中的EGFR突变检测与治疗后果之间的关联。对138个血浆突变阳性患者（基于基线样品）和289个血浆突变阴性患者，以及组织阳性和组织阴性患者，执行总体应答率（ORR）、无进展存活（PFS）和总体存活（OS）的亚组分析。与组织突变阳性患者中的CE臂的16.8个月相对于C臂中的6.9个月（HR 0.25）相比较，血浆突变阳性患者的中值PFS在研究的CE臂中为13.8个月相对于C臂中的5.9个月（危害比（HR）> 0.21）。与组织突变阴性患者中的CE臂中的6.7个月相对于C臂中的5.9个月（HR 0.97）相比较，血浆突变阴性患者的中值PFS在研究的CE臂中为6.7个月相对于C臂中的6.0个月（HR 0.80）。与组织突变阳性患者中的CE臂的31.4个月相对于C臂中的20.6个月（HR 0.48）相比较，血浆突变阳性患者的中值OS在CE臂中为32.4个月相对于C臂中的18.6个月（HR 0.50）。与组织突变阴性患者中的CE臂中的14.9个月相对于C臂中的12.2个月（HR 0.77）相比较，血浆突变阴性患者的中值OS在CE臂中为16.1个月相对于C臂中的13.3个月（HR 0.90）。
根据基线血浆EGFR突变状态的治疗后果概括于表24和图22-25中。基于C3血浆样品和组织样品的治疗后果的比较数据在图26-27以及表25和26中举例说明。具有不同突变状态的患者中的治疗后果的上述分析揭示血浆EGFR突变状态可以预测治疗后果，例如特定患者的无进展存活和/或总体存活的长度。图22A（PFS）和24A（OS）举例说明了在两个治疗臂（总共138个患者）中的血浆突变阳性患者（在基线时）之间的比较。比较指示化学疗法和埃罗替尼疗法的组合是用于患者的更佳治疗选项，所述患者在基线时间点测定为血浆突变阳性的。图22B（PFS）和24B（OS）举例说明了在两个治疗臂（总共97个患者）中的组织EGFR突变阳性患者（在基线时测试的）之间的比较。比较指示化学疗法和埃罗替尼的组合是用于组织EGFR突变阳性患者的更佳治疗选项。图22和24显示了在基线时在血浆或组织中的突变负荷检测预测关于突变阳性患者的相似结果。图23和25举例说明了在两个治疗臂中在基线时的突变阴性患者之间的比较（血浆突变阴性– 图23A和25A；组织突变阴性– 图23B和25B）。在基线时在血浆或组织中的突变负荷检测预测关于突变阴性患者的相似后果。图26举例说明了在基线时测试为血浆EGFR突变阳性的，并且还在C3时间点再次测试的患者的分析（总共122个患者）。这122个患者基于其C3 EGFR突变状态（阳性或阴性）和治疗臂进行分组。如果患者在C3时间点为血浆突变阴性的（其可能指示患者响应治疗），则他们在两个治疗组中具有更佳的PFS和OS。在基线时的阳性突变状态随后为在C3时间点的阴性突变状态与改善的后果相关；在基线时阳性且在C3时间点仍为阳性的患者经历更糟的后果。图27举例说明了在化学疗法+埃罗替尼治疗臂中的患者分析，所述患者在基线时测试为血浆EGFR突变阳性的，并且还在C3时间点再次测试（总共122个患者）。这122个患者基于其C3 EGFR突变状态（阳性或阴性）进行分组。对于患者观察到就PSF而言的最佳后果，所述患者在C3时间点为突变阴性的，且施用化学疗法+埃罗替尼治疗。在基线时的阳性突变状态随后为在C3时间点的阴性突变状态与改善的后果相关；在基线时阳性且在C3仍为阳性的患者经历更糟的后果。
应当理解本文描述的实例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且根据其的各种修饰或变化将是本领域技术人员想到的，并且包括在本申请的精神和权限内以及所附权利要求的范围内。
表 24：根据在基线时间点的血浆EGFR突变状态的治疗后果；A – 关于血浆突变阳性患者（138个患者）的数据概括；B – 关于血浆突变阴性患者（289个患者）的数据概括。
表 25：在突变阳性和突变阴性患者（总共122个患者）中的血浆C3突变状态和治疗后果之间的关联。
表 26 ：在临床研究的两个臂中，在突变阳性和突变阴性患者（总共122个患者）中的血浆C3突变状态和治疗后果之间的关联。
。

Claims (35)

1.一种评价患有实体瘤癌症的人主体的状态的方法，其包括：
定量得自患有实体瘤癌症的所述主体的样品中的核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变的量，其中所述主体已完成一个或多个疗法周期。
2.权利要求1的方法，其中所述疗法包括酪氨酸激酶抑制剂的施用。
3.权利要求2的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是埃罗替尼或吉非替尼。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述癌症相关的体细胞突变的量高于阈值水平，并且其中所述方法进一步包括所述主体的进一步治疗，其中所述进一步治疗是手术、化学疗法、靶向药物疗法或其任何组合。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变包含癌基因中的活化突变。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述评价包括监控所述主体中的所述实体瘤癌症。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中如果所述样品中的核酸序列中的所述一种或多种癌症相关体细胞突变中的至少一种的数量超过阈值，则所述评价包括给所述主体施用靶向药物疗法。
8.权利要求7的方法，其中所述核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变含有癌基因中的活化突变，并且所述靶向药物疗法是靶向所述癌基因的酪氨酸激酶抑制剂。
9.权利要求7或8的方法，其中如果检测到所述核酸序列中的一种或多种癌症相关体细胞突变数量中的增加，则所述评价进一步包括增加给所述主体施用的所述靶向药物疗法的剂量。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述检测包括执行定量实时聚合酶链反应或核酸测序。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述一种或多种癌症相关体细胞突变是EGFR核酸序列中的一种或多种体细胞突变。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述实体瘤癌症是肺癌。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述实体瘤癌症是NSCLC，并且所述核酸序列是EGFR序列。
14.权利要求13的方法，其中EGFR核酸序列中的所述一种或多种体细胞突变选自框内外显子19缺失、L858R、L861Q、G719X、T790M、S678I和框内外显子20插入。
15.一种鉴定用于靶向药物疗法的候选非小细胞肺癌（NSCLC）患者的方法，其包括：
检测来自所述患者的血液中一种或多种突变的表皮生长因子受体（EGFR）序列的存在或不存在；
将所述NSCLC患者的转移状态评价为M1a或M1b；和
基于至少检测到的所述患者血液中的一种或多种突变EGFR序列的存在，以及所述患者中的NSCLC的转移状态，将所述患者鉴定为用于所述靶向药物疗法的候选者。
16.权利要求15的方法，其中所述一种或多种突变EGFR序列包含活化EGFR突变。
17.权利要求16的方法，其中所述活化EGFR突变选自外显子19缺失、L858R、L861Q和G719X。
18.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述一种或多种突变EGFR序列包含抗性EGFR突变。
19.权利要求18的方法，其中所述抗性EGFR突变选自T790M、S678I和外显子20插入。
20.权利要求15-19中任一项的方法，其中所述检测包括通过分析技术就所述一种或多种突变EGFR序列测试来自所述患者的血液。
21.权利要求15-20中任一项的方法，其中所述分析技术包括定量实时聚合酶链反应或核酸测序。
22.权利要求15-21中任一项的方法，其中所述靶向药物疗法是酪氨酸激酶抑制剂。
23.权利要求22的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是埃罗替尼或吉非替尼。
24.权利要求15的方法，其中所述评价的患者转移状态为M1a，其中如果检测到所述患者血液中的一种或多种突变EGFR序列中的至少一种的不存在，则所述鉴定进一步包括检测具有转移状态M1a的患者的肿瘤组织中的一种或多种突变EGFR序列的存在或不存在。
25.权利要求15的方法，其中所述评价的NSCLC患者转移状态为M1b，其中如果检测到所述患者血液中的一种或多种突变EGFR序列中的至少一种的存在，则所述鉴定包括将具有转移状态M1b的所述NSCLC患者鉴定为所述靶向药物疗法的候选者。
26.权利要求25的方法，其中如果检测到所述主体血液中的一种或多种突变EGFR核酸序列中的至少一种的存在，则所述评价包括给所述主体施用靶向药物疗法。
27.权利要求15的方法，其中如果检测到所述主体血液中的一种或多种突变EGFR核酸序列中的至少一种的存在，则所述评价包括给所述主体施用靶向药物疗法。
28.权利要求27的方法，其中所述至少一种或多种突变EGFR序列含有活化EGFR突变，并且所述靶向药物疗法是酪氨酸激酶抑制剂。
29.权利要求15的方法，其中所述检测包括在靶向药物疗法之前、在靶向药物疗法过程中或在靶向药物疗法之后、或其任何组合，一次或多次检测所述主体血液中的一种或多种突变EGFR序列的存在或不存在。
30.权利要求29的方法，其中检测到含有活化EGFR突变的至少一种或多种突变EGFR序列的存在，并且如果检测到所述突变EGFR序列数量中的增加，则所述评价进一步包括增加给所述患者施用的酪氨酸激酶抑制剂的剂量。
31.权利要求15的方法，其中如果检测到抗性EGFR突变的存在，则所述评价包括修改所述靶向药物疗法。
32.权利要求15-30中任一项的方法，其中所述检测包括在化学疗法之前、在化学疗法过程中或在化学疗法之后、在手术之前或在手术之后或其任何组合，检测所述NSCLC患者血液中的一种或多种突变EGFR序列的存在或不存在。
33.一种评价患有实体瘤癌症的主体状态的方法，其包括：
检测来自患有实体瘤癌症的所述主体的血液中的一种或多种肿瘤相关的突变核酸序列的存在或不存在；和
基于检测到的所述一种或多种肿瘤相关的突变核酸序列的存在或不存在，评价患有远端转移实体瘤癌症的所述主体的状态。
34.权利要求33的方法，其中如果检测到所述主体血液中的一种或多种肿瘤相关的突变核酸序列中的至少一种的存在，则所述评价包括给所述主体施用靶向药物疗法。
35.权利要求34的方法，其中所述至少一种或多种突变癌基因序列含有活化突变，并且所述靶向药物疗法是酪氨酸激酶抑制剂。
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