CN105219834A - 细菌鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细菌鉴定方法，因为相机与计算部连接，能够将相机采集到的灰度数据及时处理，因此，计算部接收到相机采集的灰度数据随时间的延长，变化在预定阈值内时，计算部即可控制相机停止采集，并且将灰度值转换为浊度值，曲线生成部将浊度值与时间曲利用logistic四参数模型生成生长曲线，判断部将生长曲线与标准库中的生长曲线进行比较从而鉴定出细菌的种类，因此，本发明的细菌鉴定方法采用细菌对数生长期的生长曲线对待鉴定细菌进行鉴定，缩短了鉴定的时间，鉴定的准确度高，并且操作简单，方便。

Description

细菌鉴定方法

技术领域

本发明属于生物鉴定领域，具体涉及一种细菌鉴定方法。

背景技术

着仪器分析技术快速进步和计算机广泛应用，微生物菌种鉴定渐渐地由传统的形态学观察和人工、生理生化实验鉴定转入基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段。

国内微生物鉴定系统的研究从20世纪末开始，起步较晚，代表产品有杭州天和HW-138细菌鉴定分析仪、山东鑫科XK-3401自动微生物鉴定/药敏分析系统、湖南天地人TDR-200C自动细菌鉴定/药敏分析系统、安徽恒星HX-21细菌鉴定药敏分析仪、FORTUNE2000微生物自动鉴定/药敏系统等。国内的细菌鉴定仪价格适中，适合广泛使用，但由其性能参差不齐，有些细菌新种、亚种不能被鉴定，并且国内读数仪均使用比浊和比色技术，鉴定速度相对较慢。随着微生物检测市场进入高速发展期，设计出一种操作简便，鉴定时间短的微生物鉴定方法势在必行。

发明内容

本发明是为了解决上述课题而进行的，目的在于提供一种用于快速、准确的鉴定细菌种类的细菌鉴定方法。

本发明提供了一种细菌鉴定方法，包括以下步骤：步骤1，建立包含多个已知细菌的标准生长曲线的标准数据库；步骤2，将待鉴定细菌分别放入复数个孵育孔内进行培养；步骤3，设定预定的时间间隔，用相机根据时间间隔分别采集复数个孵育孔内包含待鉴定细菌的菌液的实时的灰度值；步骤4，计算部根据灰度值基于预定规则得到复数个孵育孔内菌液的浊度值，并根据浊度值控制相机停止采集；步骤5，曲线生成部选取待鉴定细菌在对数生长期间的浊度值和与所述浊度值相对应的时间并根据logistic四参数模型分别做出待鉴定细菌在每个孵育孔的生长曲线；步骤6，判断部将每个孵育孔的生长曲线与相对应孵育孔的标准生长曲线进行比较从而鉴定出待鉴定细菌的种类。

在本发明所提供的细菌鉴定方法，还可以具有这样的特征：其中，标准生长曲线是将已知细菌放入多组复数个孵育孔进行培养，从而在相应的孵育孔内得到多组待定生长曲线，将多组待定生长曲线取平均值得到标准生长曲线。

在本发明所提供的细菌鉴定方法，还可以具有这样的特征：其中，相机为CCD相机，与计算部相连接，能够实时采集复数个孵育孔的所述灰度值，并将灰度值传送到计算部进行处理。

在本发明所提供的细菌鉴定方法，还可以具有这样的特征：其中，曲线生成部采用logistic四参数模型为拟合模型，并利用Lewenberg-Marquardt算法将浊度值与时间进行拟合从而得到生长曲线，

logistic四参数模型的表达式为：

$y=\frac{A_1-A_2}{1+{\left(\frac{x}{x_0}\right)}^p}+A_2$

y表示浊度值；x表示时间；A₁表示浊度值y的最小值；A₂表示浊度值y的最大值；x₀为最大生长比率点；p是浊度值增长速率参数。

在本发明所提供的细菌鉴定方法，还可以具有这样的特征：其中，logistic四参数模型的初始值A₁、A₂采用平均值法求得，x₀采用最小二乘法进行局部平滑线性拟合发求得。

在本发明所提供的细菌鉴定方法，还可以具有这样的特征：其中，待鉴定细菌的延滞期由x₀点的切线与时间轴相交得到的三角形求得。

发明的作用和效果

根据本发明所涉及的细菌鉴定方法，因为相机与计算部连接，能够将相机采集到的灰度数据及时处理，因此，计算部接收到相机采集的灰度数据随时间的延长，变化在预定阈值内时，计算部即可控制相机停止采集，并且将灰度值转换为浊度值，曲线生成部将浊度值与时间利用logistic四参数模型生成生长曲线，判断部将生长曲线与标准库中的生长曲线进行比较从而鉴定出细菌的种类，因此，本发明的细菌鉴定方法采用细菌对数生长期的生长曲线对待鉴定细菌进行鉴定，缩短了鉴定的时间，鉴定的准确度高，并且操作简单，方便。

附图说明

图1是本发明的实施例中细菌鉴定方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的细菌鉴定方法作具体阐述。

图1是本发明的实施例中车辆过弯时间优化算法的流程图。

如图1所示，在本实施例中，细菌鉴定方法用于鉴定细菌的种类，并且能够确定细菌在每个孵育仓中培养的阴阳性。细菌鉴定方法的具体步骤如下：

步骤S1,建立数据库，数据库中存储有大量已知细菌的标准生长曲线。

每块孵育板包含48个孵育孔，每个孔中的基液均含有四唑类氧化还原染色剂、胶质以及47种不同的碳氮源物质。将已知细菌放入孵育板的孵育孔内进行培养，从而得到该细菌在每个孵育孔的生长曲线。要得到每个孵育孔的标准生长曲线，需要采用多个孵育板同时培养细菌，而每个孵育板中相对应的孵育孔内的基液相同。对已知细菌在多个相同孵育孔得到的生长曲线取平均值，即可得到每个孵育孔的标准生长曲线。

就基液相同的不同孵育孔而言，细菌在每个孵育孔内的生长状况会出现差异，获得每个孵育孔的生长曲线，并根据每个孵育孔的生长曲线得到平均生长曲线，当每个孵育孔的生长曲线与平均生长曲线之间的相似度大于0.97时，且相似度大于0.97的孵育孔占所有孵育孔的比重在85％以上，则孵育板上的该孵育孔为阳性孔。平均生长曲线即为已知细菌在该孵育孔的标准生长曲线。

各孔取得的生长期曲线和平均生长期曲线间的相似度，利用前期浊度值阈值判断出的阴阳性，生长曲线与平均生长曲线之间的相似度大于0.97的孵育孔的比重未达到85％，但相似度大于0.97的孵育孔个数偏多，则孵育板上的该孵育孔为模糊孔。在数据库中，模糊孔作为阳性孔，平均生长曲线即为已知细菌在该孔的标准生长曲线。

在微生物在鉴定板中无法利用碳源进行呼吸时，因此不会发生氧化-还原反应产生电子，存在于培养液中的TTC(四唑紫)吸收不到电子，也就不会转变颜色，该类孔培养反应表现为无色反应孔，即为阴性孔。

阴性孔没有或有微弱的生长趋势，这类孔不符合Logistic四参数模型，故不需要对数据进行拟合。该类孔没有或有微弱显色反应，得到的图像浊度值也都较小，且起伏不大，故对这类孵育孔的曲线做平均处理，得到阴性标准曲线。

就基液相同的不同孵育孔而言，已知细菌在一部分孵育孔内生长，在一部分孵育孔内不生长，即一部分孵育孔为阳性孔，一部分孵育孔为阴性孔，则孵育板上的该孵育孔为不稳定孔。将阳性孔的生长曲线取平均值得到阳性平均生长曲线，将阴性孔的生长曲线取平均值得到阴性平均生长曲线。

然后,进入步骤S2。

步骤S2,将待鉴定细菌分别放入孵育板的48个孵育孔内进行培养。孵育板的48个孵育孔内的基液与做数据库中已知细菌培养的基液相同。然后，进入步骤S3。

步骤S3，设定预定的时间间隔为20分钟，用CCD相机每间隔20分钟采集孵育板中每个孵育孔的图像，获得每个孵育孔的亮度、颜色或纹理变化信息，从而得到图像的灰度值。然后，进入步骤S4。

步骤S4，计算部与CCD相机连接，CCD相机将实时采集到的灰度值传送到计算部，然后计算部将灰度值基于预定规则得到复数个孵育孔内菌液的浊度值，并且当浊度值的变化在一定时间段内小于预定阈值时，控制CCD相机停止采集。然后，进入步骤S5。

步骤S5，本发明采用logistic四参数模型作为拟合模型，并采用Levenberg-Marquardt算法对待鉴定细菌对数生长期间的浊度值和与浊度值相对应的时间进行拟合。用Matlab作为编程语言。

logistic四参数模型的表达式为：

$y=\frac{A_1-A_2}{1+{\left(\frac{x}{x_0}\right)}^p}+A_2$

y表示浊度值；x表示时间；A₁表示浊度值y的最小值；A₂表示浊度值y的最大值；x₀为最大生长比率点；p是浊度值增长速率参数。

编写MATLAB程序作曲线拟合时，关键点在于模型参数初始值的选取。根据微生物生长曲线特征，A₁、A₂的初始值采用均值法求得，x0、p的初始值采用局部平滑线性拟合法求得。A₁的初始值由延滞期数据提供，取延滞期数据前10点做均值处理，得到A₁初始值。A₂初始值由稳定期数据提供，通过生长曲线末尾数据取10点做均值计算，求得A₂初始值。

在该模型初始值估计中，由于生长期对生长鉴定是最有价值的特征，所以x₀的估计尤其重要。因此我们采用最小二乘法原理局部平滑线性拟合法对x₀进行初始值估计。

最小二乘法为通过最小化误差的平方和寻找数据的最佳函数匹配，使得求得的数据与实际数据之间误差的平方和为最小。数据拟合具体做法：研究变量x与y之间的关系时，通常可以得到一系列成对的数据((x₁，y₁)，(x₂，y₂)……(x_m，y_m))；将这些数据描绘在x-y直角坐标系中，发现这些点在一条直线附近，直线模型如下：

y＝a+bx(1)

其中：a、b是任意实数。

定义：

其中，y'为实际值，y为计算值，m为数据的个数，基于最小二乘法原理，最小时为优化判据。

把式(1)代入中得：

当最小时，可用函数对a、b求偏导数，令这两个偏导数等于零得到。

$m*a+b\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}x=\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}{y}^{\′}---\left(3\right)$

$a\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}x+b\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}{x}^2=\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}(x*y^{\′})---\left(4\right)$

由式(3)、和式(4)得出：

$a=\frac{\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}{y}^{\′}}{m}-\frac{b\left(\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}x\right)}{m}---\left(5\right)$

$b=\frac{\[m\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}{\mathrm{xy}}^{\′}-\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}x\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}{y}^{\′}\]}{m\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}{x}^2-{\left(\underset{1}{\overset{m}{\Σ}}x\right)}^2}---\left(6\right)$

将式(5)和式(6)代入式(1)即可得到式(1)的表达式。

对数据预处理，进行数据局部平滑，再进行线性拟合处理。对数据做最小二乘法线性拟合时，根据线性回归分析公式(1)可得出b值；根据微生物生长曲线特征，结合ORIGIN很好拟合Logistic四参数模型，得到的拟合出的模型特征值x₀。比较不同孔分别求出的这两个值，发现x₀值是等于b值最大值点位置与局部拟合的点数的中位数之间的差。

待鉴定细菌的延滞期由x₀点的切线与时间轴相交得到的三角形求得。然后进入步骤S6。

步骤S6，判断部将待鉴定细菌的生长曲线与标准库中的标准生长曲线进行比较。

如果标准库中某种已知细菌在某个孵育孔为阳性孔或者阴性孔，则将带鉴定细菌该孵育孔的生长曲线与标准曲线进行比较。

如果标准库中某种已知细菌在某个孵育孔为不稳定孔，则将待鉴定细菌该孵育孔的生长曲线，分别与该孵育孔的阳性标准生长曲线和阴性标准生长曲线分别进行比较，如果生长曲线与阳性标准生长曲线的相似度大于与阴性生长曲线的相似度，则该孵育孔为阳性孔，取与阳性标准生长曲线的相似度，否则取阴性标准生长曲线的相似度。

如果待鉴定细菌在某孵育孔的生长曲线与已知细菌的生长曲线在该孵育孔的标准生长曲线之间的相似度大于97％时，则待鉴定细菌的该孵育孔与已知细菌的该孵育孔相匹配。48个孵育孔中相匹配的孵育孔的数量达到97％以上时说明带鉴定细菌即为该已知细菌。

如果，待鉴定细菌与标准数据库中的所有已知细菌均不匹配，则待鉴定细菌不是标准数据库中任一细菌，计算部将此待鉴定细菌的生长曲线存储与标准数据库中。

实施例的作用与效果

根据本实施例所涉及的细菌鉴定方法，因为相机与计算部连接，能够将相机采集到的灰度数据及时处理，因此，计算部接收到相机采集的灰度数据随时间的延长，变化在预定阈值内时，计算部即可控制相机停止采集，并且将灰度值转换为浊度值，曲线生成部将浊度值与时间利用logistic四参数模型生成生长曲线，判断部将生长曲线与标准库中的生长曲线进行比较从而鉴定出细菌的种类，因此，本发明的细菌鉴定方法采用细菌对数生长期的生长曲线对待鉴定细菌进行鉴定，缩短了鉴定的时间，鉴定的准确度高，并且操作简单，方便。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种细菌鉴定方法，利用已知细菌的生长曲线鉴定待鉴定细菌的种类，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，建立包含多个已知细菌的标准生长曲线的标准数据库；

步骤2，将所述待鉴定细菌分别放入复数个孵育孔内进行培养；

步骤3，设定预定的时间间隔，用相机根据所述时间间隔分别采集所述复数个孵育孔内包含所述待鉴定细菌的菌液的实时的灰度值；

步骤4，计算部根据所述灰度值基于预定规则得到所述复数个孵育孔内所述菌液的浊度值，并根据所述浊度值控制所述相机停止采集；

步骤5，曲线生成部选取所述待鉴定细菌在对数生长期间的所述浊度值和与所述浊度值相对应的时间并根据logistic四参数模型分别做出所述待鉴定细菌在每个所述孵育孔的生长曲线；

步骤6，判断部将每个孵育孔的所述生长曲线与相对应孵育孔的所述标准生长曲线进行比较从而鉴定出所述待鉴定细菌的种类。

2.根据权利要求1所述的细菌鉴定方法，其特征在于：

其中，所述标准生长曲线是将所述已知细菌放入多组所述复数个孵育孔进行培养，从而在相应的所述孵育孔内得到多组待定生长曲线，将所述多组待定生长曲线取平均值得到所述标准生长曲线。

3.根据权利要求1所述的细菌鉴定方法，其特征在于：

其中，所述相机为CCD相机，与所述计算部相连接，能够实时采集所述复数个孵育孔的所述灰度值，并将所述灰度值传送到所述计算部进行处理。

4.根据权利要求1所述的细菌鉴定方法，其特征在于：

其中，所述曲线生成部采用logistic四参数模型为拟合模型，并利用Lewenberg-Marquardt算法将所述浊度值与时间进行拟合从而得到所述生长曲线，

logistic四参数模型的表达式为：

$y=\frac{A_1-A_2}{1+{\left(\frac{x}{x_0}\right)}^p}+A_2$

y表示浊度值；x表示时间；A₁表示浊度值y的最小值；A₂表示浊度值y的最大值；x₀为最大生长比率点；p是浊度值增长速率参数。

5.根据权利要求4所述的细菌鉴定方法，其特征在于：

其中，所述logistic四参数模型的初始值A₁、A₂采用平均值法求得，x₀采用最小二乘法进行局部平滑线性拟合发求得。

6.根据权利要求5所述的细菌鉴定方法，其特征在于：

其中，所述待鉴定细菌的延滞期由所述x₀点的切线与时间轴相交得到的三角形求得。