CN105200096A

CN105200096A - 加工青贮生物质的方法

Info

Publication number: CN105200096A
Application number: CN201510625036.3A
Authority: CN
Inventors: J·拉森; M·Ø·海文
Original assignee: Inbicon AS
Current assignee: Inbicon AS
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2015-12-30
Also published as: EP2370589A2; US20110275131A1; BRPI0918355A2; US8187848B2; WO2010073083A2; WO2010073083A3; CN102264913A; CA2745382A1; CL2010000717A1; MY174978A

Abstract

本发明涉及用于生产生物乙醇或其他发酵产物的加工青贮生物质的方法，并且具体而言涉及无需要昂贵预处理(例如，热或化学预处理)的方法。

Description

加工青贮生物质的方法

本申请是申请日为2009年12月17日、申请号为200980152127.2、发明名称为“加工青贮生物质的方法”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明在广义上涉及用于生产生物乙醇或其他发酵产物的加工青贮生物质的方法，并且具体而言涉及无需昂贵预处理(例如，热或化学预处理)的方法。

背景技术

生物乙醇为化石燃料提供了很有前景的替代物，提供了不会造成温室效应的可再生且“碳中和(carbonneutral)”能源。在生物乙醇前体的其他可能来源中，木质纤维素生物质可被酶法水解而提供可发酵的糖。然而，由于木质纤维素复杂的化学结构，只有在对木质纤维素进行一些使得纤维素纤维易于被酶催化的预处理后才能利用现在已知的酶活性将其有效地水解。这样的预处理过程一般包括将生物质加热至高温(100-250℃)或加入化学物质。由木质纤维素生物质大规模生产生物乙醇或其他发酵产物需要大规模的预处理和加工。因此，在生产规模上降低成本或者提高生物乙醇的商业可行性的生物质加工方法受到越来越多的关注。

对木质纤维素生物乙醇的整体生产成本有重大影响的两个因素是预处理和纤维素酶成本。因此，提供降低能源成本的加工方法和改善纤维素酶效能的水解方法是有利的。

近来有报道称青贮生物质可为生物乙醇生产提供很有前景的原料。青贮主要被用作一种保藏植物材料作为动物饲料的方法。青贮物一般包括完整的采收作物(包含茎、叶和富含淀粉的谷粒)，所述完整的采收作物可被切割、压缩并在无氧条件贮存在例如地窖中。在青贮早期，自然存在的微生物的生长耗尽氧气并将可溶性糖转化为酸，从而降低pH。在大约3-5周后，青贮生物质中的pH和乳酸浓度变得恒定并且所述青贮物可被贮存直至使用。青贮会抑制其他微生物的有害生长，所述其他微生物可分解多糖并且降解综纤维素。

青贮生物质包含淀粉成分和木质纤维素成分，所述淀粉成分可被相对便宜的淀粉酶降解，所述木质纤维素成分只能被纤维素酶降解。

在本文中，发明人出人意料之外地报道，从不经耗能预处理而通过直接酶法处理水解的青贮生物质可获得合理的乙醇产量。可从初始酶法水解和/或SSF中回收所述青贮生物质的未水解组分，并且随后对其进行热预处理。

发明内容

本发明提供了在生物乙醇生产中节能且节约成本的加工青贮生物质方法。将青贮生物质不经预处理而使用淀粉酶，以及任选的淀粉酶和纤维素酶活性的结合物直接酶法水解。可从初始酶法处理中回收所述青贮生物质的未水解组分，并且随后对其进行热预处理。

附图说明

图1显示了对未经热预处理的青贮生物质的酶法处理和SSF中葡聚糖的转化率百分比。显示了用4种不同的酶/酶混合物对未经处理的玉米青贮物的预水解和SSF过程中的转化率百分比，所述四种酶/酶混合物是：3.5g/kg淀粉酶(A)、7FPU/gDM纤维素酶(C)、7FPU/gDM纤维素酶和3.5g/kg淀粉酶(A+C)以及半剂量的淀粉酶和纤维素酶——1.75g/kg淀粉酶和3.5FPU/gDM纤维素酶(1/2A+1/2C)。

图2显示了在对经热预处理的青贮生物质的酶处理和SSF中葡聚糖的转化百分比。显示了用4种不同的酶/酶混合物对经预处理的玉米青贮物的预水解和SSF过程中的转化率百分比，所述四种酶/酶混合物是：3.5g/kg淀粉酶(A)、7FPU/gDM纤维素酶(C)、7FPU/gDM纤维素酶和3.5g/kg淀粉酶(A+C)以及半剂量的淀粉酶和纤维素酶——1.75g/kg淀粉酶和3.5FPU/gDM纤维素酶(1/2A+1/2C)。

图3显示了加工青贮生物质的路线。

具体实施方式

本文使用的下列术语具有以下含义：

(i).青贮木质纤维素生物质

青贮木质纤维素生物质是指完整作物或基本完整的作物，包括茎、秆和/或叶以及富含淀粉的谷粒的任意混合物，其中全部碳水化合物成分包括大量的纤维素和半纤维素组分，并且其中全部木质素含量为5％或更多。通过在无氧条件下贮存至少3周的时间将所述生物质“青贮”。

(ii).酶法水解

酶法水解是指用酶活性以如下方式处理木质纤维素生物质：将纤维素和/或淀粉成分转化为糖。酶法水解可使用淀粉酶、纤维素酶、其他酶或它们的混合物进行。

(iii).预处理。

预处理是指对木质纤维素生物质的操作，所述操作使得它的纤维素组分更易受将碳水化合物转化为可发酵糖的酶影响。预处理可以是热预处理或化学预处理。热预处理是指将生物质加热至100℃或更高温度的预处理。化学预处理是指这样的预处理，即使木质纤维素生物质暴露于所添加的化学物质(例如酸或碱)，直至剧烈度(severity)相当于加热至100℃并维持10分钟时所达到的剧烈度。术语“任何预处理之前”仅指加工步骤的顺序并且不排除随后的预处理。预处理不指青贮本身或者在青贮时引入所述生物质的任何防腐剂、细菌、酶或其他添加剂。

(iv).淀粉酶

淀粉酶是指包含α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)活性的任何酶制剂。还包含β-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶EC3.2.1.2)和/或γ-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶或“葡萄糖淀粉酶”，EC3.2.1.3)的任意组合的酶制剂可以是本文中所使用的“淀粉酶”。主要富含其他酶活性——例如纤维素酶活性——的酶制剂可含有显著的淀粉酶副活性(sideactivity)并因此可以是本文中所使用的淀粉酶。

(v).纤维素酶

术语“纤维素酶”一般是指任何一种或多种“纤维素分解酶”，包括水解纤维素聚合物的内部键，破坏晶体结构并且释放单个纤维素链的内切-β-1,4-葡聚糖酶，和从每个末端强行地水解纤维素并且释放链长为2-4个糖部分的寡聚体的外切-β-1,4-葡聚糖酶(纤维二糖水解酶)。概括性术语“纤维素酶”还指将由纤维二糖水解酶得到的产物水解为D-葡萄糖的β-葡萄糖苷酶(纤维二糖)。

(vi).有效量

这样的淀粉酶量是“有效量”，即在适于淀粉酶酶法水解的条件下，24小时内可转化青贮木质纤维素生物质的葡聚糖含量的至少15％。不同淀粉酶制剂的混合物可共同构成“有效量”。至少一种淀粉酶的“有效量”可与一种或多种纤维素酶或其他酶活性结合使用。非常有效的量是24小时内可转化青贮木质纤维素生物质的葡聚糖含量的至少20％。超级有效量是24小时内可转化青贮木质纤维素生物质的葡聚糖含量的至少25％。

(vii).干物质

干物质是指不可溶的材料。生物质的干物质含量是指所述生物质的固有特性。最终干物质含量是指在水解开始时水解和/或SSF反应混合物的不可溶固体含量。

从青贮木质纤维素生物质中生产生物乙醇的方法已有记载。参见以引用方式全文纳入本文的参考文献[1]。以前，热预处理被认为是优化来自青贮生物质的乙醇产量所必需的。

本发明人出乎意料地发现，青贮木质纤维素的淀粉成分基本上可容易地被淀粉酶完全水解，而不需要预处理。避免预处理实际上是优选的。通过避免通常出现在预处理过程中的淀粉损失，提高了由淀粉成分得到的可发酵糖的最终产率。

本发明人还发现，青贮木质纤维素生物质中出乎意料高的纤维素成分部分可容易地被纤维素酶水解，而不需要预处理。

因此，本发明的一些实施方案提供了在生物乙醇生产中加工青贮生物质的方法，所述方法无需消耗能量和/或增加成本的预处理。

一些实施方案提供了一种加工青贮木质纤维素生物质的方法，所述方法包括

-提供青贮木质纤维素生物质，并且

-在任何预处理前用有效量的至少一种淀粉酶与一种或多种纤维素酶对所述青贮生物质进行酶法水解。

在优选的实施方案中，酶法水解完全或部分地作为同时糖化和发酵(SSF)的过程来进行。

其他实施方案还提供其他步骤：

-在酶法水解之后从所述青贮生物质中回收未水解的材料，并且

-将所述未水解的材料在110-250℃下进行热预处理。

任何合适的原料都可用于实施本发明的方法，所述原料包括苜蓿、禾本科植物(grasses)、空果篮(emptyfruitbaskets)、豆科植物(legumes)、玉米、甘蔗、高粱(sorghum)、黑麦、小麦、大麦、黑小麦、稻和其他植物。优选的原料具有至少40％，最优选至少50％的葡聚糖含量(即，淀粉和纤维素的总含量)。优选原料的葡聚糖成分包含至少30％的淀粉，更优选至少40％的淀粉，或更优选至少50％淀粉。

在优选的实施方案中，在青贮前，将生物质通过机械或其他方式来预加工，所述方式包括但不局限于砍(chopping)、剪(cutting)、磨(milling)、切(slicing)或将所述生物质分成部分并减小颗粒大小的任何合适方法。青贮生物质可贮存在田里、地窖中、任何合适的围场(enclosure)中或者以基本上阻止对所述生物质的有害微生物降解的任何方式贮存。在优选的实施方案中，生物质被青贮至少5周。在一些实施方案中，生物质可在成熟的最佳阶段被采收并且使用本领域已知的任何方法来青贮，所述方法包括但不局限于在参考文献[2]和/或[3]中描述的方法，其以引用的方式全本纳入本文。

在优选的实施方案中，合适的青贮生物质的生产规模量将被用于实施本发明的方法。本发明的方法优选使用至少500kg、更优选至少1000kg青贮生物质、更优选至少5000kg、还更优选至少10000kg青贮生物质实施。

合适的青贮生物质的干物质含量可以为超过20％，或者甚至更优选地超过30％。

任何合适的淀粉酶均可用于实施本发明的实施方案。在优选的实施方案中，使用包含α-淀粉酶和γ-淀粉酶混合物的酶制剂。

富含α-淀粉酶的合适制品可包括市售的制品，包括NS50033^TM、Novozymes。或者，可通过本领域熟知的方法从微生物中制备α-淀粉酶，所述微生物包括通常的嗜热杆菌(Bacillus)菌株、枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)、木霉属(Trichoderma)菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和其他合适的来源。

对于给定的包含至少一种淀粉酶的酶制品，酶法水解的合适条件通常是公知的。可向淀粉酶制品补加一定量的纤维素酶制品以增加产率。在优选的实施方案中，在同时糖化和发酵(SSF)之前，进行酶法水解作为预水解。预水解优选在合适的条件下进行至少6个小时。或者，在发酵前，可将青贮生物质充分地水解，水解程度可达到任何预处理前酶法处理所允许的程度。水解之后，或者预水解之前，可将所述水解的组分分离并发酵。随后可取出未水解的材料并对其进行热预处理，之后通过主要使用纤维素酶制品进行额外的酶法水解。或者，可在SSF后取出未水解的材料并随后对其进行热预处理，之后用纤维素酶制品进行额外的酶法水解。

实施例1：不经预处理对青贮生物质进行酶法处理和SSF。

将2007年10月从丹麦收获的完整玉米在收割机中剁碎，完全压缩并且在不加入化学物质的情况下储存在无氧环境下的青贮槽(bunkersilo)中至2008年8月。所述青贮物的干物质含量为约31％。

未经处理的玉米青贮物的组成可根据NREL标准“生物质中木质素和结构性碳水化合物的测定”来测定

“葡聚糖”是指淀粉和纤维素二者的组合物。

在酶法水解实验之前，将所述青贮物干燥2-3天(在40℃下)并且碾磨以避免由材料的不均匀性引起的实验误差。

使用4种不同的酶处理来评估所述“未经处理”(即，没有进行热预处理)的青贮物的酶法水解：

(C):7FPU/gDM的纤维素酶(CELLUCLAST^TM和NOVOZYMES188^TM的结合物，以5:1的体积比混合)；

(A):3.5g/kgDM的淀粉酶(NS50033^TM,Novozymes)；

(A+C):淀粉酶和纤维素酶的混合物；7FPU/gDM的纤维素酶(CELLUCLAST^TM和NOVOZYMES188^TM的结合物，以5:1的体积比混合)和3.5g/kgDM的淀粉酶(NS50033^TM,Novozymes)；以及

(1/2A+1/2C):淀粉酶和纤维素酶的混合物，其中各个酶均为半剂量；3.5FPU/gDM的纤维素酶(CELLUCLAST^TM和NOVOZYMES188^TM的结合物，以5:1的体积比混合)和1.75g/kgDM的淀粉酶(NS50033^TM,Novozymes)。

纤维素向乙醇的转化以％转换率来确定，％转换率从SSF过程中的重量损失来计算，并且在预处理后且在SSF结束时通过HPLC分析来确认。

所有实验都通过将经干躁且碾磨的玉米青贮物在100ml蓝盖瓶中用总共60g的0.1M乙酸钠缓冲液(pH＝5.0)稀释至5％的最终干物质含量(不溶固体物)进行。将CELLUCLAST^TM和NOVOZYMES188^TM以5:1(v/v)混合并且稀释在0.1M乙酸钠缓冲液中，加入之前是NS50033^TM(Novozymes，冷淀粉糖化酶，最适温度是约50℃)。

将所有样本在50℃和250rpm下在震荡孵育箱中预处理6小时。6小时后，将所述瓶冷却至约33℃并加入面包酵母(1g/kg的最终干物质含量，THERMOSACCDRY^TM，EthanolTechnology)。在33℃和250rpm下，将SSF在震荡孵育箱中连续进行144h。

所述4种酶处理的每一种的结果均在图1中显示。如图所示，单独用淀粉酶进行酶法处理足以转化葡聚糖含量的56％。这表明，青贮葡聚糖成分中的淀粉组分在不经预处理的情况下也易于被淀粉酶水解。此外，这些结果表明总葡聚糖含量在整体上是约31％淀粉。

仅使用纤维素酶的水解和SSF比仅使用淀粉酶得到了稍微更大的转化率(61％)。这可能是因为纤维素酶能够转化部分的纤维素成分，并且同时还具有较大的淀粉酶副活性。以前用不同类型的未经预处理的生物质的实验已经表明，所述材料中12-25％的葡聚糖在不经预处理的情况下能被转化为乙醇。当同时加入纤维素酶和淀粉酶时，在完全剂量下得到了约74％的葡聚糖转化率，在使用半剂量的所述酶时得到了约72％的转化率。

实施例2：先经过热预处理的青贮生物质的酶处理和SSF。

将2007年10月从丹麦收获的完整玉米在收割机中剁碎，完全压缩并且在不加入化学物质的情况下储存在无氧环境下的青贮槽中至2008年8月。所述青贮物的干物质含量为约31％。

将碾磨的青贮物在190℃下蒸汽预处理12分钟。

经预处理的玉米青贮物的组成可根据NREL标准“生物质中木质素和结构碳水化合物的测定”来测定

所述热预处理的青贮物的酶水解和SSF如实施例1所述进行。

4种酶处理的每一种的结果均在图2中显示。如图所示，单独的淀粉酶实验中转化率只有约45％。这表明淀粉含量在预处理后减少了，可能是因为预处理过程中的降解或者是由于冲洗除去了淀粉。图2还显示，仅使用纤维素酶的水解和SSF获得约85％的转化率，使用淀粉酶和纤维素酶的结合物获得约87％的转化率，而使用半剂量的纤维素酶和淀粉酶获得约83％的转化率。这表明需要预处理使纤维素转化率超过80％。但是，根据预处理参数，这可能会导致淀粉的某种程度的降解和冲走。这些实验表明，青贮物的预处理是浪费的，因为淀粉和一部分纤维素在不经预处理的情况下也易于被酶法水解，并且因为一些糖可在预处理过程中被溶解或降解。很明显有利的是，组织对青贮生物质的加工，使得容易处理的糖不经预处理而被代谢。在以高最终干物质含量进行水解和发酵后，可从所述发酵混合物中蒸馏出乙醇。可将获自蒸馏的固体级分分离并随后预处理，以制备易于酶法水解的纤维素残余物。

实施例3.理论生物乙醇加工产率包括直接酶水解和SSF以及随后对残余材料的预处理。

图3显示了加工青贮的玉米青贮物或其他青贮的生物质成为乙醇的路线。根据WO2006/056838描述的方法，首先将青贮物在高最终干物质含量(不溶性固体物)下不经预处理而通过液化进行加工，WO2006/056838以引用的方式全文纳入本文。在高最终干物质含量下，在单个容器的发酵液中发酵和/或SSF能产生大于4％(w/w)的乙醇产率，同时无需积累数个发酵批次的加工蒸汽(这是使用低干物质水解和发酵时所必需的)。

将未经预处理的青贮物液化并发酵(首次发酵)。将乙醇蒸馏并收集C5级分。从所述蒸馏的混合物中得到不溶性固体物级分并随后对其预处理，优选热预处理。随后将该经预处理的未水解材料液化并发酵(第二次发酵)。

图3中显示的加工产率可从实施例1和2中所示的结果来计算：

所述水解和/或SSF混合物的最终干物质含量和乙醇终产率之间的关系可根据方程式1容易地计算：

Eq.1:

％Et＝

(1kg*(X)*(％葡聚糖)*(％转化率)*(1.1)*(理论产率))/

(1kg-(1kg*(X)*(％葡聚糖)*(％转化率)*(1.1)*(理论产率))

其中

％Et＝kg乙醇/kg总量

X＝kgDM/kg总量(即最终干物质含量)

％葡聚糖＝kg葡聚糖/kgDM

％转化率＝kg游离葡聚糖/kg总葡聚糖

1.1＝kgC6糖/kg游离葡聚糖

理论产率＝0.51kg乙醇/kg糖

其中所述首次发酵使用仅以淀粉酶处理水解的青贮物，所述淀粉酶没有明显的纤维素酶活性，仅淀粉转化为乙醇。在这种情况下，达到至少4％(w/w)的乙醇终浓度时需要至少22％的最终干物质含量：

当所述首次发酵使用通过淀粉酶和纤维素酶二者水解的青贮物时，达到至少4％的乙醇浓度时需要至少18％的最终干物质含量：

对于第二次发酵，如实施例2所报道，认为有5％的葡聚糖损失和85％的葡聚糖转化率。如果在所述首次发酵过程中仅淀粉被转化，那么所述纤维残余物的理论葡聚糖(纤维素)含量为(干物质的36％)*(剩余95％葡聚糖)＝干物质的34.2％。在这种情况下，在所述第二次发酵中达到至少4％的乙醇浓度时需要至少24％的最终干物质含量：

表1显示了对图3中所述加工的质量平衡的估算，其中在所述首次发酵中得到了56％(仅淀粉酶)或70％(淀粉酶加纤维素酶)的转化率，随后是30％的最终干物质含量下对残余物的水解和第二次发酵。如果将所述玉米青贮物在30％的最终干物质含量下用淀粉酶和纤维素酶二者处理并发酵(不经水稀释)，可得到约7.5％的乙醇浓度，纤维素酶和淀粉酶二者处理的转化率为约70％。如果仅使用淀粉酶，可以得到约6％的乙醇浓度，葡聚糖转化率为56％。在所述首次发酵后，最大约600kg的未水解残余物将仍含有(每吨加入所述过程的干物质)约160kg的纤维素(转化率70％)。所述残余物估算是最大值，因为在所述首次发酵过程中可能出现半纤维素的一些降解和溶解。所述第二次发酵前的残余物将包含最少27％的纤维素。

如果将该残余物预处理(预处理后95％的葡聚糖产量)并稀释至30％干物质，那么在所述第二次发酵中可能以完全转化率得到4.7至6.2％的乙醇。

表1：对首次发酵中分别为56％和70％分解的过程进行的质量平衡估算。估算是基于1000kg干物质，对应于3100kg玉米青贮物。

以上的实施例和描述提供了具体实施方案的代表性实例，不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求限定。

参考文献

1.M.Thomsenetal.，“Pretreatmentofwholecropharvested，ensiledcornforethanolproduction，”Appl.Biochem.Biotechnol.(2008)148(1-3)：23.

2.Z.WeinbergandG.Ashbell，”Engineeringaspectsofensiling，”BiochemicalEngineeringJournal(2003)，13：18.

3.E.Charmley，“Towardsimprovedsilagequality，”CanadianJournalofAnimalScience(2001)，81(2)：157.

Claims

1.一种加工青贮木质纤维素生物质的方法，所述方法包括

-提供青贮木质纤维素生物质，并且

-在任何预处理前，用有效量的至少一种淀粉酶与一种或多种纤维素酶对所述青贮木质纤维素生物质进行酶法水解，所述淀粉酶量足以在24小时内转化葡聚糖含量的至少15％。

2.权利要求1的方法，还包括步骤

-从所述水解的生物质中回收未水解的材料，并且

-对所述未水解的材料在110-250℃下进行热预处理。

3.权利要求2的方法，还包括步骤

-对所述回收的、未水解的且经预处理材料进行酶法水解并发酵。

4.权利要求1的方法，其中所述青贮生物质有至少500kg。

5.权利要求1的方法，其中所述青贮生物质的最终干物质含量在酶法水解开始时为至少20％。

6.权利要求1的方法，其中所述至少一种淀粉酶制剂包含至少α-淀粉酶和γ-淀粉酶的混合物。

7.权利要求1的方法，其中所述酶法水解是作为预水解进行的，随后进行SSF。

8.权利要求1的方法，其中在至少144小时SSF后的葡聚糖转化率为至少55％。

9.权利要求1的方法，其中所述至少一种淀粉酶量为足以在24小时内转化葡聚糖含量的至少25％的超级有效量。

10.权利要求1的方法，其中所述发酵完全或部分地作为SSF过程进行。

11.权利要求1的方法，其中所述生物质包括以下的任一种：苜蓿、禾本科植物、空果篮、豆科植物、玉米、甘蔗、高粱、黑麦、小麦、大麦、黑小麦和稻。

12.权利要求1的方法，其中在青贮前，通过机械或其他方式来预加工所述生物质，所述方式包括砍、剪、磨和切的任一种。

13.权利要求1的方法，其中所述淀粉酶包括从任何嗜热杆菌(Bacillus)菌株、枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)、木霉属(Trichoderma)菌株或烟曲霉(Aspergillusfumigatus)制备的α-淀粉酶制品。

14.权利要求1的方法，其中所述生物质为在成熟的最佳阶段采收。

15.权利要求1的方法，其中所述生物质为在田里或地窖中青贮。