CN105198782A - 萝卜种子中莱菔素的提取和分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了萝卜种子中莱菔素的提取和分离纯化方法。研究了萝卜种子中莱菔素的提取及薄层层析分离纯化方法。萝卜种子粉碎脱脂，脱脂残渣加水酶解1h，酶解温度25℃，酶解环境pH？7.0，液固比为20:1，提取时间5min，提取温度25℃，得到莱菔素粗提取。以硅胶G做固定相，正己烷-乙醇(8:2:0.5)为流动相，分离纯化莱菔素粗提物，莱菔素的纯度可达为98.9％。
Description
技术领域
本发明涉及莱菔素提取和纯化技术，具体涉及萝卜种子中莱菔素的提取和分离纯化方法。
背景技术
流行病学研究表明，经常食用十字花科植物，如萝卜、西兰花、白菜、花菜等，可以降低患癌症和心血管疾病的风险，与这些植物中富含硫苷、多酚有很大关。植物中的硫苷存在于植物细胞的液泡中，相对比较稳定，植物被研磨或切碎时，硫苷就会与硫苷酶接触，发生酶解反应，生成异硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈等反应产物。异硫氰酸酯具有很高的生物学活性，能够有效地防止饮食中多种致癌物包括多环芳烃、杂环胺和亚硝胺所引起的DNA损伤和癌症，还具有杀菌、抑制血小板聚集等作用。许多研究表明，西兰花中的莱菔硫烷是最重要的抗癌物质之一。
莱菔素是目前蔬菜中发现的抗癌活性最强的植物活性成分。主要存在于十字花科植物萝卜的干燥成熟的种子中。生物实验证明,莱菔素具有抗肿瘤、解毒抗菌、抗氧化的作用，对肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前胃癌有明显的阻断作用。近些年来，存在于萝卜种子中的莱菔素的生物活性逐渐被人们重视。莱菔素，又称萝卜子素，在萝卜种子中含量丰富，能有效抑制癌细胞的生长，诱导白血病癌细胞的死亡，莱菔素与莱菔硫烷相比，在烃基链上有不饱和键，被发现比莱菔硫烷的活性强1.3–1.5倍，它可能成为今后保健品及医药领域研究和开发的又一新方向。
现有技术中，针对莱菔素的提取存在提取工艺复杂，以及提取纯度过低等问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了萝卜种子中莱菔素的提取和分离纯化方法。研究了萝卜种子中莱菔素的提取及薄层层析分离纯化方法，为萝卜种子中的莱菔素的开发利用提供依据。
本发明的进一步改进包括：萝卜种子中莱菔素的提取方法，依次包括以下步骤：选取萝卜种子，冷冻干燥，粉碎，萝卜种子脱脂，残渣酶解，溶剂提取和旋转蒸发后得到莱菔素粗提物。
本发明的进一步改进包括：
所述的萝卜种子脱脂是将冷冻干燥的萝卜种子用药物粉碎机粉碎，采用索氏提取法，乙醚为溶剂抽提萝卜种子中的油脂，脱脂残渣备用。
所述的脱脂残渣加1倍量蒸馏水，调节酶解体系pH3-7，封口，摇床中酶解0.5-8h。
所述溶剂提取包括：于酶解产物内加20倍二氯甲烷，封口，在20-25℃，250r/min环境下摇床5min，10000r/min冷冻离心5min，取二氯甲烷层，相同方法再提取2次，合并三次提取液，旋转蒸发，浓缩液体至原残渣质量的20倍体积，保存于-20℃环境下。
所述的酶解时间为1h，酶解温度25℃，酶解PH值7。
所述的溶剂提取中的提取溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷。
所述的溶剂提取时间为3-10min，固液比为1:20-40，提取温度20-30℃。
本发明的另一目的在于提供分离纯上述任一项所述方法制得的莱菔素粗提物的方法，用硅胶G做固定相，二氯甲烷、三氯甲烷、以体积比8:2的正己烷-乙醇混合液或以体积比8:2:0.5的正己烷-乙醇-水混合液为流动相，TLC分离纯化莱菔素粗提物。
本发明的还提供了按照上述提取和纯化方法得到的莱菔素。
本发明提取工艺简单，提取纯度高，通过进一步的纯化能够得到莱菔素的纯可达到98.9％
附图说明
图1是酶解时间对莱菔素含量的影响。
图2是酶解温度对莱菔素含量的影响。
图3是酶解PH值对莱菔素含量的影响。
图4是提取时间对莱菔素含量的影响。
图5是固液比对莱菔素含量的影响。
图6是提取温度对莱菔素含量的影响。
图7是以体积比正8:2的己烷-乙醇混合液层析分离得到的莱菔素气相色谱图。
图8是以体积比正8:2：0.5的正己烷-乙醇-水混合液层析分离得到的莱菔素气相色谱图。
具体实施方式
下面实施例对本发明做详细说明。
1材料与仪器
白萝卜种子，韩国种子公司；莱菔素标品，Sigma公司；磷酸二氢钠、柠檬酸、二氯甲烷和其他试剂均为国产分析纯试剂。
冷冻离心机：上海医分仪器制造有限公司)；TraceDSQ气质联用仪：美国Finnigan公司)；RE-5299旋转蒸发仪：河南智诚科技发展有限公司；药物粉碎机：武义县屹立工具有限公司。
2实验方法
2.1莱菔素提取工艺流程
萝卜种子→冷冻干燥→粉碎→脱脂→残渣酶解→溶剂提取→旋转蒸发→莱菔素粗提物
2.2萝卜种子脱脂方法
冷冻干燥的萝卜种子，用药物粉碎机粉碎，采用索氏提取法，乙醚为溶剂抽提萝卜种子中的油脂，计算种子油脂含量，残渣备用。
2.3脱脂残渣酶解方法
2.3.1单因素试验
脱脂残渣加1倍量蒸馏水，调节不同的酶解体系pH，封口，不同温度的摇床中分别酶解不同的时间，加20倍二氯甲烷，封口，摇床(25℃，250r/min)5min，冷冻离心5min(10000r/min)，取二氯甲烷层。相同方法再提取2次，合并三次提取液，旋转蒸发，浓缩液体至原残渣质量的20倍体积，保存于-20℃，用于测定莱菔素含量。
2.3.2脱脂残渣酶解正交试验
在单因素试验的基础上，以主要影响酶解条件的时间、温度、pH为因素，采用三因素三水平正交试验，优化脱脂残渣酶解条件。
2.4莱菔素提取方法
2.4.1莱菔素提取单因素试验
选择不同的溶剂、液固比、提取时间及温度提取酶解后残渣中的莱菔素，保存于-20℃，用于测定莱菔素含量。
2.4.2莱菔素提取试验设计
在单因素试验的基础上，以液固比，提取时间、温度为因素，采用三因素三水平正交试验，优化莱菔素提取条件。
2.4.4验证试验
在优化的酶解条件及提取条件下提取残渣中的莱菔素，用于薄层分离，并按下公式计算提取萝卜种子中莱菔素的产率。
莱菔素产率％＝残渣中莱菔素的含量×(1—种子油脂含量％)
2.5莱菔素TLC分离纯化
2.5.1薄层板的制备
采用湿法制板，硅胶G厚度0.5mm，室温晾干，于105℃的烘箱中活化1h，干燥器中保存备用。
2.5.2最佳展开剂选择
距离薄层边缘1㎝处，用移液枪点样10μL，冷风吹干，选用不同的展开剂分离提取液中的物质，取出薄层板，电吹风冷风吹干后放入碘蒸汽中显色。观察色斑分离情况，以分离的斑点多且好、不拖尾的展开剂为最佳展开剂。
2.5.2莱菔素单体制备
制备0.5mm厚的20cm×20cm大小的硅胶薄板20块，用移液枪在薄板上成直线拉点点样，每次10μL。将点样板展层，小心刮下含莱菔素的色带(对照标品显色薄板)，并用二氯甲烷溶解，冷冻离心，取上清液，用于莱菔素的鉴定与分析。
2.5.3莱菔素的鉴定与纯度分析
参考文献(具体文献名称是什么)的方法鉴定与测定莱菔素含量及纯度。
3结果与分析
3.1萝卜种子中油脂含量
采用抽脂后恒重残渣的方法计算萝卜种子中油脂的含量，平均结果为33.1％。
3.2残渣酶解试验
3.2.1单因素试验
3.2.1.1酶解时间对莱菔素含量的影响
脱脂残渣加1倍量蒸馏水，封口，摇床(25℃，100r/min)中分别酶解0-10h，取出，加20倍二氯甲烷，封口，摇床(25℃，250r/min)5min，冷冻离心5min(10000r/min)，取二氯甲烷层。其余操作同2.3.1。试验结果见图1。可以看出，随酶解时间的延长，莱菔素含量逐渐增加，但酶解时间超过1h，莱菔素的量反而逐渐减少，最高含量的酶解时间是1h。其中的原因应该是1h酶解过程已经完成，所以莱菔素含量最高；随着放置时间的延长，由于莱菔素热稳定性差，且具有挥发性，使得莱菔素的含量逐渐减少。结果见图1.
3.2.1.2酶解温度对莱菔素含量的影响
在20～60℃下酶解1h提取莱菔素。其余操作同2.3.1。绝大多数植物中酶的活性温度在50～60℃，但由图2知，25℃提取的莱菔素含量最高。其中的原因可能是25℃是黑芥子酶最佳的活性温度，或者黑芥子酶活性温度接近50～60℃，但由于莱菔素的稳定性差，致使提取率低。结果见图2.
3.2.1.3酶解pH对莱菔素含量的影响
用磷酸-柠檬酸缓冲液调节反应体系pH分别为3.0，5.0，7.0，9.0，25℃下酶解1h。其余操作同2.3.1。结果见图3。环境pH过高和过低对酶解过程都不利，pH5时莱菔素的含量最大，pH大于5，随pH的增高，莱菔素含量急剧下降。结果见图3。
3.2.2正交试验
残渣酶解正交试验设计的因素水平及试验结果见表1。由直观结果知，试验号5即酶解时间1h、酶解温度25℃、酶解pH为7的条件下莱菔素含量最高，由正交试验结果分析酶解时间1h、酶解温度25℃、酶解pH为5的条件下莱菔素含量最高。为了简化操作程序，我们选择酶解时间1h、酶解温度25℃、酶解pH7即不调整环境pH为残渣最佳酶解条件。由极差分析知，酶解时间是残渣酶解的关键因素，其次是酶解温度，环境pH对莱菔素含量影响不大。经方差分析，酶解时间与酶解温度对莱菔素含量影响显著，酶解pH影响不显著。
表1残渣酶解正交试验设计及试验结果
3.3莱菔素提取试验
3.3.1莱菔素提取单因素试验
3.3.1.1提取溶剂对莱菔素含量的影响
最佳酶解条件下，20倍不同的溶剂提取莱菔素。试验结果见表2。三氯甲烷与二氯甲烷做溶剂提取的莱菔素含量较高，其余三种溶剂效果较差；三氯甲烷比二氯甲烷的效果稍好，差异不显著。由于三氯甲烷的毒性大、沸点高，对油脂的安全性影响大，以及油脂和溶剂分离的难度增加，我们选择二氯甲烷做提取溶剂。
表2提取溶剂对莱菔素含量的影响
3.3.1.2提取时间对莱菔素含量的影响
操作同2.3.1，以二氯甲烷为溶剂，提取时间分别设置为1～30min。试验结果见图4。随提取时间的延长，莱菔素含量先逐渐增加，而后又减少，提取时间在5分钟时含量最大。其中的原因应该与莱菔素的稳定性有关。结果见图4。
3.3.1.3液固比对莱菔素含量的影响
溶剂与残渣的比例(mL/g)分别设置为5:1、10:1、20:1、30:1、40:1提取莱菔素。由图5看出，液固比为20:1莱菔素含量最高。
3.3.1.4提取温度对莱菔素含量的影响
由图6知，温度为25℃莱菔素含量最高。一般来说，提取温度越高，物质在溶剂中的溶解度越大，莱菔素的含量应该越高，但由于莱菔素的热稳定性差，所以随提取温度的提高，莱菔素含量反而降低；60℃对莱菔素的稳定性影响最大。
3.3.2莱菔素提取试验设计与结果
莱菔素提取正交试验设计的因素水平及试验结果见表3。直观及结果分析都表明液固比30:1、提取温度25℃、提取时间5min的条件下提取的莱菔素含量高。经方差分析液固比20:1与30:1对莱菔素含量的影响差异不显著，我们选择液固比20:1、提取温度25℃、提取时间5min为最佳提取条件。由极差分析知，液固比是影响莱菔素含量的关键因素，其次是提取温度，提取时间对莱菔素含量影响不大。
表3莱菔素提取试验设计及试验结果
3.4验证试验结果
在最优的酶解条件下及最佳提取条件下提取脱脂残渣中的莱菔素5次，结果见表4，表明莱菔素含量高且稳定性好，莱菔素的平均含量为34.9156mg/10g，按2.1.4中公式计算，萝卜种子中莱菔素的提取产率为23.3588mg/10g。
表4验证实验结果
3.5莱菔素的TLC分离纯化
3.5.1展开剂对莱菔素粗提物分离效果的影响
3.5.1.1单一展开剂对莱菔素粗提物分离效果的影响
表5单一展开剂中莱菔素粗提物的GTLC层析分离效果
由表5知，正己烷作展开剂时，样点几乎不移动，可知其极性太小；二氯甲烷呈现三个黄色斑点，其中Rf1点大且颜色深；三氯甲烷分离出的两个黄色斑中，Rf1点大且颜色深；乙酸乙酯和正丁醇极性较大，几乎使样点移至终止线，所以单一的正己烷、乙酸乙酯、正丁醇分离效果差。比较而言，二氯甲烷、三氯甲烷作展开剂分离效果稍好。
3.5.1.2二元混合展开剂对莱菔素粗提物分离效果的影响
表6二元混合展开剂中莱菔素粗提物的TLC层析分离效果
根据单一展开剂的试验结果，选择极性适中的溶剂作为混合展开剂，二元展开剂的分离效果如表6。三氯甲烷-甲醇(9:1)和三氯甲烷-甲醇(93：7)及正己烷-乙醇(8:2)时分离效果好，都出现了4个斑点。三氯甲烷-甲醇(9:1)、三氯甲烷-甲醇(93：7)、正己烷-乙醇(8:2)的Rf值分别为0.86、0.78、0.43的点颜色深而且面积大，与标品的Rf对比判断，它们可能为含莱菔素的点。由于Rf值偏大、三氯甲烷和甲醇的毒性分别比正己烷和乙醇的毒性大，所以我们选择正己烷-乙醇(8:2)作为薄层分离的混合展开剂。
3.5.1.3三元混合展开剂对莱菔素粗提物分离效果的影响
根据单一和二元展开剂的试验结果，选择极性适中的溶剂作为三元混合展开剂，三元展开剂的分离效果如表7。可以看出正己烷-乙醇-水(8:2:0.5)做展开剂分离的效果好。与标品的Rf对比判断，Rf3可能为含莱菔素的点。
表7三元混合展开剂中莱菔素粗提物的TLC层析分离效果
3.5.2莱菔素单体的气相色谱图鉴定
按2.5.2方法将展开剂为正己烷-乙醇(8:2)、正己烷-乙醇-水(8:2:0.5)层析分离的Rf3的条带制成二氯甲烷的澄清液，用于莱菔素单体的鉴定及纯度分析。结果如图7和图8。看出，层析分离物中在12min时都有一个吸收高峰，经质谱离子特征图分析，它们与标品莱菔素的出峰时间及离子特征图几乎完全吻合，可以断定在12min时出现的物质就是莱菔素；通过面积归一法分析，展开剂为正己烷-乙醇(8:2)、正己烷-乙醇-水(8:2:0.5)的层析分离物中莱菔素的含量分别为85.9％和98.9％。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.萝卜种子中莱菔素的提取方法，其特征在于，依次包括以下步骤：选取萝卜种子，冷冻干燥，粉碎，萝卜种子脱脂，残渣酶解，溶剂提取和旋转蒸发后得到莱菔素粗提物。
2.根据权利要求1所述的萝卜种子中莱菔素的提取方法，其特征在于，所述的萝卜种子脱脂是将冷冻干燥的萝卜种子用药物粉碎机粉碎，采用索氏提取法，乙醚为溶剂抽提萝卜种子中的油脂，脱脂残渣备用。
3.根据权利要求2所述的萝卜种子中莱菔素的提取方法，其特征在于，所述的脱脂残渣加1倍量蒸馏水，调节酶解体系pH3-7，封口，摇床中酶解0.5-8h。
4.根据权利要求1所述的萝卜种子中莱菔素的提取方法，其特征在于，所述溶剂提取包括：于酶解产物内加20倍二氯甲烷，封口，在20-25℃，250r/min环境下摇床5min，10000r/min冷冻离心5min，取二氯甲烷层，相同方法再提取2次，合并三次提取液，旋转蒸发，浓缩液体至原残渣质量的20倍体积，保存于-20℃环境下。
5.根据权利要求3所述的萝卜种子中莱菔素的提取方法，其特征在于，所述的酶解时间为1h，酶解温度25℃，酶解PH值7。
6.根据权利要求1所述的萝卜种子中莱菔素的提取方法，其特征在于，所述的溶剂提取中的提取溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的萝卜种子中莱菔素的提取方法，其特征在于，所述的溶剂提取时间为3-10min，固液比为1:20-40，提取温度20-30℃。
8.分离纯化如权利要求1-7任一项所述方法制得的莱菔素粗提物的方法，其特征在于，用硅胶G做固定相，二氯甲烷、三氯甲烷、以体积比8:2的正己烷-乙醇混合液或以体积比8:2:0.5的正己烷-乙醇-水混合液为流动相，TLC分离纯化莱菔素粗提物。
9.一种莱菔素，其特征在于，按照权利要求1-7任一项方法提取的莱菔素。
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