CN105193519A - 一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，以小鼠股动静脉为蒂的腹部皮瓣转移至另一只小鼠的颈部，利用血管套管(cuff)技术将股动脉与颈总动脉连接，将股静脉与颈外静脉连接；本发明的目的在于提供一种操作简便，可重复性好，成功率高的小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，可用于研究临床血管化皮肤移植排斥机理及诱导免疫耐受机理的动物模型。

Description

一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法

技术领域

本发明属于医学动物模型技术领域，具体涉及一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法。

背景技术

1943年，Medawar第一次构建了小鼠同种异体皮肤移植模型，并且揭示了自体皮肤移植不会发生排斥，而异体皮肤移植将会发生排斥的基本规律。皮肤移植模型的建立，为现代移植学的发展奠定了基础，具有重要意义。近年来，临床手移植、脸移植、腹壁移植和阴茎移植等含有皮肤的移植物迅速推广，但由于皮肤的高免疫原性，患者仍需要较高剂量的免疫抑制剂。小鼠皮肤移植模型建立已接近70年，但皮肤移植排斥的机理仍不完全清楚，因此，合适皮肤移植模型对于进一步研究皮肤排斥机理至关重要。

传统的皮肤移植模型将一只小鼠躯干或尾部的全厚皮肤移植到另一只小鼠侧胸壁或者背部的创面。这种方法虽然耗时短，但是移植后的皮肤往往需要48-72h才能与创面建立血运连接，在这过程中，移植皮肤经历了较长时间的缺血损伤，这可能会影响对移植物最后的转归。因此，利用显微外科技术，建立带血管蒂的皮肤移植能很好的避免移植皮肤的缺血时间，能更好的模拟临床带皮肤移植物的排斥模式。虽然大鼠血管化的皮瓣是一个很常见动物模型，但是相比而言，小鼠具有很多优点，不仅试剂丰富廉价、可选品系众多，实验及饲养耗费更低，而且基因操控性更好，有大量的转基因及基因敲出品系可供机制研究。阻碍小鼠血管化皮肤移植模型建立最主要的障碍是小鼠的股动静脉血管内径过短(0.2-0.4mm)，采用传统的血管缝合方法成功率低，操作困难。目前，仅有一篇文献报道小鼠血管化皮肤移植，他们采用了股动脉端端吻合，股静脉端侧吻合的方式建立了小鼠血管化腹部皮瓣移植。然而这种方式耗时长，手术难度大，移植物成功率低。因此，目前仍急切需要构建简便的血管化皮肤移植模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便，可重复性好，成功率高的小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，可用于研究临床血管化皮肤移植排斥机理及诱导免疫耐受机理的动物模型。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，以小鼠股动静脉为蒂的腹部皮瓣转移至另一只小鼠的颈部，利用血管套管(cuff)技术将股动脉与颈总动脉连接，将股静脉与颈外静脉连接。

一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，具体步骤如下：

第一步：麻醉小鼠，对小鼠下腹部区域进行备皮，将小鼠四肢固定，标记腹部皮瓣范围，碘伏或酒精消毒；

具体要求：适度麻醉，备皮不可用对皮肤有损伤的化学试剂，皮瓣设计要合理。

具体操作：腹腔注射麻醉；

利用动物剪毛器小心去除小鼠下腹部毛发，注意不要损伤皮肤；备皮完成后，将小鼠固定于泡沫塑料板上，在左或者右下三分之一腹部标记出皮瓣切取范围，大小约为2×2cm或2×3cm，一侧皮瓣切取范围不应过中线；碘伏或酒精消毒皮瓣及周围，铺无菌巾；

第二步：切取皮瓣，分离出皮瓣下方的股动静脉，保护腹壁浅动静脉；

具体要求：皮瓣切取时周围止血要彻底，分离血管时要去除血管周围脂肪组织，并结扎股动静脉周围小分支，但不能损伤血管；

具体操作：沿腹部切口切开小鼠表皮及真皮，利用微电凝沿切口结扎皮下小血管分支；将整个皮瓣掀起后可见供应腹部的皮瓣的腹壁浅动静脉，它们发自股动静脉；紧贴腹壁浅动静脉分支远端结扎股动静脉；小心分离股动静脉，利用微电凝结扎股动静脉其余小分支；分离完成后靠近心端结扎股动静脉，利用11-0尼龙线缝牵引线，离断股动静脉；由此获得由股动静脉供血的小鼠腹部游离皮瓣；

第三步：准备血管套管(cuff)，将供体皮瓣股动静脉分别安置合适型号的cuff管；

具体要求：cuff管为聚酰亚胺材质，内径为0.36-0.4mm，壁厚为0.25mm(RiverTechMedical,Chatanooga,Tenn)，血管需要选择合适型号的套管；

具体操作：将套管剪切成2mm小段；利用显微剪一侧插入套管管腔，横向和纵向剪开套管一半，做出套管的延伸柄；股动脉选择内径为0.36mm套管，股静脉选择内径为0.4mm套管；将股静脉的牵引线从静脉套管中穿出，牵拉使血管进入管腔；左手显微镊夹住股静脉，尽可能靠近其远端，右手用血管夹把套管柄夹住，蚊式钳夹住血管夹尾部以稳定血管夹；将股静脉残端像卷袖口那样翻转，套在套管外面，然后利用11-0尼龙线结扎固定；同样方法给股动脉放置套管；利用肝素水冲洗移植物，利用湿纱布覆盖放于-4℃冰箱保存；

第四步：受体手术准备，解剖分离颈总动脉及颈外静脉，小鼠皮瓣异位移植；

具体要求：快速、准确的解剖颈部血管，防止继发损伤，妥善放置血管蒂，防止血管蒂急性扭转；

具体操作：与供体同样的方法麻醉受体小鼠，右侧颈部利用剪毛器备皮，固定小鼠四肢，将小鼠上颚用橡皮筋固定于泡沫板；

在受体小鼠右颈部标记出同样大小的皮瓣受区(2×2cm)，移除标记的皮瓣；暴露小鼠颌下腺，分离出右侧颌下腺并予以结扎，利用微电凝结扎颈外静脉其他小分支；利用微电凝切除小鼠右侧部分胸锁乳突肌，暴露右颈总动脉，向上分离至颈内动脉分支处，利用11-0尼龙线在分支处结扎血管；利用血管夹于近心端夹闭颈外静脉，于远心端结扎并剪断颈外静脉；此时将已经获得供体皮瓣置于术区，左手持显微镊夹住股静脉套管，右手用血管夹把套管柄夹住，蚊式钳夹住血管夹尾部以稳定血管夹，然后利用显微镊将颈外静脉套于股静脉套管上，11-0尼龙线固定；同样的方法连接股动脉与颈总动脉；松开血管夹，待皮瓣充血变为粉红后6-0尼龙线缝合皮肤。

与现有技术相比，本发明产生的有益效果主要体现在：

本发明的一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，大鼠的股动静脉较粗，后肢侧肢循环丰富，利用传统的股动静脉端端吻合即可原位构建血管化皮肤移植。但小鼠血管较细，利用传统显微外科吻合方法手术难度大，小鼠死亡率高；并且由于小鼠后肢侧肢循环欠佳，后肢完全阻断股静脉易发生后肢淤血坏死。Brian等人曾采用股动脉端端吻合，股静脉端侧吻合的方式构建了小鼠原位血管化皮瓣移植，与其比较我们的模型有显著的优势：

(一)小鼠血管套管替代传统血管吻合

传统的显微外科血管吻合方法需要很长的供受体准备时间以及血管吻合时间。Brian等人在构建小鼠血管化皮肤移植时采用的是传统的显微外科吻合方法，而我们采用的是广泛运用于小鼠实体器官移植及近年来运用于小鼠复合组织移植常用的血管套管；其优势在于：①更短的供体准备时间；②更短的受体准备时间；③明显缩短了移植物热缺血时间；④动静脉吻合更加简单、迅速和容易掌握；⑤血管吻合口几乎不会渗血；⑥血管痉挛发生率更低；

(二)异位皮瓣移植取代原位皮瓣

Brian等人最早构建的方法为小鼠皮瓣的原位移植，这样虽然更加符合原来解剖，但是由于原位移植皮瓣截取了小鼠股动静脉的血供，这样所带来的手术并发症增加，成功率下降。虽然作者通过股静脉端侧吻合解决了后肢血供问题，但这增加了手术难度，延长了手术时间，增加了手术死亡率。我们采用的小鼠皮瓣颈部异位移植的优势在于：

①缩短了受体准备时间，小鼠颈外静脉及颈总动脉相隔较远，分离这两只血管要不分离股动静脉容易，而且颈部血管分支较少，血管蒂较长，为手术提供了较大便利。②显著提高了小鼠存活率，Sucher等人比较了小鼠后肢原位移植及异位移植，发现异位移植对受体创伤小，其成功率要远高于原位移植，我们的实验也发现，小鼠异位皮肤移植成功率高达90％以上。③防止术后小鼠撕咬皮瓣，异位皮瓣移植于小鼠颈部，防止了小鼠撕咬皮瓣，而原位移植发生撕咬皮瓣概率要高很多。

附图说明

图1是供体小鼠腹部皮瓣设计位置及大小；

图2是供体小鼠分离出股动静脉，图中左侧为股动脉，右侧为股静脉；

图3是小鼠血管套管过程；

图4是得到的小鼠血管化皮瓣；

图5是受体小鼠受区解剖观，图中可以看出右侧颌下腺以及胸锁乳突肌；

图6是受区解剖出颈总动脉及颈外静脉观；

图7是利用血管套管(cuff)技术将股动脉与颈总动脉连接，将股静脉与颈外静脉连接，通畅后；

图8是皮瓣缝合完成；

图9是同基因小鼠皮瓣移植第90天；

图10是小鼠异基因皮瓣移植第5天；

图11是自体或异体小鼠皮瓣移植存活生存曲线。

具体实施方式

(一)设备仪器

1.手术显微镜：1台，放大倍数5-45×；

2.普通手术器械：手术无影灯，眼科剪1把，蚊式钳1把，整形镊1把；

3.显微器械：显微剪1把，显微镊2把(尖头直径0.05mm)，显微持针器1把，显微血管夹2个；

4.耗材：无菌纱布，11-0尼龙线，6-0尼龙线，冲洗针，5ml注射器，刀片，培养皿，肝素水，生理盐水，橡皮筋，血管套管(cuff)26号、27号(RiverTechMedical,Chatanooga,Tenn)，内径分别为内径为0.4mm、0.36mm，壁厚为0.25mm；

(二)实验动物及分组

选择SPF级雄性BALB/c5只，C57BL/615只，8-12周，体重20-25g，购自第四军医大学实验动物中心。实验分为C57BL/6至C57BL/6的同基因组(n＝5)及BALB/c至C57BL/6的同种异体组(n＝5)。

(三)操作过程

1.供体小鼠术前准备

腹腔注射50mg/kg1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，必要时追加五分之一量。利用动物剪毛器小心去除小鼠下腹部毛发，注意不要损伤皮肤。备皮完成后，将小鼠固定于泡沫塑料板上，在左或者右下三分子一腹部标记出皮瓣切取范围，大小约为2×2cm或2×3cm(见图1)，一侧皮瓣切取范围不应过中线。碘伏或酒精消毒皮瓣及周围，铺无菌巾。

2.准备供体皮瓣

沿腹部标记切口切开小鼠表皮及真皮，利用微电凝沿切口结扎皮下小血管分支。将整个皮瓣掀起后可见供应腹部的皮瓣的腹壁浅动静脉，它们发自股动静脉。紧贴腹壁浅动静脉分支远端结扎股动静脉。小心分离股动静脉，利用微电凝结扎股动静脉其余小分支。分离完成后靠近心端结扎股动静脉，利用11-0尼龙线缝合牵引线，离断股动静脉。这样就获得了由股动静脉供血的小鼠腹部游离皮瓣(见图2)。

3.准备血管套管(cuff)，将供体皮瓣股动静脉分别安置合适型号的cuff管。

将套管剪切成2mm小段；利用显微剪一侧插入套管管腔，横向和纵向剪开套管一半，做出套管的延伸柄。股动脉选择内径为0.36mm套管，股静脉选择内径为0.4mm套管。将股静脉的牵引线从静脉套管中穿出，牵拉使血管进入管腔；左手显微镊夹住股静脉，尽可能靠近其远端，右手用血管夹把套管柄夹住，蚊式钳夹住血管夹尾部以稳定血管夹；将股静脉残端像卷袖口那样翻转，套在套管外面，然后利用11-0尼龙线结扎固定(见图3)；同样方法给股动脉放置套管。利用肝素水冲洗移植物，利用湿纱布覆盖放于-4℃冰箱保存(见图4)。

4.受体手术

与供体同样的方法麻醉受体小鼠，右侧颈部利用剪毛器备皮，固定小鼠四肢，将小鼠上颚用橡皮筋固定于泡沫板。

在受体小鼠右颈部标记出同样大小的皮瓣受区(2×2cm)，移除标记的皮瓣。暴露小鼠颌下腺，分离出右侧颌下腺并予以结扎(见图5)，利用微电凝结扎颈外静脉其他小分支。利用微电凝切除小鼠右侧部分胸锁乳突肌，暴露右颈总动脉，向上分离至颈内动脉分支处(见图6)，利用11-0尼龙线在分支处结扎血管。利用血管夹于近心端夹闭颈外静脉，于远心端结扎并剪断颈外静脉。此时将已经获得供体皮瓣置于术区，左手持显微镊夹住股静脉套管，右手用血管夹把套管柄夹住，蚊式钳夹住血管夹尾部以稳定血管夹，然后利用显微镊将颈外静脉套于股静脉套管上，11-0尼龙线固定。同样的方法连接股动脉与颈总动脉(见图7)。松开血管夹，待皮瓣充血变为粉红后6-0尼龙线缝合皮肤(见图8)。

(四)术后评估

1.手术时间及成功率统计

总手术时间为94.6+3.43分钟，移植物冷缺血时间为78.4+5.2分钟，手术成功率为90％(9/10)。

2.同基因及同种异体小鼠皮瓣存活情况

如图11所示，同基因小鼠皮瓣移植100％存活超过100天(见图9)，同种异体移植与第10天左右完全排斥(图10为移植后第5天)。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (2)

1.一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，其特征在于：以小鼠股动静脉为蒂的腹部皮瓣转移至另一只小鼠的颈部，利用血管套管(cuff)技术将股动脉与颈总动脉连接，将股静脉与颈外静脉连接。

2.一种小鼠血管化皮肤移植模型及其构建方法，具体步骤如下：

第一步：麻醉小鼠，对小鼠下腹部区域进行备皮，将小鼠四肢固定，标记腹部皮瓣范围，碘伏或酒精消毒；

具体要求：适度麻醉，备皮不可用对皮肤有损伤的化学试剂，皮瓣设计要合理；

具体操作：腹腔注射麻醉；

利用动物剪毛器小心去除小鼠下腹部毛发，注意不要损伤皮肤；备皮完成后，将小鼠固定于泡沫塑料板上，在左或者右下三分之一腹部标记出皮瓣切取范围，大小约为2×2cm或2×3cm，一侧皮瓣切取范围不应过中线；碘伏或酒精消毒皮瓣及周围，铺无菌巾；

第二步：切取皮瓣，分离出皮瓣下方的股动静脉，保护腹壁浅动静脉；

具体要求：皮瓣切取时周围止血要彻底，分离血管时要去除血管周围脂肪组织，并结扎股动静脉周围小分支，但不能损伤血管；

具体操作：沿腹部切口切开小鼠表皮及真皮，利用微电凝沿切口结扎皮下小血管分支；将整个皮瓣掀起后可见供应腹部的皮瓣的腹壁浅动静脉，它们发自股动静脉；紧贴腹壁浅动静脉分支远端结扎股动静脉；小心分离股动静脉，利用微电凝结扎股动静脉其余小分支；分离完成后靠近心端结扎股动静脉，利用11-0尼龙线缝牵引线，离断股动静脉；由此获得由股动静脉供血的小鼠腹部游离皮瓣；

第三步：准备血管套管(cuff)，将供体皮瓣股动静脉分别安置合适型号的cuff管；

具体要求：cuff管为聚酰亚胺材质，内径为0.36-0.4mm，壁厚为0.25mm(RiverTechMedical,Chatanooga,Tenn)，血管需要选择合适型号的套管；

具体操作：将套管剪切成2mm小段；利用显微剪一侧插入套管管腔，横向和纵向剪开套管一半，做出套管的延伸柄；股动脉选择内径为0.36mm套管，股静脉选择内径为0.4mm套管；将股静脉的牵引线从静脉套管中穿出，牵拉使血管进入管腔；左手显微镊夹住股静脉，尽可能靠近其远端，右手用血管夹把套管柄夹住，蚊式钳夹住血管夹尾部以稳定血管夹；将股静脉残端像卷袖口那样翻转，套在套管外面，然后利用11-0尼龙线结扎固定；同样方法给股动脉放置套管；利用肝素水冲洗移植物，利用湿纱布覆盖放于-4℃的冰箱保存；

第四步：受体手术准备，解剖分离颈总动脉及颈外静脉，小鼠皮瓣异位移植；

具体要求：快速、准确的解剖颈部血管，防止继发损伤，妥善放置血管蒂，防止血管蒂急性扭转；

具体操作：与供体同样的方法麻醉受体小鼠，右侧颈部利用剪毛器备皮，固定小鼠四肢，将小鼠上颚用橡皮筋固定于泡沫板；

在受体小鼠右颈部标记出同样大小的皮瓣受区(2×2cm)，移除标记的皮瓣；暴露小鼠颌下腺，分离出右侧颌下腺并予以结扎，利用微电凝结扎颈外静脉其他小分支；利用微电凝切除小鼠右侧部分胸锁乳突肌，暴露右颈总动脉，向上分离至颈内动脉分支处，利用11-0尼龙线在分支处结扎血管；利用血管夹于近心端夹闭颈外静脉，于远心端结扎并剪断颈外静脉；此时将已经获得供体皮瓣置于术区，左手持显微镊夹住股静脉套管，右手用血管夹把套管柄夹住，蚊式钳夹住血管夹尾部以稳定血管夹，然后利用显微镊将颈外静脉套于股静脉套管上，11-0尼龙线固定；同样的方法连接股动脉与颈总动脉；松开血管夹，待皮瓣充血变为粉红后6-0尼龙线缝合皮肤。