CN105185504A - 细胞磁珠流式分选装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供细胞磁珠流式分选装置。具体而言，本发明提供一种磁场发生装置，该磁场发生装置包括：磁力发生单元；用于固定所述磁力发生单元的固定装置；和放置于固定装置两端的磁力噪音消除组件；其中，所述磁力发生单元由沿着同一轴心排列的四块磁力组件构成，并由固定装置固定为两两相对，所述四块磁力组件合围，形成允许管道穿过的通道；且磁力组件中，相对的两块磁力组件的相对面的磁极都为N极，而另两块相对的磁力组件的相对面都为S极。本发明还提供一种基于本发明磁场发生装置分选细胞或分离靶分子的方法。采用本发明的装置和方法，可实现高效、可靠、高通量的细胞分选富集和靶分子的分离。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及细胞磁珠流式分选装置。
背景技术
磁珠富集或分离是一项上世纪末新兴的分子及细胞生物学技术，详见美国专利US5411863和US5385707。该技术现已广泛应用于分子生物学的核酸提取，固相cDNA文库构建，蛋白质或者细胞分选或富集。其构建原理为通过生化技术手段在微珠表面接合特异性配体或抗体。其工作原理为将表面接有配(抗)体的磁珠悬浮液与待选目标分子或者细胞溶液(悬液)混合，通过配体-受体结合反应或者抗原-抗体反应，磁珠与目的分子或细胞紧密结合，然后通过磁力捕获磁珠-目标复合体，达到富集或者纯化目标分子、细胞的目的。磁珠富集或者分选相对于其他的分离手段如离心，层析等具有很多优势，如分离速度快，量化程度高，低成本，样品无需有害或有毒化学试剂处理等。实际应用中，磁珠微粒的大小差别很大，或为微米级或为纳米级。磁珠的材料也多种多样，或为永磁材料或为顺磁材料。
磁珠分离的效率和实际应用效果实际上受制于产生捕捉磁力的分离磁场。大部分的常规分离磁场往往设计随意，没有进行精确的磁力计算和磁场设计，磁珠在这样的磁场中，往往不同的位置受到的磁作用力难以进行精确估计和控制。例如在靠近磁铁的部位，磁珠长时间暴露在高强度磁场中，磁珠发生不可逆性聚集，或丧失磁性，失去重悬浮能力等等，而远离磁铁的磁珠受到的磁场作用力微弱，沉降缓慢。传统磁力分选磁场不均匀的磁场力会造成磁珠分选整体效率和质量的下降。尤其是在处理大量样品时，这个问题尤为突出。由于近磁铁磁力过强和远磁铁磁力过弱本身的矛盾，单纯的提高或者降低磁铁的磁力强度参数并不会有任何帮助。磁珠在磁场中沿吸附力移动的速度受磁珠表面积，溶液的阻滞系数及磁场磁场强度梯度差影响，在磁珠表面积和溶液阻滞系数固定的情况下，增加磁场强度梯度差，而不是增加磁场强度，可以提高作用于磁珠的吸附力。遗憾的是，目前普遍使用的磁力分选装置或者分选器等往往并未针对磁珠分选的特性进行设计，其分选效果重复率不高，分选效果亦不理想。磁珠分选按照操作形式可以分为静态分选和流式分选两种。
静态分选(如CN201220420020.0)因受分选液容器的容量、形状等限制，对分选磁场产生装置的体积、形状有特定要求。且在分选样品量大，且分选效率要求高的情况下，往往难以满足需要。相对于静态分选，流式分选因样品流经位于分选磁场中的管路实现动态分选，更适合于高通量分选。但目前市场上的流式磁珠细胞分选(富集)仪器非常少。
EP0842704A1描述一种流过式细胞分选装置，其中包含了一种细胞磁珠分选的磁场产生装置，该装置由一对二极永磁体组成，中间包含一个分选柱，分选柱中填充硅胶质形成微孔，细胞分选液流经分选柱进行细胞分选，分选柱通过手动移出磁场的方式脱离磁场进行重悬浮。该装置由于本身微孔的设计的特点，液体流过的速度受到极大限制，细胞分选后洗涤纯化效率、分选效果不理想，且不适用于高通量分选。
US20120077267A1描述了一种流过式细胞分选装置，该装置所用磁场由多个串联式单个磁铁构成，附着有目的细胞的磁珠会吸附在靠近磁铁的一侧管壁。该磁场并没有对前述此类磁场的缺点有任何优化改进。
US20120034624A1描述一种震荡式免疫分析仪，涉及一种磁珠捕获磁场，该磁场有平行排列的多个条形磁铁构成，每个磁铁的磁极方向相同。该磁场仅仅用于捕获磁珠结合的样品，不能对捕获效率做任何保证。以上所述用于细胞磁珠分选的磁场及其发生装置由于磁场本身设计局限，无法对细胞分选的速度和效率作有效保证。本发明专为高通量流式细胞分选优化设计了一种新型高效的磁场并详述其发生装置。可广泛应用与临床及科学研究领域。
发明内容
本发明提供一种针对于细胞流式磁珠分选的分选磁场，实现高效，可靠，高通量的细胞分选富集的目的。
本发明提供一种磁场发生装置，该磁场发生装置包括：
磁力发生单元；
用于固定所述磁力组件的固定装置；和
放置于固定装置两端的磁力噪音消除组件；
其中，所述磁力发生单元由沿着同一轴心排列的四块磁力组件构成，并由固定装置固定为两两相对，所述四块磁力组件合围，形成允许管道穿过的通道；且磁力发生单元中，其中相对的两块磁力组件的相对面的磁极都为N极，而另两块相对的磁力组件的相对面都为S极。
在一个具体实施方式中，所述磁力组件为表面磁场强度为0.3－1T的磁铁。
在一个具体实施方式中，所述固定装置由四个组件组成，两两组合，分别在所述磁场发生装置的两端固定住四块磁力组件。
在一个具体实施方式中，固定装置中的所述组件设置为顶部投影为“凸”形，正面投影为“凹”形，位于磁场发生装置一端的两个组件组装后，凸出部与凹进部能相互嵌合；所述单元的凸出部设置有穿透孔和半圆形凹陷，所述穿透孔设置用于容纳并固定磁力组件，所述半圆形凹陷设置用于在两个组件组装后形成允许管道穿过的圆形通道。
在一个具体实施方式中，所述磁力噪音消除组件设置成覆盖所述磁力组件及允许管道穿过。
本发明还提供一种磁场发生装置，包括：
固定组件505、506、507和508；
磁力组件509、510、511和512；和
磁力噪音消除组件503和504；
其中，固定组件505和506通过其穿透孔固定磁力组件509和510，形成部件501，固定组件507和508通过其穿透孔固定磁力组件511和512，形成部件502；
部件501和502组装嵌合后，形成通道514；
磁力噪音消除组件503和504分别位于固定组件505与508以及506与507嵌合后形成的部件的外侧，覆盖所有磁力组件，并具有允许管道通过的中空部分。
在一个具体实施方式中，所述磁场发生装置设置成部件501和502组装嵌合后，四个磁力组件面向通道514的磁极依次是N、S、N和S。
本发明还提供一种分选细胞或分离靶分子的方法，所述方法包括使用本发明所述的磁场发生装置进行磁分离的步骤。
在一个具体实施方式中，所述方法还包括使细胞或靶分子与磁性材料孵育的步骤。
在一个具体实施方式中，所述细胞选自外周血细胞、造血细胞、神经干细胞和肿瘤细胞，所述靶分子选自蛋白质和核酸。
附图说明
图1显示磁场工作原理示意。
图2显示固定装置单体结构投影。
图3显示固定装置二联结构投影。
图4显示磁场边缘磁力噪音消除组件。
图5显示磁场发生装置分开状态。
图6显示磁场发生装置结合状态。
图7显示相邻磁极(对角线磁极相反)的磁力线方向和磁场强度。
图8显示相对磁极(对角线磁极相同)的磁力线方向和磁场强度。
图9显示相对磁极(对角线磁极相同)过磁场中心点水平方向磁场强度。
图10显示相邻磁极(对角线磁极相反)过磁场中心点水平方向磁场强度。
图11显示相对磁极(对角线磁极相同)过磁场中心点垂直方向磁场强度。
图12显示相邻磁极(对角线磁极相反)过磁场中心点垂直方向磁场强度。
图13显示相对磁极(对角线磁极相同)过磁场中线点对角线方向磁场强度。
图14显示相邻磁极(对角线磁极相反)过磁场中线点对角线方向磁场强度。
图15显示采用对照装置进行细胞磁分离后的效果。
图16显示采用本发明的磁力分选装置分选进行细胞磁分离的效果。
具体实施方式
结合图示，对本发明的工作原理和组装方式进行详细阐释，这些阐释仅仅是示例性的，不是对本发明实施方案的限制。本阐述所述矩形，半圆，圆环等为方便阐述用词，不可等同于严格的几何定义。
本发明提供一种磁场发生装置，该磁场发生装置包括磁力发生单元、用于固定所述磁力发生单元的固定装置、和磁力噪音消除组件；其中，磁力发生单元由沿着同一轴心排列的四块磁力组件构成，并由固定装置固定为两两相对，四块磁力组件合围，形成允许管道穿过的通道；其中，磁力噪音消除组件设置在固定装置的两端，覆盖所述磁力发生单元，中空部分允许管道通过。
本发明可使用表面磁场强度为0.3-1T的磁铁作为磁力组件。磁力噪音消除组件的材料为一般的软磁材料，如电工软铁。固定装置材料为非磁性材料，无其他任何限制，如亚克力材料。
优选的实施例中，磁场强度以轴心向四周递增，磁力的方向与磁场强度递增的方向相同。优选的实施例中，相对的两块磁力组件的相对面的磁极都为N极，而另两块相对的磁力组件的相对面都为S极。
图1显示了本发明磁力发生单元的一个示例性截面图。图1中，4块方形磁力组件沿着轴心110两两相对排列。相对的两块磁力组件101和102的相对面的磁极都是N极，相对的两块磁力组件103和104的相对面的磁极都是S极。
应理解，虽然图1示出的是方形磁力组件，但具有一定弧度的磁力组件也可以用于本发明。此外，图1中相邻磁力组件相互垂直，但相邻磁力组件相互之间也并不必须垂直，只要磁力发生组件所产生磁场满足本发明的分选要求即可。例如磁力组件101和103之间的角度可以是90±5°，与之对应的，磁力组件102和104之间的角度也在90±5°的范围内；或者，磁力组件101与104之间的角度可以是90±5°，与之对应的，磁力组件102和103之间的角度也在90±5°。且通常情况下，若两块磁力组件之间的角度小于90°或大于90°，那么另外两块磁力组件之间的角度也应同时小于90°或大于90°。磁力组件与磁力组件之间的距离也不必相等。例如，磁力组件101和103之间与磁力组件102与磁力组件104之间的间距相等，并小于磁力组件101与104以及磁力组件102与103之间的间距。
当然，优选的实施例中，四块磁力组件为方形磁铁，相互之间的距离相等，且相互之间垂直。
固定装置可由四个组件组成，两两组合，分别在所述磁场发生装置的两端固定住四块磁力组件。所述组件顶部投影为“凸”形，正面投影为“凹”形，位于磁场发生装置一端的两个组件组装后，凸出部与凹进部能相互嵌合。所述单元的凸出部具有穿透孔和半圆形凹陷，所述穿透孔用于容纳并固定磁力组件，在两个组件组装后，各自的半圆形凹陷合并形成允许管道穿过的圆形通道。应理解，凹陷并不一定是圆形，也可以是其它形状，只要组装后的两个组件的两个凹陷所形成的通道允许管道穿过即可。当然，优选的，所形成的通道与用于细胞流式磁珠分选的管道相贴合。
图2显示了本发明固定装置组件例子的正视图201、顶视图202和侧视图203。204显示半圆形凹陷，205显示用于容纳并固定磁力组件的穿透孔。
图3显示磁场发生装置一端两个组件组装后所形成的固定装置301的正视图。四个磁力组件303排列成矩形，通道304可容许管道通过。两个固定单元组件302A和302B紧密契合。
图4显示设置有磁力噪音消除组件的固定装置的正视图。磁力噪音消除组件404位于磁力发生单元、固定装置安装后整体403的外侧，为圆环形，环部分401覆盖磁力发生单元阵列(即所述四个磁力组件)，中空部分402可容许管道通过。应理解，磁力噪音消除组件并不必需为圆环形，也可以是其它性状，只要其具有允许管道穿过的中空部分以及能够覆盖全部磁力组件即可。
图5显示了本发明磁场发生装置组装前的示意图。固定装置的组件505与506以及507和508分别固定住磁力组件509和510以及511和512，分别形成部件501和502。磁力噪音消除组件503和504允许管道513穿过，并分别位于固定装置的两个外侧。501和502组装后，形成允许管道513穿过的通道514。
图6显示组装后的磁场发生装置601的示意图。可按照机械结构自然拆分成两个整体部分501，502及独立的磁力消除件503，504(如图5所示)。亦可由装置本身的磁力自然吸附成整体，而无需任何外部机械力的支持。本发明在使用时，样品流过方向可为602到603，亦可为603到602。
因此，本发明提供一种磁场发生装置，包括固定组件505、506、507和508，磁力组件509、510、511和512和磁力噪音消除组件503和504；其中，固定组件505和506通过其穿透孔固定磁力组件509和510，形成部件501，固定组件507和508通过其穿透孔固定磁力组件511和512，形成部件502；部件501和502组装嵌合后，形成通道514；中空的磁力噪音消除组件503和504分别位于固定组件505与508以及506与507嵌合后形成的部件的外侧，其环部分覆盖所有磁力组件，中空部分允许管道通过。
图1显示了本发明磁场发生装置的工作原理。如图1所示，磁场磁力线方向在磁力组件101，102，103，104所围空间内从101、102的N极端发出，指向103、104的S极。磁力组件表面磁场强度为0.3-1T。而磁场强度则以所述空间的中心点110向四周递增。磁力的方向与磁场强度递增的方向相同。待选细胞样品流经磁场中心管道108时，结合磁珠的细胞105、107在磁力的作用下，除沿管道的方向作径向流动外，亦产生向磁场强度递增的方向的矢量移动A、B。最终附着于管壁109并停止径向移动。未结合磁珠的细胞106可在管道108作自由单向矢量移动，并不能附着于管壁。目的细胞的吸附过程可发生在管道内的任意空间点。
当全部样品流过磁场后，目的细胞留在管道内壁，流过管道的样品不含目的细胞。细胞样品全部通过后，可增加细胞洗涤步骤，洗涤缓冲液流过管道时，偶然滞留在管道内壁的极少量的非目的残留细胞则被冲洗移出。以此达到选择性富集目的细胞的目的。富集或者冲洗过程完成后，可通过拆卸部件501和502(图5)的方式消除磁场。细胞重悬液流过管道，即可将特异性目的细胞洗脱，达到收集目的细胞的目的。
图7显示相邻磁极(对角线磁极相反)的磁力线方向和磁场强度。和8显示相对磁极(对角线磁极相同)的磁力线方向和磁场强度。图9显示相对磁极(对角线磁极相同)过磁场中心点水平方向磁场强度。和10显示相邻磁极(对角线磁极相反)过磁场中心点水平方向磁场强度。图11显示相对磁极(对角线磁极相同)过磁场中心点垂直方向磁场强度。图12显示相邻磁极(对角线磁极相反)过磁场中心点垂直方向磁场强度。图13显示相对磁极(对角线磁极相同)过磁场中线点对角线方向磁场强度。图14显示相邻磁极(对角线磁极相反)过磁场中线点对角线方向磁场强度。图中，磁场的模拟计算应用软件为vizimag(vizimag.software.informer.com)。
从图7－14可以看出，本发明所述磁场中，磁珠在管道直径方向各个位点所受的磁力大小都是相等的，方向均为从中心点向管壁辐射。而相邻磁场在垂直和斜45度角所受磁力较小且不同位置磁力大小极不均匀；而水平方向所受磁力为从管壁到中心点，起不到吸附磁珠的作用。对比实验亦表明本发明磁场比较对照案有极其明显的优势。
本发明还提供一种细胞分选方法，所述方法包括使用本发明磁场发生装置进行磁分离的步骤。
通常，所述方法还包括使细胞与磁性材料孵育的步骤。
可采用本发明磁场发生装置进行细胞分选的细胞可以是本领域已知的各种细胞，优选是哺乳动物来源的细胞，更优选为人细胞。
细胞包括但不限于外周血细胞、造血细胞、神经干细胞和肿瘤细胞，更具体而言，包括但不限于红细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、外周血单核细胞或淋巴细胞。
可用于本发明的磁性材料可以是本领域已知的各种磁性材料，例如磁珠，只要这类磁性材料可用于吸附细胞。
对细胞与磁珠孵育的条件并无特殊限制，通常按本领域常规的孵育条件进行。
除细胞分选之外，本发明的磁场发生装置还可以用于其它使用磁性材料结合并分离的方法中。这类方法包括但不限于蛋白质(如抗体)、核酸的分离。例如，通常先使靶分子(例如蛋白质、核酸)与磁性材料(例如磁珠)孵育，从而使靶分子连接到磁性材料上。然后再使用本发明的磁场发生装置进行磁分离，分选出结合了靶分子的磁性材料。
因此，本发明也提供一种靶分子分离的方法，所述方法包括使用本发明磁场发生装置进行磁分离的步骤。如前所述，该方法还可包括使靶分子与磁性材料孵育的步骤。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。
如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例
采用本发明的磁力分选装置、商品磁铁架和对照装置进行测试。商品磁铁架为奥磁多功能磁分离器MS-12，制造商(上海奥润微纳米材料科技有限公司)。对照装置的结构与本发明的磁力分选装置相同，不同之处仅在于将该对照装置中磁极进行相应对调(即相对面的磁极是NS)。具体分选步骤如下：
1、取待分选混合细胞，2000转/分钟离心(rpm)5分钟。初始细胞纯度通过流失细胞仪检测，标记抗体为CD3-PECy7。
2、去掉上清，将细胞重悬，加入1毫升PBS混合充分。
3、2000rpm离心5分钟。
4、去掉上清，将细胞重悬，加入800微升PBS混合充分。
5、取20微升磁珠，磁分离。
6、将步骤4中细胞加入步骤5中，重悬混合充分。
7、将步骤6中的细胞放置于旋转混合仪室温结合1小时。
8、磁分离。
9、将步骤8中的磁珠用1毫升PBS重悬，洗涤细胞。
10、磁分离。
11、200微升PBS重悬。
12、流式细胞仪检测细胞纯度，标记抗体为CD3-PECy7。
具体实验样品和参数如下表1所示：
表1
测试结果如下表2所示：
表2
此外，图15显示了采用对照装置进行细胞磁分离后的效果，图16显示了采用本发明的磁力分选装置分选进行细胞磁分离的效果。从图15中可以看出，由于对照装置的磁极排列导致磁力线分布不均，细胞在试管中分布非常不均匀。与之相反，如图16所示，采用本发明磁力分选装置进行细胞磁分离时，细胞均匀地分布在试管内。这种均匀分布对之后的洗脱非常有益。其效果已在表2中体现出来。
Claims (10)
1.一种磁场发生装置，该磁场发生装置包括：
磁力发生单元；
用于固定所述磁力发生单元的固定装置；和
放置于固定装置两端的磁力噪音消除组件；
其中，所述磁力发生单元由沿着同一轴心排列的四块磁力组件构成，并由固定装置固定为两两相对，所述四块磁力组件合围，形成允许管道穿过的通道；且磁力发生单元中，相对的两块磁力组件的相对面的磁极都为N极，而另两块相对的磁力组件的相对面都为S极。
2.如权利要求1所述的磁场发生装置，其特征在于，所述磁力组件为表面磁场强度为0.3－1T的磁铁。
3.如权利要求1－2中任一项所述的磁场发生装置，其特征在于，所述固定装置由四个组件组成，两两组合，分别在所述磁场发生装置的两端固定住四块磁力组件。
4.如权利要求3所述的磁场发生装置，其特征在于，固定装置中的所述组件设置为顶部投影为“凸”形，正面投影为“凹”形，位于磁场发生装置一端的两个组件组装后，凸出部与凹进部能相互嵌合；所述单元的凸出部设置有穿透孔和半圆形凹陷，所述穿透孔设置用于容纳并固定磁力组件，所述半圆形凹陷设置用于在两个组件组装后形成允许管道穿过的圆形通道。
5.如权利要求1－4中任一项所述的磁场发生装置，其特征在于，所述磁力噪音消除组件设置成覆盖所述磁力发生单元及允许管道穿过。
6.一种磁场发生装置，包括：
固定组件505、506、507和508；
磁力组件509、510、511和512；和
磁力噪音消除组件503和504；
其中，固定组件505和506借助穿透孔固定磁力组件509和510，形成部件501，固定组件507和508借助穿透孔固定磁力组件511和512，形成部件502；
部件501和502组装嵌合后，形成通道514；
磁力噪音消除组件503和504分别位于固定组件505与508以及506与507嵌合后形成的部件的外侧，覆盖所有磁力组件，并具有允许管道通过的中空部分。
7.如权利要求6所述的磁场发生装置，其特征在于，所述磁场发生装置设置成部件501和502组装嵌合后，四个磁力组件面向通道514的磁极依次是N、S、N和S。
8.一种分选细胞或分离靶分子的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1－6中任一项所述的磁场发生装置进行磁分离的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使细胞或靶分子与磁性材料孵育的步骤。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述细胞选自外周血细胞、造血细胞、神经干细胞和肿瘤细胞，所述靶分子选自蛋白质和核酸。
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