CN105175546A - 人血管内皮生长因子与表皮生长因子样结构域7的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人工合成的融合蛋白，特别是涉及一种人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)的融合蛋白。人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)融合蛋白，所述融合蛋白包括：来自VEGF蛋白的氨基酸序列；来自EGFL7蛋白的氨基酸序列；连接肽；以及在末端添加的血清蛋白结合域的片段。本发明所述的融合蛋白对于内皮细胞的血管新生促进作用有显著的提高，相较于VEGF或EGFL7更具有在血管内皮血管新生方面的临床应用优势，可作为新型的血管生长因子而被应用于促血管新生领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工合成的融合蛋白，特别是涉及一种人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)的融合蛋白。
背景技术
血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤分泌的细胞因子，在正常体内和肿瘤关联的血管新生中均十分重要，过去十几年来它一直是血管新生调节机制研究方面的热点。
VEGF基因位于染色体6的短臂上，由8个外显子和7个内含子构成，不同的外显子拼接方式可分化产生4种成熟的同源异构体，分别为VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。不同的数字代表着不同的氨基酸数目，其中以VEGF165为主要的同源异构体。
VEGF通过与细胞表面受体相互作用产生其生物效应。这些受体都是跨膜酪氨酸激酶受体，包括VEGF1和VEGF2，均可在脐带血管内皮细胞上选择性表达。此外还有神经菌毛蛋白受体(NP1和NP2)，可在神经元血管内皮上表达。当VEGF与受体的细胞外结构域结合时，细胞内受体酪氨酸激酶开始二聚化和自身磷酸化，激活下游蛋白的级联反应。VEGF2似乎是介导VEGF促血管生成效应的主要受体，它引起血管新生、出芽和内皮细胞管道形成。此外，通过产生内皮一氧化氮合酶，增加一氧化氮而引起血管扩张。
氧含量(oxygentension)对于VEGF的基因表达调控至关重要。长期处于低氧状态可诱导VEGF的mRNA表达，而其中缺氧诱导分子(HIF，hypoxia-induciblefactor)是这种低氧反应的重要调控因子。
一系列的体外研究实验均表明，VEGF具有很强的促进内皮细胞生长的作用，而不论这些内皮细胞是来源于动静脉或是淋巴管。无独有偶的是，在动物模型身上做的体内研究也发现了其具有潜在的诱导血管再生的能力。
VEGF在个体的成长发育过程中也同样具有重要的地位。在小鼠体内，vegf基因的缺失是致命的，因为会导致血管缺陷和心血管异常。VEGF影响许多重要的血管生成过程，包括伤口愈合、排卵、血压维持、月经和妊娠等情况。
表皮生长因子样结构域7(Epidermalgrowthfactor-likedomain7，EGFL7)也被称之为血管内皮他汀(Vascularendothelial-statin)，与VEGF类似，也是一种血管生长因子。当内皮细胞是处于活跃的增生阶段时，EGFL7则高度表达。
将Egfl7基因敲除可刺激Notch通路，而新生儿出生后视网膜里该基因的过度表达则可抑制Notch通路并且导致血管的过度增生。
Egfl7的独特之处在于，它几乎只在内皮细胞表达并作用于该细胞，而其他已知的分泌性的血管生长信号因子像VEGF、FGF2等不仅在内皮细胞表达也可以在其他细胞中表达。
EGFL7是一种分泌蛋白，一旦分泌便可与细胞外基质结合，并可与纤维连接蛋白和IV型胶原一起重叠表达。
EGFL7可调控细胞的生成、迁移和增生。其亦可作用于细胞外基质，并且可以通过抑制赖氨酰氧化酶介导的弹性蛋白原转化为弹性蛋白的过程来调节细胞外基质的硬度。
EGFL7具有很多优势，首先它的表达状态与成血管细胞和内皮细胞的标记物VegfR2极为类似，其次尤其在一些很特殊情况下如缺氧或是营养状态不良，都可以维持高度表达的活性以促进细胞的血管新生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)融合蛋白，该融合蛋白可作为新型的血管生长因子而被应用于促血管新生领域。
本发明所述的人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)融合蛋白，包括：来自VEGF蛋白的如SEQIDNO.1所列的氨基酸序列；来自EGFL7蛋白的如SEQIDNO.2所列的氨基酸序列；将所述来自VEGF蛋白的氨基酸序列与来自EGFL7蛋白的氨基酸序列融合在一起的刚性连接肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所列；以及在末端添加的血清蛋白结合域的片段，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所列。
根据本发明所述的融合蛋白的优选实施例，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.6所示。
优选地，编码如本发明所述的融合蛋白的融合基因，其包含如SEQIDNO.7所列的核苷酸序列，由564个碱基组成。
本发明还提供了另一种人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)融合蛋白，该融合蛋白包括：来自VEGF蛋白的如SEQIDNO.1所列的氨基酸序列；来自EGFL7蛋白的如SEQIDNO.2所列的氨基酸序列；将所述来自VEGF蛋白的氨基酸序列与来自EGFL7蛋白的氨基酸序列融合在一起的弹性连接肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所列；以及在末端添加的血清蛋白结合域的片段，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所列。
根据本发明所述的融合蛋白的优选实施例，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.8所示。
优选地，编码如本发明所述的融合蛋白的融合基因，其包含如SEQIDNO.9所列的核苷酸序列，由552个碱基组成。
本发明还提供了包含如本发明所述的基因的重组表达载体，以及用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。
本发明还提供了制备如本发明所述的融合蛋白的方法，包括以下步骤：培养用包含如本发明所述的转化体，回收所表达的融合蛋白。
本发明所述的人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)融合蛋白是一种人工合成的新的血管生长因子，经实验表明，该融合蛋白在促血管新生方面的效果显著优于VEGF或者EGFL7的效果。
VEGF与EGFL7均为促进内皮细胞血管新生的血管生长因子，本发明的独特之处在于：选择了VEGF蛋白和EGFL7的特定片段，通过两种不同的连接肽使这两者结合起来，并添加血清蛋白结合域序列，经实验表明，该融合蛋白对于内皮细胞的血管新生促进作用比二者各自的作用效果有显著的提高，因此，该融合蛋白相较于VEGF或EGFL7更具有在血管内皮血管新生方面的临床应用优势，可作为新型的血管生长因子而被应用于促血管新生领域。
同时，本发明在该融合蛋白的末端被加上了血清蛋白结合域的片段，有助于减少该生物多肽的肾小球滤过率，延长其在体内的作用时间。
附图说明
图1为构建VEGF-EGFL7融合基因的酵母表达质粒。
图2显示PCR验证所得阳性克隆即为VEGF-EGFL7酵母表达菌株。
图3显示PAGE及WesternBlotting检测诱导表达VEGF-EGFL7融合蛋白。
图4A-4B显示本发明所述的VEG-EGFL7融合蛋白比单一VEGF或EGFL7更强地促体外血管新生网形成。
图4C-4D显示本发明所述的VEG-EGFL7融合蛋白比单一VEGF或EGFL7更强地促下肢缺血后血管新生网形成。
图5是VEGF-EGF7融合蛋白加上血清蛋白结合域以及未加上血清蛋白结合域的血浆浓度变化图。
具体实施方式
实施例一：构建VEGF-EGFL7融合基因在酵母表达系统
本实施例分析VEGF、EGFL7促血管生成的活性区域的基因编码序列，分别利用刚性、弹性两种连接肽，将其融合在一起，并在末端添加血清蛋白结合域的基因编码序列。
主要包括以下步骤：
1.从NCBI获取VEGF蛋白序列
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/76781480？report＝fasta)，
提取其功能区域：
NHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKD(SEQIDNO.1)。
2.从NCBI获取EGFL7蛋白序列
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/7705889？report＝fasta)，
提取其功能区域：
GAAICQPPCRNGGSCVQPGRCRCPAGWRGDTCQ(SEQIDNO.2)。
3.从NCBI获取血清蛋白蛋白序列
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4502027？report＝fasta)，
提取其结合域：RLIEDICLPRWGCLWEDD(SEQIDNO.3)。
4.以刚性连接肽或弹性连接肽为接头，合成VEGF-EGFL7融合蛋白。
刚性连接肽的序列为：AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQIDNO.4)。
弹性连接肽的序列为：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.5)。
5.以上述蛋白序列为依据，在NCBI获取VEGF-EGFL7的基因编码序列。
6.委托OriGene公司直接合成带EcoRI和KnpI酶切位点的VEGF-EGFL7融合基因，用于构建VEGF-EGFL7酵母表达载体。
本发明采用以下的技术路线：构建含有人VEGF和EGFL7融合基因的毕赤酵母表达质粒，转化毕赤酵母表达菌株，表达、纯化VEGF-EGFL7融合蛋白。主要包括以下步骤：1.构建VEGF-EGFL7酵母表达载体；2.表达、纯化VEGF-EGFL7融合蛋白。
本实验所需的毕赤酵母表达系统购于LifeTechonogies公司(https://www.lifetechnologies.com)，质粒信息及图谱见图1。
本实验所需试剂及培养基见表1。
表1：构建VEGF-EGFL7酵母表达系统的试剂及培养基
实验过程：
A.构建VEGF-EGFL7酵母表达菌株
1.利用限制性内切酶KpnI和EcoRI消化VEGF-EGFL7融合基因及毕赤酵母表达载体pPinK-HC，然后使用QiagenTMQuickGelExtractionKit纯化酶切后的目的产物；
2.利用T4连接酶16度过夜连接上述纯化所得产物；
3.转化感受态细胞株Top10，PCR鉴定阳性克隆，扩大培养阳性克隆以提取高纯度质粒；
4.利用限制性内切酶SpeI消化10μg上述质粒，然后使用QiagenTMQuickPCRPurificationKit纯化上述酶切产物；
5.培养并收集10毫升PichiaPinkTM菌株，重悬于300μL预冷的1M山梨醇溶液，取80μL与SpeI酶切的质粒混合后，电转，并用PAD选择性培养板筛选阳性克隆；
6.PCR验证所得阳性克隆即为VEGF-EGFL7酵母表达菌株(图2)。
B.表达、纯化VEGF-EGFL7融合蛋白
1.挑取单个VEGF-EGFL7酵母表达株，接种于25mLBMGY培养液，于27℃以250r/s培养两天；
2.将上述25mLBMGY培养液转接于1LBMGY培养液中，同样条件培养至对数生长期；
3.收集菌液，室温2000g离心5分钟，去上清，重悬于200mLBMGY培养液；
4.添加0.5％终浓度甲醇，诱导表达VEGF-EGFL7融合蛋白，PAGE及WesternBlotting检测目的蛋白(图3)；
5.室温2000g离心5分钟收集酵母，上清存于4℃，沉淀用于裂解提取蛋白；
6.利用镍柱亲和层析法纯化上清及酵母裂解液中的VEGF-EGFL7融合蛋白。
本发明所用的真核表达载体还可选用胞内型载体：PAO815、PPIC3K、PPICZ、PHWO10、PGAPZ，或者分泌型载体：PPIC9K、PPICZα、PGAPZα，或者市面上销售的同类载体。所用的真核表达菌株也可以选用毕赤酵母菌KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165、SMD1163等作为宿主细胞。
本发明也可用原核表达体系来实现，选用表达载体：pET、pUCH33等，或者市面上销售的同类载体；选用原核表达菌株：大肠杆菌BL21、大肠杆菌JM109等作为宿主细胞。
实施例二：VEGF和EGFL7融合蛋白对体外促血管新生的应用
将人脐带血管内皮细胞(HUVEC)按照1×106每孔的密度分别接种基质胶于6孔板，在无血清培养基中加入不同浓度的EGFL7、VEGF和VEGF-EGFL7融合蛋白(分别为0ng/毫升至100ng/毫升)，然后将细胞培养3-6小时(在常氧条件下21％O2或者低氧1％O2条件下)培养。结果见图4。没有加入促进血管再生因子VEGF及EGFL7，人脐带血管内皮细胞没有呈现血管网状结构(图4A的iv图)。在培养基中分别添加VEGF或者EGFL7或者VEGF-EGFL7融合蛋白后，细胞形成血管网状结构(图4A的i至iii图)，血管网状形成密度进行拍照统计。图4结果显示，加入同等浓度(0.1至100ng/ml)的VEGF或者EGFL7或者VEGF-EGFL7融合蛋白后，HUVEC的血管网状形成；结果显示。与VEGF或者EGFL7相比，VEGF-EGFL7融合蛋白更能刺激HUVEC血管网状形成(图4A的i图)，血管网状形成数量最多(图4B，*P<0.01.和VEGF或者EGFL7比较；#，P<0.05，与基质胶上无加因子的对照组比较)，VEGF第二，EGFL7最少，证实VEGF-EGFL7融合蛋白有生物学功能对血管再生有促进作用。
实施例三：VEGF和EGFL7融合蛋白对体内促血管新生的应用
通过结扎大鼠心肌冠脉左前降支，构建大鼠急性心肌缺血模型，分别在结扎冠脉左前降周围处注射入同等浓度(1至100μg/kg)的VEGF或者EGFL7或者VEGF-EGFL7融合蛋白后，第14天取出心脏，切片免疫组织化学荧光染色，应用CD31标记血管内皮网状，DAP标记细胞核，如图(4C的i-iv)免疫组织化学荧光染色显示，血管网状形成密度各组之间的差异明显；进行拍照统计，检查血管网状形成密度，比较各组之间的差异程度。如图4D的结果显示，与VEGF或者EGFL7相比，VEGF-EGFL7融合蛋白更能刺激CD31阳性血管网状形成，血管网状形成数量最多；与无加因子的对照组比较，VEGF第二，EGFL7最少，证实VEGF-EGFL7融合蛋白有生物学功能对血管再生有促进作用。
实施例四：VEGF和EGFL7融合基因加上了血清蛋白结合域片段延长其在体内的作用时间
肾小球滤过率(GFR，glomerularfiltrationrate)是指单位时间(通常为1分钟)内两肾生成滤液的量。通常用这个指标来衡量肾功能的情况。在动物模型上，可以通过测定不同时间点该融合蛋白的血浆浓度来间接反映该物质肾小球滤过率的大小。
将C57B6/J老鼠分成A和B两组，通过尾静脉注射，A组注射含有血清蛋白结合域的VEGF和EGFL7的融合蛋白，B组注射同浓度未含有血清蛋白结合域的融合蛋白。之后分别于0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h这6个时间点用ELISA方法检测小鼠血浆血管VEGF-EGFL7融合蛋白的血浆浓度。实验结果证明，各时间点A组融合蛋白的浓度均高于B组。这表明，该血清蛋白结构域有助于延长其在体内的作用时间，降低其肾小球滤过率。
Claims (10)
1.一种人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：
来自VEGF蛋白的如SEQIDNO.1所列的氨基酸序列；
来自EGFL7蛋白的如SEQIDNO.2所列的氨基酸序列；
将所述来自VEGF蛋白的氨基酸序列与来自EGFL7蛋白的氨基酸序列融合在一起的刚性连接肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所列；以及
在末端添加的血清蛋白结合域的片段，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所列。
2.一种人血管内皮生长因子(VEGF)与表皮生长因子样结构域7(EGFL7)融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：
来自VEGF蛋白的如SEQIDNO.1所列的氨基酸序列；
来自EGFL7蛋白的如SEQIDNO.2所列的氨基酸序列；
将所述来自VEGF蛋白的氨基酸序列与来自EGFL7蛋白的氨基酸序列融合在一起的弹性连接肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所列；以及
在末端添加的血清蛋白结合域的片段，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.6所示。
4.编码如权利要求3所述的融合蛋白的融合基因，其包含如SEQIDNO.7所列的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.8所示。
6.编码如权利要求5所述的融合蛋白的融合基因，其包含如SEQIDNO.9所列的核苷酸序列。
7.包含如权利要求4所述的基因的重组表达载体，以及用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。
8.制备如权利要求3所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养用包含如权利要求7所述的转化体，回收所表达的融合蛋白。
9.包含如权利要求6所述的基因的重组表达载体，以及用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的转化体。
10.制备如权利要求5所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养用包含如权利要求7所述的转化体，回收所表达的融合蛋白。
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