CN105158223A - 一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统及其应用 - Google Patents

一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物的检测和成像领域，具体的说是一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统及其应用。小分子标记荧光信号系统以溶菌酶作为识别靶点原件。本发明利用溶菌酶功能分子标记荧光信号系统来快速检测和分析微生物等，用其检测控制生物分子浓度的变化，能够快速检测微生物。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量或基于抗体的识别技术，利用这类溶菌酶标记信号系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性，同时准确性高。利用溶菌酶功能小分子标记荧光信号系统来快速检测和分析微生物，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。

Description

一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统及其应用
技术领域
本发明涉及微生物的检测和成像领域，具体的说是一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统及其应用。
背景技术
微生物感染的诊断在医学上来说一直难以解决的问题。研究者们已经制备了许多荧光探针对微生物进行成像，但其不能对低浓度的微生物进行成像，同时也很暗区分炎症组织和肿瘤细胞，在临床上的应用很难得到推广。
微生物检测传感器技术经历了半个世纪的发展，从发展初期的分子检测到最近的基因高通量测序，从初始纯粹电化学信号的整体测量到如今纳米孔单分子水平的研究，从原始的单一组分分析到现在多尺度多组分检测。微生物传感器技术在这些方面取得的进步，是全人类科学研究和技术应用成果的积累，它推动着人类迈向新的台阶。尽管生物传感器技术在大踏步的向前迈进，不可否认，它还存在很多问题：比如微生物芯片传感器还未走入日常生活，只能在实验室充当实验工具；蛋白或酶生物传感器的稳定性非常差，需要严苛的保存条件，容易失活，需要频繁的标定和对比；原位监控生物传感器的特异性还不是很好，容易受其他生物物质的干扰和污染。这些都是我们生物传感器研究者所需要解决的问题，也是人类对于自我前行的挑战。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统，小分子标记荧光信号系统以溶菌酶作为识别靶点原件。
所述小分子标记荧光信号系统是将溶菌酶与荧光功能小分子交联获得。
所述荧光功能小分子为：氟硼荧染料、罗丹明类、德克萨斯红类、藻蓝蛋白类、AlexaFluor系列荧光染料或Cy系列荧光染料。
所述AlexaFluor系列荧光染料由AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor680或AlexaFluor790。
所述Cy系列荧光染料由Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5或Cy7。
一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统的应用，利用所述小分子标记荧光信号系统检用于检测并区分革兰氏阳性微生物。
本发明所具有的优点：
本发明利用溶菌酶小分子标记的荧光信号系统来快速检测和分析微生物,比如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、爱德华迟缓菌、费氏弧菌、炭疽杆菌等，用其检测检测控制微生物浓度和显著的信号放大成像。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量，利用溶菌酶信号标记系统来快速检测和分析微生物具有显著的特异性，同时准确性高。利用溶菌酶活性功能小分子标记信号系统来快速检测和分析生物分子，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。
附图说明
图1为本发明实施例提供的溶菌酶荧光探针的合成过程图。
图2为本发明实施例提供的不同浓度下枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的相对荧光强度图。
图3为本发明实施例提供的107CFU/mL的不同细菌的相对荧光强度图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
本发明将结合有特异性的溶菌酶的荧光探针，即为生物信号标记系统。所述应用于生物分析领域用于检测生物分子。本发明利用溶菌酶功能分子标记荧光信号系统来快速检测和分析微生物等，用其检测检测控制生物分子浓度的变化，能够快速检测微生物。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量或基于抗体的识别技术，利用这类溶菌酶标记信号系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性，同时准确性高。利用溶菌酶功能小分子标记荧光信号系统来快速检测和分析微生物，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。
实施例1：
探针合成过程(图1)：10mg溶菌酶与250μgFITC溶解于5mL0.1mol·L-1Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝9.5),室温下避光反应4h,移入4℃冰箱中2h,终止反应。用超纯水在冰水浴中透析(截留分子量300)2天，每天换水一次，以除去未反应的荧光素。制得的FITC-LYZ放置于4℃冰箱中避光保存
荧光素标记溶菌酶(FITC-LYZ)对不同浓度的革兰氏阳性和阴性细菌进行检测:
将枯草芽孢杆菌(BacillusCereus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并分别用磷酸盐缓冲液稀释浓度为102、103、104、105、106、107CFU/mL。
取50μLFITC-LYZ加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述稀释至不同浓度的900μL菌液中分别加入100μLFITC-LYZ，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度(参见图2)。
FITC-LYZ对相同浓度的不同细菌进行检测：
将细菌分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并用磷酸盐缓冲液稀释浓度为107CFU/mL。
取50μLFITC-LYZ加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述900μL细菌稀释液中加入100μLFITC-LYZ，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
由图2可见，其展示了针对革兰氏阴性和阳性细菌产生的荧光信号强度的变化。与FITC-LYZ作用的革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)的相对荧光强度随各自浓度的变化关系。对于革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌)，其相对荧光强度与菌体浓度呈负相关；而对于革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)，其相对荧光强度与菌体浓度总体上呈正相关。且两种细菌在菌体浓度越低时，相对荧光强度差别越大。
实施例2：
将枯草芽孢杆菌(BacillusCereus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并分别用磷酸盐缓冲液稀释浓度为102、103、104、105、106、107CFU/mL。
取50μL氟硼荧染料标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述稀释至不同浓度的900μL菌液中分别加入100μLFITC-LYZ，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
氟硼荧染料标记溶菌酶对相同浓度的不同细菌进行检测：
将枯草芽孢杆菌(BacillusCereus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)细菌分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并用磷酸盐缓冲液稀释浓度为107CFU/mL。
取50μL氟硼荧染料标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述900μL细菌稀释液中加入100μL氟硼荧染料标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度(参见图3)。
实施例3：
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并分别用磷酸盐缓冲液稀释浓度为102、103、104、105、106、107CFU/mL。
取50μL藻蓝蛋白标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述稀释至不同浓度的900μL菌液中分别加入100μL藻蓝蛋白标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
藻蓝蛋白标记溶菌酶对相同浓度的不同细菌进行检测：
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并用磷酸盐缓冲液稀释浓度为107CFU/mL。
取50μL藻蓝蛋白标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述900μL细菌稀释液中加入100μL藻蓝蛋白标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度(参见图3)。
实施例4：
将蜡样芽胞杆菌(BacillusCereus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并分别用磷酸盐缓冲液稀释浓度为102、103、104、105、106、107CFU/mL。
取50μL德克萨斯红标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述稀释至不同浓度的900μL菌液中分别加入100μL德克萨斯红标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
德克萨斯红标记溶菌酶对相同浓度的不同细菌进行检测：
将蜡样芽胞杆菌(BacillusCereus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并用磷酸盐缓冲液稀释浓度为107CFU/mL。
取50μL德克萨斯红标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述900μL细菌稀释液中加入100μL德克萨斯红标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度(参见图3)。
实施例5：
藤黄溶壁微球菌(Microcococcuslysodeikticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并分别用磷酸盐缓冲液稀释浓度为102、103、104、105、106、107CFU/mL。
取50μL细胞色素C2标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述稀释至不同浓度的900μL菌液中分别加入100μL细胞色素C2标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
细胞色素C2标记溶菌酶对相同浓度的不同细菌进行检测：
将细菌培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并用磷酸盐缓冲液稀释浓度为107CFU/mL。
取50μL细胞色素C2标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述900μL细菌稀释液中加入100μL细胞色素C2标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度(参见图3)。
由图3可见：为与FITC-LYZ作用的革兰氏阳性细菌(藤黄溶壁微球菌)和革兰氏阴性细菌(溶藻弧菌)的相对荧光强度随各自浓度的变化关系。对于革兰氏阳性细菌，其相对荧光强度与菌体浓度呈负相关；而对于革兰氏阴性细菌，其相对荧光强度与菌体浓度总体上呈正相关。且两种细菌在菌体浓度越低时，相对荧光强度差别越大。。
实施例6：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和爱德华弧菌(E.tarda)分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并分别用磷酸盐缓冲液稀释浓度为102、103、104、105、106、107CFU/mL。
取50μL细胞色素C5标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述稀释至不同浓度的900μL菌液中分别加入100μL细胞色素C2标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
细胞色素C5标记溶菌酶对相同浓度的不同细菌进行检测：
将细菌分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并用磷酸盐缓冲液稀释浓度为107CFU/mL。
取50μL细胞色素C5标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述900μL细菌稀释液中加入100μL细胞色素C2标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
由图3可见：为与FITC-LYZ作用的革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌(爱德华弧菌)的相对荧光强度随各自浓度的变化关系。对于革兰氏阳性细菌，其相对荧光强度与菌体浓度呈负相关；而对于革兰氏阴性细菌，其相对荧光强度与菌体浓度总体上呈正相关。且两种细菌在菌体浓度越低时，相对荧光强度差别越大。。
实施例7：
蜡样芽胞杆菌(BacillusCereus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并分别用磷酸盐缓冲液稀释浓度为102、103、104、105、106、107CFU/mL。
取50μLAlexaFluor610标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述稀释至不同浓度的900μL菌液中分别加入100μLAlexaFluor610标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度。
AlexaFluor610标记溶菌酶对相同浓度的不同细菌进行检测：
将细菌分别培养过夜，离心后用PBS洗涤菌体3次，并用磷酸盐缓冲液稀释浓度为107CFU/mL。
取50μLAlexaFluor610标记溶菌酶加入950μLPBS稀释，振摇1-2h,以恢复LYZ活性。
向上述900μL细菌稀释液中加入100μLAlexaFluor610标记溶菌酶，混匀,室温培养5min后，离心去除上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，检测菌体的荧光强度。以相对荧光强度RF＝Fsample/Fcontrol表示，其中Fsample和Fcontrol分别表示样品和空白的荧光强度(参见图3)。
由图3可见：为与FITC-LYZ作用的革兰氏阳性细菌(蜡样芽胞杆菌)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)的相对荧光强度随各自浓度的变化关系。对于革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌)，其相对荧光强度与菌体浓度呈负相关；而对于革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)，其相对荧光强度与菌体浓度总体上呈正相关。且两种细菌在菌体浓度越低时，相对荧光强度差别越大。

Claims (6)

1.一种基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统，其特征在于：小分子标记荧光信号系统以溶菌酶作为识别靶点原件。
2.按权利要求1所述基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统，其特征在于：所述小分子标记荧光信号系统是将溶菌酶与荧光功能小分子交联获得。
3.按权利要求2所述基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统，其特征在于：所述荧光功能小分子为：氟硼荧染料、罗丹明类、德克萨斯红类、藻蓝蛋白类、AlexaFluor系列荧光染料或Cy系列荧光染料。
4.按权利要求3所述基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统，其特征在于：所述AlexaFluor系列荧光染料由AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor680或AlexaFluor790。
5.按权利要求3所述基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统，其特征在于：所述Cy系列荧光染料由Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5或Cy7。
6.一种权利要求1所述的基于溶菌酶功能的小分子标记荧光信号系统的应用，其特征在于：利用所述小分子标记荧光信号系统检用于检测并区分革兰氏阳性微生物。
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