CN105143468A - 单核苷酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法。其特征在于以下步骤：(1)通过焦磷酸解从分析物产生单核苷酸碱基流；(2)通过将各单核苷酸碱基与用处于不可检测状态的可检测元件标记的捕获系统反应产生捕获的分子；(3)从各捕获的分子释放处于可检测状态的可检测元件；以及(4)检测这样释放的可检测元件并且由其确定核苷酸碱基的序列。所述方法可以有利地用于涉及使用微滴的测序仪中。

Description

单核苷酸检测方法
本发明涉及一种用于表征多核苷酸如来源于天然存在的RNA或DNA的那些的方法，所述方法是通过捕获并检测通过逐步焦磷酸解而由所述多核苷酸产生的单核苷酸碱基的有序序列。
遗传物质的下一代测序已经对总体生物学和医学产生巨大的影响，尤其是因为测序的单位成本随着越来越快的测序仪进入市场而直线下降。因此，在一种这样的机器中，首先将双链DNA分析物分解为多个更小的多核苷酸片段，各个多核苷酸片段首先在一条链的两端被腺苷酸化(adenylate)，使得单链第一寡核苷酸可以通过与未配对的腺嘌呤碱基杂交结合于其互补体(compliment)的两端。然后将这样获得的处理的片段按大小进行选择并捕获到用结合的单链第二寡核苷酸包被的表面上，所述单链第二寡核苷酸自身是第一个的序列互补体，使得实质上，通过进一步杂交可以形成表面结合的双链片段的文库。在随后的聚类(clustering)步骤中，随后使用延伸和等温桥接反应将这些文库组分在表面上克隆扩增数百万次，以利用未使用的第二寡核苷酸。这实质上产生了通过其一条链结合于表面的稠密浓度的多核苷酸片段。然后除去各个片段的未结合的互补链，从而留下结合的单链片段供测序使用。在测序阶段，用引物引发(prime)这些单链片段中的每个并且通过使用聚合酶链反应和双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四种特征核苷酸碱基的混合物进行延伸来再产生其互补链。各个ddNTP类型用在不同波长发荧光的不同荧光团标记的部分封端。然后延伸反应采用三步骤的循环形式；首先相关ddNTP被结合到生长的链中；接下来通过照射样品并检测荧光的波长来鉴定其包含的核苷酸碱基，并且最后除去封端及其相关荧光团从而允许接下来的延伸事件发生。通过这种方式，互补链的序列可以逐个碱基地建立。将理解的是，虽然这种方法可以是高度自动化的并且可以产生高准确度的序列读取，但其运行速度受延伸循环速率的限制。因此，在实践中，该技术的使用倾向于包括平行处理相对短的多核苷酸片段和自由其获得的各种读取结果(reads)组装整个序列。这本身可能导致计算的复杂度并且可能引入错误。
最近已经进行尝试开发直接测序方法。例如，WO2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中尤其是，单链或双链多核苷酸样品(例如天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其经由设置有并置在纳米孔(nanopores)的出口内或附近的等离子体纳米结构(plasmonicnanostructures)的纳米穿孔基板转移来读取。在该装置中，所述等离子体纳米结构限定检测窗(实质上是电磁场)，在所述检测窗内，通过与入射光相互作用，各核苷酸碱基(优选标记的)又被诱导从而以特征方式发荧光或拉曼散射光子。随后远程检测这样产生的光子，多倍化(multiplexed)并转化为数据流，其信息内容表征为与多核苷酸相关的核苷酸碱基序列。然后可以使用被嵌入在被编写入与其集成的微处理器或与其连接的辅助计算装置中的相应软件中的计算算法将该序列由所述数据流复原。关于使用等离子体纳米结构和其相关共振特征的进一步背景可以在例如Adv.Mat.2004，16(19)pp.1685-1706中找到。
另一种快速测序多核苷酸的装置在例如，US6627067，US6267872和US6746594中描述。在其最简单的形式中，该装置使用电极替代等离子体纳米结构，来限定跨过基板或在纳米孔出口中或纳米孔出口周围的检测窗。随后应用跨电极的电位差，并且测量作为多核苷酸和相关电解质经由纳米孔的电泳转移的结果的电极之间流动的离子介质的电学特性的改变，作为时间的函数。在该装置中，因为多种个体核苷酸碱基通过检测窗，它们连续阻塞和开启检测窗，引起导致电流或电阻率的特征性波动的‘事件’。然后这些波动用于产生合适的数据流用于上述分析。
稳定小滴流(dropletstream)，特别是微滴流(microdropletstream)的产生，已经应用于分子生物学的技术的另一开发领域。例如，US7708949公开一种用于在油中产生稳定的水滴的新型微流体方法，同时例如US2011/0250597描述了使用该技术产生含有核酸模板(通常是多核苷酸DNA或RNA片段)和使得能够使用聚合酶链反应扩增所述模板的多个引物对的微滴。其他与该领域相关的专利申请通常包括JP2004/290977，JP2004/351417，US2012/0122714，US2011/0000560，US2010/01376163，US2010/0022414和US2008/0003142。
WO2004/002627公开了一种使用各种装置产生液-液和气-液分散体的方法，所述方法包括在上游和下游微流体区域之间形成不连续部分。然而，未教导将其用于单核苷酸DNA测序。
WO2010/077859教导了一种小滴执行器(actuator)，其包括设置有电极的基板、反应器通路和核苷酸碱基、洗涤缓冲液、样品和酶储库(reservoirs)。虽然总体上该执行器被说成是用于扩增和测序核酸，但是没有教导我们在下文描述的分析物降解方法。相反，其涉及完全不同的方式；使用焦磷酸测序观察分析物的互补链的合成。US2009/0280475涉及类似的主题。
生物探针，通常包含已知序列顺序的长度小于1000个核苷酸的单链寡核苷酸，其被广泛用于分析分子生物学。这种探针通常通过在探针和靶标的核苷酸碱基之间存在足够的序列互补性时将其自身连接于靶标(例如源自天然存在的病原体的DNA的靶标)而起作用。通常，这种探针的核苷酸用可检测元件如放射性或荧光标志物标记，以使得当将探针用于处理据信其中或其上已经捕获有靶标的分析物溶液或基板时，通过寻找并检测检测元件的特征检测性质来表明所述靶标存在与否。
此种探针中的一类的代表是本领域中被称为‘分子信标(beacon)’的物质，如例如US8211644中所述的。这些探针由以下构成：已经实际上被回折于其自身上以形成充当探针的感受器的残留的单链环的单链寡核苷酸，和短茎(stem)，其中临近两端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；从而形成双链区域。这种可以比作发夹的布置(其中单链环连接于理论上的双链寡核苷酸的同一端的互补链)是高度应变的。向所述寡核苷酸的3’和5’自由端(现在彼此临近并且在所述茎的远端处)分别连接荧光团和猝灭剂。随后其彼此的几何学接近保证无显著荧光产生。在使用中，靶标结合于单链环，产生额外的应变，以致当加热探针时，所述茎解链，从而导致荧光团和猝灭剂产生距离并使得前者发荧光。
现在，我们已经开发了一种新型测序方法，在一个实施方案中，其包括通过逐步降解分析物产生核苷酸碱基流，其排序表征分析物中的序列；并且随后以使得其能够被检测的方式捕获各核苷酸碱基。
WO94/18218公开了一种基因组测序仪，其中从分析物分离有序的单核苷酸流并且之后将其包含在荧光增强固体基质中，在那里，使用激光激发各核苷酸并且检测其特征光谱发射。该测序仪使用的单核苷酸转移法包括形成流动的不可混溶的液体的单个双鞘(dual-sheath)，而不是一系列小滴。此外，所述测序仪试图直接检测单个核苷酸，而不是使用我们描述的类型的捕获系统和荧光团释放方法。我们相信，这是一个缺点，因为它将导致检测发射时的信噪比问题。这将损害整体灵敏度并且因此有损测序仪本身的实用性。
Stephan等JournalofBiotechnology86(2001)pp.255-267教导了用于计数通过核酸外切降解用荧光团标记的固定的DNA样品而产生的单核苷酸的一般方法。然而未提供关于在产生的不同单核苷酸类型之间进行区分的信息。
已经在http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/happy/HappyGroup/seq.html以图解形式公开了使用逐步核酸外切降解多核苷酸以产生单核苷酸碱基流，但是几乎没有提供关于实际使用的方法学的信息。此外，WO03/080861描述了一种测序方法，其中通过在用智能染料标记的焦磷酸根阴离子的存在下进行焦磷酸解的方式将DNA分析物按顺序降解为有序的单核苷酸流。在一个实例中，焦磷酸根阴离子用染料JF-4标记，所述染料具有不同荧光寿命，这取决于其连接的特定核苷酸类型。然后通过激光激发标记的单核苷酸流并且利用光谱法进行分析，从而确定核苷酸的性质并因此确定核苷酸的排序。再一次，单核苷酸被直接检测，而不是通过使用我们所描述的捕获系统和荧光团释放方法。因此，据信，该方法也会导致信噪比问题并且因此导致灵敏度问题。
根据本发明，因此提供一种用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过焦磷酸解由所述分析物产生单核苷酸碱基流；(2)通过将各单核苷酸碱基与用处于不可检测状态的可检测元件标记的捕获系统反应产生捕获的分子；(3)从各捕获的分子释放处于可检测状态的可检测元件；和(4)检测这样释放的可检测元件并且由其确定核苷酸碱基的序列。
本发明方法的步骤(1)包括通过焦磷酸解由多核苷酸分析物产生单核苷酸碱基流。用于该步骤的分析物适当地是由很多核苷酸碱基构成的双链多核苷酸。原则上，所述多核苷酸的长度可以是不受限的，包括多至在人基因组片段中发现的很多数百万的核苷酸碱基。分析物本身适当地是天然来源的RNA或DNA，但是所述方法也可以用于对合成制备的RNA或DNA或全部或部分由在自然中通常遇不到的核苷酸碱基(即除了腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基)制成的其它核酸进行测序。这些的实例包括4-乙酰基胞嘧啶核苷、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶核苷、2-O-甲基胞嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基-甲基尿嘧啶核苷、二氢尿嘧啶核苷、2-O-甲基假尿嘧啶核苷、2-O-甲基鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、N6-异戊基腺嘌呤核苷、1-甲基腺嘌呤核苷、1-甲基假尿嘧啶核苷、1-甲基鸟嘌呤核苷、1-甲基次黄嘌呤核苷、2,2-二甲基鸟嘌呤核苷、2-甲基腺嘌呤核苷、2-甲基鸟嘌呤核苷、3-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N6-甲基腺嘌呤核苷、7-甲基鸟嘌呤核苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-甲氧基尿嘧啶核苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶核苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷-5-氧基乙酸-甲酯、尿嘧啶核苷-5-氧基乙酸、wybutoxosine、wybutosine、假尿嘧啶核苷、queuosine、2-硫胞嘧啶核苷、5-甲基-2-硫尿嘧啶核苷、2-硫尿嘧啶核苷、4-硫尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、2-O-甲基-5-甲基尿嘧啶核苷和2-O-甲基尿嘧啶核苷。
在本发明的一个实施方案中，步骤(1)包括将多核苷酸分析物连接于基板的第一子步骤。通常，所述基板包括由玻璃或不可降解的聚合物制成的微流体表面，微珠(micro-bead)或可渗透膜。优选地，所述基板还包括适于接收分析物的表面。有很多方式可以将分析物连接于这样的表面，原则上这些都可以被使用。例如，一种方法包括将玻璃表面用官能化的硅烷如环氧硅烷、氨基烃基硅烷或巯基硅烷预先准备好。然后可以将这样产生的反应位点用具有末端胺、琥珀酰基或硫醇基的分析物的衍生物处理。
步骤(1)的一个优选的特征是，将分析物焦磷酸解以产生单核苷酸碱基流，所述单核苷酸碱基流的排序对应于所述分析物的序列。该步骤优选在20至90℃的温度，在包含酶的反应介质存在下进行。优选地，其在非平衡流动情况下进行，使得单核苷酸碱基被连续地从反应区移走。最优选地，通过使得包含酶和其它典型的添加剂的含水缓冲介质连续流经结合有分析物的表面来进行所述反应。
在一个优选的实施方案中，使用的酶是这样的，其能够使得高保真地且以合理的反应速率对分析物进行逐步3’-5’焦磷酸解降解以产生脱氧核糖核苷酸三磷酸。优选地，该降解速率尽可能快，并且在一个实施方案中，落在1至50，优选1至20个核苷酸碱基/秒的范围内。关于用于降解多核苷酸的焦磷酸解反应的更多信息可以例如在J.Biol.Chem.244(1969)pp.3019-3028中找到。优选用于该焦磷酸解反应的酶适当地选自由在所述反应条件下基本上不显示核酸外切或核酸内切酶活性的那些聚合酶组成的组。可以有利地使用的聚合酶的实例包括，但不限于，获自细菌如大肠杆菌(Escherichiacoli)(例如Klenow片段聚合酶)，水生栖热菌(Thermusaquatics)(例如TaqPol)和嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)，热速芽孢杆菌(Bacilluscaldovelox)和热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)的原核pol1酶或酶衍生物。适当地，所述焦磷酸解降解在还以优选毫摩尔浓度包含焦磷酸根阴离子和镁阳离子的介质存在下进行。
在本发明方法的步骤(2)中，步骤(1)中产生的各单核苷酸碱基被自身包含核苷酸碱基的寡聚物的捕获系统捕获。优选地，在进行该步骤之前，将包含单核苷酸碱基的水性介质用焦磷酸酶处理以将任何残留的焦磷酸根水解为磷酸根阴离子。
在第一实施方案中，所述捕获系统包含一类第一和第二寡核苷酸对中的一种。这种对中的第一寡核苷酸优选包含(a)第一双链区域和(b)第二单链区域，所述第二单链区域由n个核苷酸碱基构成，其中n大于1，优选大于5。在一个亚类中，所述第一寡核苷酸被认为具有源自概念上的或实际上的单链寡核苷酸前体的分子结构，其中双链区域通过将前体的3’端部分回折于其自身上从而产生可以被称为“j形”的构型而形成。在另一个亚类中，第一寡核苷酸通过以下方式产生：将第三、较短的单链寡核苷酸杂交在较长的第四单链寡核苷酸的3’端上并随后借助保护基团(其例如将两条链的最后的核苷酸桥接)使得得到的双链分子‘钝化’。通常，第一寡核苷酸的总长多至150个核苷酸碱基，优选20至100个核苷酸碱基。同时，优选的是，整数n为5至40，优选10至30。
关于所述对中的第二寡核苷酸，这是单链的并且适当地具有与始于超过双链区域末端的一个核苷酸碱基的第一寡核苷酸的单链区域的核苷酸碱基序列完全或部分互补的核苷酸碱基序列。第二寡核苷酸的长度不重要并且可以长于或短于它可以结合的单链区域，但是其长度优选不是n-1个核苷酸碱基。更优选地，选择第二寡核苷酸的长度，以使得在捕获的分子中，在其两条链中的一条或另一条上仍然有短的未配对核苷酸碱基的突出(例如2至10个核苷酸碱基)。优选地，在这种类型中，可检测元件位于第二寡核苷酸上。该类型的捕获系统通过将单核苷酸碱基连接于第一寡核苷酸的双链末端并且将第二寡核苷酸杂交到剩余的单链区域上以产生捕获的分子(除了其突出之外，其是双链的)来产生作用。
在第二实施方案中，所述捕获系统包含一类单寡核苷酸，其各自由单链核苷酸区域组成，所述单链核苷酸区域的末端连接于两个不同的双链区域。在这种类型的捕获系统中，所述单链核苷酸区域由仅使得探针对靶标(即所述小滴流中的互补单核苷酸碱基)的检测极具选择性的一个核苷酸碱基构成。
来看双链寡核苷酸区域，优选的是，其源自或可源自各自优选为闭环的两个寡核苷酸前体，或通过以下方式源自或可通过以下方式源自共同的单链寡核苷酸前体：将后者的末端回折于其自身上而产生两个闭环的寡核苷酸碱基区域，其中中间的缺口构成单链核苷酸区域。在所有的情况中，效果相同；邻近单链核苷酸区域末端的将是寡核苷酸区域的另一条链上的3’和5’自由端，其可以连接靶标的相应的5’和3’端。因此所述捕获系统的使用包括这样的步骤：通过结合捕获系统的可用的3’和5’端，将单链核苷酸区域连接于靶单核苷酸碱基，以产生捕获的分子，所述捕获的分子沿其整个长度是双链的。
适当地，所述双链寡核苷酸区域的长度多至50个核苷酸碱基对，优选地多至45个核苷酸碱基对，更优选为5至40个核苷酸碱基对并且最优选为10至30个。可以使用更长的区域，但靶标接近单链核苷酸区域的潜在风险可能由于缠结而变得受限。这使得该实施方案可能不那么有吸引力。
在这种类型中，优选的是，与双链寡核苷酸区域结合的可检测元件位于远离单链核苷酸区域处。最后，在一个实施方案中，优选的是，双链寡核苷酸区域中的至少一个包含至少一个限制性内切酶识别位点，所述位点优选与可检测元件定位或集中的区域相邻。对于这些捕获系统，通过首先限制性内切酶呈现核酸内切作用并且使双链在捕获的分子中在上述位点处被切割而出现荧光团的释放。然后这样产生的短片段可以由核酸外切酶进一步降解为单核苷酸，所述单核苷酸中至少一些将标记有荧光团。因此，当捕获的分子包含多个荧光团时，这导致荧光团的级联释放，所述荧光团由于其现在彼此分离和/或与它们关联的猝灭剂分离而在现在以正常方式自由发荧光。这种限制性内切酶识别位点通常包含2至8个核苷酸对的特定序列。在另一个优选的实施方案中，所述限制性内切酶识别位点将是通过将单核苷酸与单链核苷酸区域结合而产生的位点。
对于上文提到的两种类型，优选使用不同的至少两组捕获分子的混合物，所述捕获分子各自对不同的互补核苷酸碱基具有选择性并且各自使用不同的可检测元件。这些可以来自相同或不同类型。在优选的实施方案，各组捕获分子将具有不同的相关的可检测元件，使得当最终检测到相应的检测性质时，可以唯一地鉴定核苷酸碱基。例如，当分析物是DNA或RNA时，最优选使用四种不同的捕获系统，每一种对这些分子的不同的特征性核苷酸碱基具有选择性。
本发明的所有捕获系统的进一步特征是，它们标记有多个在捕获系统处于未使用状态时基本上不可检测的可检测元件。适当地，这些可检测元件是适于通过光学事件检测的可检测元件。在一个优选的实施方案中，所述可检测元件包括荧光团并且各未使用的捕获系统在被设计为用于检测所述荧光团的那些波长处基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可能呈现跨电磁谱的一个宽的部分的整体的、低水平的背景荧光，但是通常将存在荧光强度处于最大值的一个或少数特定波长或波长包络(envelopes)。在荧光团被特征性检测的这些最大值中的一个或多个处，荧光基本上不应该发生。在本专利的语境中，术语‘基本上不发荧光’或等效用词意为，与第二寡核苷酸连接的全部荧光团在相关特征波长或波长包络处的荧光强度小于相等数量的自由荧光团的相应荧光强度的25％；优选小于10％；更优选小于1％并且最优选小于0.1％。
原则上，任何方法可以用于保证在捕获系统的未使用状态下，荧光团基本不发荧光。一种方式是在与其紧临处额外地连接猝灭剂。另一种是基于这样的观察，即当多个荧光团彼此紧邻地连接于捕获系统时，它们倾向于使得彼此充分猝灭，以致可以在不需要猝灭剂的情况下实现前一段所述的标准。在本专利的语境中，什么构成荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的‘紧邻’将取决于使用的特定荧光团和猝灭剂并且可能取决于单个寡核苷酸的结构特征。因此，有意的是，根据所需结果而不是关于捕获系统的各种元件的任何特定结构布置来理解该术语。然而并且仅为了提供例证，要指出的是，当相邻的荧光团或相邻的荧光团和猝灭剂被分开以对应于特征距离(通常小于5nm)的距离时，通常将实现充分的猝灭。
适当地，捕获系统用多至20个，例如多至10个并且最优选多至5个荧光团标记。为了获得最大优势，优选的是，捕获系统被标记以至少2个优选至少3个荧光团。因此，本文中特别地预期由这些最大值和最小值的任意排列构成的范围。如果使用猝灭剂，同样优选的是，捕获系统被标记以多至20个，优选多至10个并且最优选多至5个猝灭剂标记。虽然预期可以将超过一个类型的荧光团连接于捕获系统，例如用以给予其特征指纹，但是优选的是用于各捕获系统类型中的所有荧光团都是相同。
就荧光团自身而言，它们原则上可以从本领域中常规使用的那些中的任一种中选择，其包括但不限于呫吨部分例如荧光素，罗丹明和它们的衍生物比如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明B等；香豆素部分(例如羟基-、甲基-和氨基香豆素)和花青部分比如Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。具体实例包括从以下常规使用的染料衍生的荧光团：Alexa染料、花青染料、AttoTec染料和罗丹明染料。实例还包括：Atto633(ATTO-TECGmbH)、德克萨斯红(TexasRed)、Atto740(ATTO-TECGmbH)、RoseBengal、AlexaFluorTM750C5-马来酰亚胺(Invitrogen)，AlexaFluorTM532C2-马来酰亚胺(Invitrogen)和罗丹明红C2-马来酰亚胺和罗丹明绿以及亚磷酰胺染料比如Quasar570。备选地，可以使用量子点或近红外染料如由LI-CORBiosciences提供的那些。荧光团通常使用本领域已知的化学方法经核苷酸碱基连接于第二寡核苷酸。
合适的猝灭剂是通过共振能量转移(FRET)机制起作用的那些。可市购的可以与以上提及的荧光团联合使用的猝灭剂的实例包括但不限于DDQ-1、Dabcyl、Eclipse、IowaBlackFQ和RQ、IRDye-QC1、BHQ-0、BHQ-1、-2和-3以及QSY-7和-21。
步骤(2)适当地通过将所述流中的单核苷酸碱基与捕获系统，最优选上文提及的多组分捕获系统，在30至80℃的温度，在包含第二聚合酶和连接酶的两组分酶系统的存在下接触而实现。在优选的实施方案中，第二聚合酶与步骤(1)中使用的相同，从而避免将该酶以额外成分的形式添加。
在本发明方法的步骤(3)中，通过核酸外切酶的作用或聚合酶的核酸外切酶活性，可检测元件以可检测的形式从捕获的分子释放。这样做时，重要的是，未使用的捕获分子组中的任一个中存在的荧光团不同时释放。在第一类捕获系统的情况下，这可以例如通过使用具有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶来根据其单链突出区域降解捕获的分子来实现。备选地，并且特别是在第二类捕获系统的情况下，这可以通过在捕获系统或捕获的分子中优选在临近可检测元件定位或集中的区域处结合至少一个限制性内切酶识别位点来实现。这样的限制性内切酶识别位点通常包含2至8个核苷酸对的特定序列。在该方法的优选的实施方案中，所述限制性内切酶识别位点可以是通过将单核苷酸碱基结合于捕获系统而形成的限制性内切酶识别位点。
步骤(3)还适当地在30至80℃的温度进行。可以用于该步骤的核酸外切酶或聚合酶的适当实例包括Phusion、PhusionHS、DnaseI(无RNase)、核酸外切酶I或III(exE.coli)、核酸外切酶T、核酸外切酶V(RecBCD)、λ核酸外切酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶(MungBeanNuclease)、核酸酶BAL-31、RecJf、T5核酸外切酶和T7核酸外切酶。步骤(3)的净效应是，捕获的分子的组成核苷酸碱基将被释放，其中一些将被特征可检测元件标记。因此，当捕获的分子包含多个猝灭的荧光团时，这导致释放的荧光团的‘级联’，由于它们变得彼此分开和/或与相关的猝灭剂分开，现在自由地以正常方式发荧光。
之后，并且在步骤(4)中，检测从降解的捕获的分子释放的可检测元件，鉴定特定单核苷酸碱基并且由与检测相关的数据流恢复分析物中的核苷酸碱基的序列。这样做的方法是本领域中公知的；例如荧光可以使用调至各种荧光团的特征荧光波长或波长包络的光检测器或等效装置来检测。这相应导致光检测器产生表征特定核苷酸碱基类型的电信号，该电信号可以被处理并且随后分析。
在尤其优选的实施方案中，本发明的方法完全或部分以微滴进行。这种方法可以例如始于将步骤(1)中产生的单核苷酸碱基逐一插入到在可混溶的载体溶剂(如烃或硅油)中的含水微滴的相应的流中以帮助保持排序。有利地，这可以通过在焦磷酸解反应区的下游直接产生微滴(例如通过使得反应介质从合适尺寸的微滴头出来到流动的溶剂流中)而实现。备选地，可以顺序地将小等分试样的反应介质注射入溶剂中悬浮的已存在的含水微滴流中。如果采用后一方式，各微滴可以适当地含有捕获系统的各种组分和酶以及实现步骤(2)和(3)所需的任何其他试剂(例如缓冲剂)。最后，可以使得在前一实施方案中产生的微滴随后与这种已存在的微滴流合并，从而实现类似的结果。在该实施方案中，步骤(4)则优选包括检查各小滴以相应鉴定释放的可检测元件并且因此鉴定其包含的核苷酸碱基的性质。
为了避免给定微滴包含多于一种单核苷酸碱基的风险，优选在步骤(1)中以使得各填充的微滴间隔以1至20个、优选2至10个空微滴的速率释放单核苷酸碱基。之后，使得溶剂中填充和未填充的微滴的流沿流动路径(适当地为微流体流动路径)，以使得微滴保持离散状态并且没有机会彼此合并的速率和方式流动。适当地，使用的微滴的直径小于100微米，优选小于50微米，更优选地小于20微米，并且甚至更优选小于15微米。所有其直径中，最优选的是在2至20微米范围内。在一个实施方案中，微滴经过整个系统的流速为50至3000滴/秒，优选为100至2000滴/秒。
上文所述的方法可以用于在测序装置中有利并且预期这种装置在本发明的范围内。
现在将参考以下实施例说明本发明。
捕获系统的制备和使用
以下实验说明使用捕获系统捕获单核苷酸碱基和释放荧光团，其中第一寡核苷酸是j形的并且第二寡核苷酸是单链的。
上文所述的j形寡核苷酸的样品通过折叠具有以下序列的75个核苷酸碱基的单链寡核苷酸来制备：
gtaggtcctggcacagaaaaaaggagGcagtgatgttccatgactgatttttttttcagtcatggaacatcact*g
其中g、t、c和a表示DNA核苷酸碱基的常规符号并且*表示存在硫代磷酸酯连接。通过将该寡核苷酸的水溶液加热到95℃并且随后将其以10分钟/℃的速率缓慢冷却回室温来进行折叠。这样获得的j形分子包含与作为捕获位点的单核苷酸碱基(在上述序列中被大写)连接的残留的单链寡核苷酸区域(gtaggtcctggcacagaaaaaaggag)。
还制备相应的单链寡核苷酸，其具有以下序列：
^ctccTTXTTtctgtgccaga
其中^表示5'磷酸基团，大写的T表示经由叠氮化物接头用AlexaFluor488染料标记的胸腺嘧啶碱基，并且X表示用BHQ-0猝灭剂标记的胸腺嘧啶碱基。
随后制备分开的捕获和核苷酸碱基混合物。捕获混合物具有与源自以下配方的组成相对应的组成：
2.5ul10xBufferII
5ul10xTaq连接酶缓冲液(NEB)
2.5ul100nM的上述j形分子
5ul100nM的上述单链寡核苷酸
2ul热稳定的无机焦磷酸酶(NEB)
5ulTaq连接酶(NEB)
1ul25mMMnSO4
加水至25ul
同时，获自焦磷酸解步骤的，其组成被设计为模拟所述材料的核苷酸碱基混合物，对应于源于以下配方的混合物：
2.5ul10BufferII(补充以Amplitaq；不含镁)
1.5ulMgCl225mM
2.5ul10nM的脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)
2ulAmplitaq(5U/ul)
2.5ul10mM焦磷酸钠
加水至25ul。
然后通过将等体积的这两种混合物混合在一起并且将得到的产物在50℃孵育来实现dCTP的捕获。这通常用30分钟完成。在该时间的最后，将混合物的样品(50ul)用1ulHotStartPhusionDNA聚合酶(NEB)处理并在98℃x20s活化，使得可以发生完全的捕获分子的核酸外切降解。降解通常在30分钟内完成，并且可以通过在峰吸收波长(496nm)处或附近照射样品，并且在特征发射波长(519nm)处检测产生的荧光来检测释放的荧光团。
图2使用放射性标记的核苷酸和凝胶电泳来显示该反应随时间的结果。在j-形寡核苷酸上的放射性标记的核苷酸的捕获在反应的头2分钟内发生，单链寡核苷酸的连接在头30分钟发生。在该实验中，在t＝30分钟时加入Phusion聚合酶，并且可以看到，完全的捕获分子被快速消化(在该情况下，消化在加入聚合酶的30秒内发生)。
图3显示在存在(虚线)或不存在(实线)核苷酸的情况下进行的完全反应的作为时间的函数测量的荧光。在该实验中，聚合酶在t＝20分钟时被热活化。对于在存在核苷酸的情况下进行的反应，观察到荧光的显著增加，而在缺少其的情况下，几乎观察不到或观察不到荧光增加。
使用捕获系统的小滴微流体方法
图1显示微流体测序装置，其中使得微滴流(其中至少一些含有单核苷酸碱基)与上述第一类型的捕获系统进行反应。
使得包含通过对源于人DNA的100个核苷酸碱基的多核苷酸分析物进行逐步焦磷酸解获得的分离的脱氧核糖核苷酸三磷酸流的水性介质1流过由PDMS聚合物制成的十微米直径的微流体管。焦磷酸解反应自身通过以下方式进行：在72℃，使含有TaqPol和2毫摩尔/升浓度的焦磷酸钠和氯化镁中的每种的含水的缓冲的(pH8)反应介质流通过之前已经通过琥珀酰基桥将分析物连接于其上的玻璃微珠。微珠下游的流1中单核苷酸碱基的顺序对应于分析物的序列。1从小滴头2中出来进入第一室3，在那里，其与一个以上不可混溶的轻硅油流4接触。选择这些流的速度以避免湍流混合并且用以在3中产生悬浮在油中的水性球形小滴5，其各自具有大约八微米的直径。通常，调节焦磷酸解的速率和/或1的流速以使得在相邻的填充的小滴之间有10个空的小滴。随后，使5的流沿具有相同直径的第二微流体管以1000滴/秒的速率前进至第二室6，第二个五微米水性球形小滴7的流通过第二小滴头8进入第二室6中。使得小滴5和7以连续的方式合并，从而形成直径约九微米的放大的水性小滴9。7中的每个含有焦磷酸酶用以破坏存在于5中的每个中的任何残留的焦磷酸根阴离子。
然后9的流以相同速率前进，通过微流体管道，进入第三室10，在那里，这些小滴与通过相应小滴头12同样进入其中的第三个五微米水性球形小滴11的流相接触。9中的每个在室6和10之间移动所需的时间为大约2分钟。
随后使得小滴9和11在10中合并，从而产生小滴13(直径大约十微米)。11中的每个包含嗜温连接酶和包含四对j-形的第一寡核苷酸和四个相应的第二单链寡核苷酸的捕获系统。在该实例中，各j形的第一寡核苷酸的长度为60个核苷酸碱基并且通过以下方式制备：绕自5’末端起第45个核苷酸碱基折叠60个核苷酸碱基的单链寡核苷酸前体，以产生3核苷酸碱基单链环，12核苷酸碱基对双链区域和33核苷酸碱基单链区域。这四种第一寡核苷酸中的每一个具有以DNA的四种特征核苷酸碱基类型(即A、T、G和C)为特征的不同的第33个碱基(从单链末端测量的)。所述四种不同的第二寡核苷酸各自的长度为28个核苷酸碱基并且具有与由其第一寡核苷酸对的第4和第32个核苷酸碱基限定的单链区域的部分互补的序列。所述四种不同的第二寡核苷酸类型分别用荧光团Quasar570、荧光素、德克萨斯红(TexasRed)和Cy-5标记(每个第二寡核苷酸五个荧光团部分)。在各情况下，通过在各第二寡核苷酸上包括一个猝灭剂部分(对于Quasar570和TexasRed为BHQ-2，对于荧光素为BHQ-0并且对于花青-5为BHQ-3)来猝灭荧光。
13的流接着以相同速率前进，经微流体管进入第四小室14，在那里，使其与通过小滴头16同样进料入其中的第四个五微米水性球形小滴15的流合并。9中的每个在两个小室之间移动所耗时间为30分钟，在该时间内，单核苷酸碱基被其捕获系统对捕获，并且形成捕获的分子。15中的每个含有Phusion核酸外切酶以降解捕获分子和释放可检测形式的相关荧光团。随后合并的微滴17的流前进至容器18，其中它们的前进被追踪，直到它们到达位点19a的阵列中的一个，其中它们被保持在19b，直到分析它们的时候。
2小时后，依次并以正确的顺序，利用一个或多个高强度光源，例如以荧光团的相关频率发出相干光的一个或多个激光器照射保持在阵列中的各小滴，并且这样产生的荧光由在所述四种荧光团类型的那些特征性波长运转的光检测器检测。由接收的信息，鉴定各小滴中的单核苷酸碱基，并且抛弃来自空的小滴的零响应。随后通过被编程为重现分析物的原核苷酸碱基序列的计算机处理结果。如果需要，可以以不同间隔对整个小滴阵列进行多个循环的照射和检测，可以将其平均从而改善单噪比并且因此改善结果的可信度。

Claims (24)

1.用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过焦磷酸解从所述分析物产生单核苷酸碱基流；(2)通过将各单核苷酸碱基与标记有处于不可检测状态的可检测元件的捕获系统反应来产生捕获的分子；(3)从各捕获的分子释放处于可检测状态的所述可检测元件；和(4)检测这样释放的可检测元件并且由其确定核苷酸碱基的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获系统由两个组分构成；(a)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含双链区域和单链区域，和(b)第二单链寡核苷酸，所述第二单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列与所述第一寡核苷酸的单链区域的核苷酸碱基序列至少部分互补。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获系统包含单个寡核苷酸，所述单个寡核苷酸包含单链核苷酸区域，所述单链核苷酸区域的末端与两个不同的双链寡核苷酸区域连接。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸分析物结合于表面。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述酶在步骤(1)的反应条件下不呈现核酸外切酶或核酸内切酶行为。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)在包含所述酶、焦磷酸根阴离子和镁阳离子的流动水性介质的存在下在非平衡条件下进行，并且其中所述单核苷酸碱基被连续地从产生它们的反应区处移走。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和(2)之间，通过焦磷酸酶破坏任何残留的焦磷酸根阴离子。
8.根据权利要求2和4至7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述第一寡核苷酸是j形的。
9.根据权利要求2和4至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸的总长为20至100个核苷酸碱基。
10.根据权利要求2和4至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二寡核苷酸中的可检测元件是已被至少一种猝灭剂猝灭的荧光团。
11.根据权利要求2和4至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获系统包含四种不同的第一寡核苷酸类型，所述四种不同的第一寡核苷酸类型具有四种不同序列的单链区域，并且其中临近各第一寡核苷酸类型中的单链区域上的双链区域的核苷酸碱基是DNA或RNA特征性的四种核苷酸碱基类型的不同的一个。
12.根据权利要求2和4至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获系统包含四种不同的第二寡核苷酸类型，所述四种不同的第二寡核苷酸类型各自具有与所述四种不同的第一寡核苷酸中的四种不同的单链区域中的一个的部分互补的序列并且各自用不同的可检测元件标记。
13.根据权利要求2和4至12中任一项所述的方法，其特征在于，各第二寡核苷酸类型用在不同的波长发荧光的不同的荧光团标记。
14.根据权利要求3和4至7中任一项所述的方法，其特征在于，各双链寡核苷酸区域由10至30个核苷酸对构成。
15.根据权利要求3、4至7和14中任一项所述的方法，其特征在于，双链寡核苷酸区域中的多至10个核苷酸对用荧光团标记。
16.根据权利要求3、4至7和14至15中任一项所述的方法，其特征在于，双链寡核苷酸区域中的多至10个核苷酸对用猝灭剂标记。
17.根据权利要求3、4至7和14至16中任一项所述的方法，其特征在于，使用两个分离的双链寡核苷酸区域，其各自包含远离闭环的单链核苷酸区域的末端。
18.根据权利要求3、4至7和14至17中任一项所述的方法，其特征在于，所述双链寡核苷酸区域能够通过将末端回折于其自身上而留下包含所述单链核苷酸区域的缺口而来源于单链寡核苷酸前体。
19.根据权利要求3、4至7和14至18中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获系统包含至少一个限制性内切酶识别位点。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶识别位点通过将所述单核苷酸连接于所述捕获系统而产生。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，使用核酸外切酶或聚合酶的核酸外切酶活性从所述捕获分子释放所述可检测元件。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括检测由所述荧光团发出的荧光。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)至(4)中的至少一个在微滴的流中进行。
24.用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的装置，其特征在于，其适于使用根据前述权利要求中任一项所述的方法。
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