CN105121663A - 用于核酸扩增的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于扩增和分析核酸样品的方法和系统。

Description

用于核酸扩增的方法和系统

交叉引用

本申请要求2013年12月25日提交的第PCT/CN2013/090425号专利合作条约申请的优先权，所述申请出于全部目的通过引用以整体并入本文。

背景技术

核酸扩增方法允许从复杂混合物如生物样品中有选择地扩增和鉴定感兴趣的核酸。为了检测生物样品中的核酸，通常对生物样品进行处理，以从生物样品的其他组分和其他可能干扰核酸和/或扩增的其他物质中分离出核酸。在从生物样品中分离出感兴趣的核酸之后，可通过例如本领域已知的扩增方法，如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(PCR))，对感兴趣的核酸进行扩增。在扩增感兴趣的核酸之后，可以检测扩增产物，并由最终用户解读检测结果。然而，在核酸扩增之前从生物样品中提取核酸可能是费时的，从而导致该过程在整体上的时间效率降低。

照护点(POC)检测具有在实验室基础设施较差的资源受限的条件下或者在接收实验室结果延迟及对患者进行随访可能较复杂的偏远地区提升传染病的检测和处置的潜力。POC检测也能够使现有水平的卫生保健设施更加能够在单次访视期间为患者提供样品-反馈(sample-to-answer)结果。然而，POC方法和装置的低效限制了能够实现的目标。例如，从复杂样品类型(例如，生物样品)制备核酸(例如，病原体的核酸)需要熟练技术人员在专门的实验室空间中手动执行多个处理步骤及后续的检测，因此往往在几小时甚至几天之后才能出具结果的报告。

因此，需要用于分析来自复杂样品类型的核酸的快速、准确的方法和装置。此等方法和装置例如可用于实现可经由其核酸而检测的疾病的快速样品-反馈检测和处置。

发明内容

本发明提供了用于核酸如RNA和DNA分子的高效扩增的方法和系统。可快速且高灵敏度地检测所扩增的核酸产物。

在一个方面，本发明提供了一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对靶RNA的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶RNA。在另一实施方案中，该方法包括：(a)接收已从受试者获得的生物样品；(b)提供包含生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对靶RNA的引物组；(c)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(d)检测(c)的扩增DNA产物的量；及，将关于扩增DNA产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。在一些实施方案中，该时间量小于或等于20分钟，小于或等于10分钟，或者小于或等于5分钟。

在一些实施方案中，所述试剂进一步包含报告剂，该报告剂产生指示存在扩增DNA产物的可检测信号。在一些实施方案中，可检测信号的强度与扩增DNA产物或靶RNA的量成比例。在一些实施方案中，该报告剂是染料。在一些实施方案中，引物组包含一条或多条引物。在一些实施方案中，引物组包含用于产生与靶RNA互补的链的第一引物。在一些实施方案中，引物组包含用于产生与DNA产物互补的链的第二引物，该DNA产物与靶RNA的至少一部分互补。在一些实施方案中，靶RNA为病毒RNA。在一些实施方案中，该病毒RNA对于受试者是致病性的。在一些实施方案中，该病毒RNA选自HIVI、HIVII、埃博拉病毒、登革病毒、正粘病毒、肝炎病毒(hepevirus)，和/或甲型、乙型、丙型(例如，具甲的RNA-HCV病毒)、丁型和戊型肝炎病毒。

在一些实施方案中，所述反应容器包括主体和盖。在一些实施方案中，该盖是可移除的。在一些实施方案中，该反应容器采取移液管头(pipettetip)的形式。在一些实施方案中，该反应容器是反应容器阵列的一部分。在一些实施方案中，该反应容器阵列的反应容器部分可被液体处理装置单独寻址。在一些实施方案中，该反应容器包含两个或更多个热区(thermalzone)。在一些实施方案中，该反应容器是密封的，任选地是气密密封的。

在一些实施方案中，变性温度为约90℃至100℃，或约92℃至95℃。在一些实施方案中，延伸温度为约35℃至72℃，或约45℃至65℃。在一些实施方案中，变性持续时间少于或等于30秒。在一些实施方案中，延伸持续时间少于或等于30秒。

在一些实施方案中，在提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器前，靶RNA未经历浓缩。在一些实施方案中，当提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器时，生物样品未经历RNA提取。在一些实施方案中，该方法进一步包括在提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器之前或期间向该反应容器中加入裂解剂的步骤。在一些实施方案中，该裂解剂包含缓冲液。在一些实施方案中，在引物延伸反应的一个或多个循环期间，靶RNA从生物样品中释放。

在一些实施方案中，所述生物样品是来自受试者的生物流体。在一些实施方案中，该生物样品选自呼出气、血液、尿液、粪便、唾液、脑脊液和汗液。

在一些实施方案中，DNA扩增经由聚合酶链反应进行。在一些实施方案中，该聚合酶链反应是巢式聚合酶链反应。在一些实施方案中，DNA扩增是线性扩增。在一些实施方案中，该扩增以小于50、小于40、小于30、小于20、小于10或小于5的循环阈值(Ct)产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物。在一些实施方案中，该扩增在30分钟或更短、20分钟或更短或者10分钟或更短的时段产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物。在一些实施方案中，该扩增不是基于乳液的。

在一些实施方案中，所述接收者是进行治疗的医师、制药公司或受试者。在一些实施方案中，使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物进行30个循环或更少，20个循环或更少，或者10个循环或更少。在一些实施方案中，检测是光学检测、静电检测或电化学检测。在一些实施方案中，该方法包括提供包含生物样品和对于进行逆转录扩增和脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器。

在一些实施方案中，所述信息作为报告而输出。在一些实施方案中，该报告是电子报告。在一些实施方案中，该信息输出至电子显示器。

在另一方面，本发明提供了一种扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的方法。该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在生物样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

在一些实施方案中，靶核酸是核糖核酸。在一些实施方案中，所述试剂对于与脱氧核糖核酸扩增平行地进行逆转录扩增是必需的。在一些实施方案中，扩增产物是扩增的脱氧核糖核酸产物。在一些实施方案中，生物样品在(a)中未经纯化。在一些实施方案中，该方法进一步包括使靶核酸在(b)之前经受一个或多个变性条件。在一些实施方案中，该一个或多个变性条件选自变性温度分布(profile)和变性剂。

在一些实施方案中，将生物样品稀释。这可能有助于使抑制最小化。在一些实施方案中，将生物样品浓缩。这可能有助于提高或以其他方式改善灵敏度。

在一些实施方案中，该方法进一步包括使靶核酸在多个系列的引物延伸反应的第一系列与第二系列之间经受一个或多个变性条件。在一些实施方案中，就变性温度与延伸温度之间的斜变速率(rampingrate)、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个、至少任意两个、至少任意三个或至少任意四个而言，各单个系列存在不同。在一些实施方案中，就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间而言，各单个系列存在不同。

在一些实施方案中，所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，第一系列包括超过10个循环，第一系列的每个循环包括(i)在约92℃-95℃下孵育反应混合物不超过30秒，随后(ii)在约35℃-65℃下孵育反应混合物不超过1分钟，第二系列包括超过10个循环，第二系列的每个循环包括：(i)在约92℃-95℃下孵育反应混合物不超过30秒，随后(ii)在约40℃-60℃下孵育反应混合物不超过1分钟。

在一些实施方案中，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。在一些实施方案中，该方法进一步包括，在(b)之前，将生物样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟、2分钟或1分钟的预加热时间。在一些实施方案中，预加热温度为92℃至95℃。在一些实施方案中，预加热持续时间不超过约30秒。

在另一方面，本发明提供了一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的系统。在一个实施方案中，该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对靶RNA的引物组；及，使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶RNA；及(c)可操作地耦合至扩增模块的输出模块，其中该输出模块将关于靶RNA或DNA产物的信息输出至接收者。

在另一实施方案中，该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：(i)在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含已从受试者获得的生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂，该试剂包含：(1)逆转录酶，和(2)针对靶RNA的引物组；及(ii)使该反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(iii)检测(iii)的扩增DNA产物的量；及(iv)将关于扩增DNA产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(i)-(iv)的时间量小于或等于约30分钟；及(c)可操作地耦合至扩增模块的输出模块，其中该输出模块将信息传送至接收者。在一些实施方案中，该输出模块是电子显示器。在一些实施方案中，该电子显示器包含用户界面。在一些实施方案中，该输出模块是可操作地耦合至计算机网络的通信接口。

在另一方面，本发明提供了一种用于扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统。该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂，该试剂包含(i)DNA聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及，使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在生物样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列；及(c)可操作地耦合至扩增模块的输出模块，其中该输出模块将关于核酸或扩增产物的信息输出至接收者。

在另一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，该机器可执行代码在被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对靶RNA的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将该反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将该反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶RNA。

在另一实施方案中，该方法包括：(a)接收已从受试者获得的生物样品；(b)提供包含生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，和(ii)针对靶RNA的引物组；(c)使该反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(d)检测(c)的DNA产物的量；及(e)将关于DNA产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。

在另一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，该机器可执行代码在被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)DNA聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以自靶核酸生成扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

本发明的另一方面提供了一种用于扩增从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统。该系统可包括电子显示屏，该电子显示屏包含显示图形元素的用户界面，该图形元素可被用户访问，以执行用以扩增生物样品中的靶核酸的扩增方案。该系统也可包括计算机处理器，该计算机处理器耦合至电子显示屏，并且被编程为在用户选择图形元素时执行该扩增方案。该扩增方案可包括使包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在生物样品中存在靶核酸的扩增产物。每个系列的引物延伸反应可包括两个或更多个如下的循环：在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物。就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列可不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

在一些实施方案中，所述扩增方案可进一步包括为靶核酸选择引物组。在一些实施方案中，所述试剂可包含脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、任选的逆转录酶和针对靶核酸的引物组。在一些实施方案中，所述用户界面可以显示多个图形元素。每个图形元素可以与多个扩增方案中的给定扩增方案相关联。在一些实施方案中，每个图形元素可以与疾病相关联。所述多个扩增方案中的给定扩增方案可指向测定受试者中疾病的存在。在一些实施方案中，该疾病可与病毒如例如RNA病毒或DNA病毒相关联。在一些实施方案中，该病毒可选自人免疫缺陷病毒I(HIVI)、人免疫缺陷病毒II(HIVII)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒和水痘病毒。在一些实施方案中，该流感病毒可选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。在一些实施方案中，该腺病毒可以是55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。在一些实施方案中，该丙型肝炎病毒可以是具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。在一些实施方案中，该疾病可与致病细菌(例如，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))或致病原生动物(例如，疟原虫(Plasmodium))相关。

在一些实施方案中，所述靶核酸可与疾病相关。在一些实施方案中，所述扩增方案可指向基于扩增产物的存在而测定疾病的存在。在一些实施方案中，该疾病可以与病毒如例如RNA病毒或DNA病毒相关。在一些实施方案中，该病毒可选自人免疫缺陷病毒I(HIVI)、人免疫缺陷病毒II(HIVII)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒和水痘病毒。在一些实施方案中，该流感病毒可选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。在一些实施方案中，该腺病毒可以是55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。在一些实施方案中，该丙型肝炎病毒可以是具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。在一些实施方案中，该疾病可以与致病细菌(如，结核分枝杆菌)或致病原生动物(例如疟原虫)相关。

根据下面的详细描述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见，其中仅示出和描述了本发明的说明性实施方案。将会认识到，本公开内容能够包括其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在多个明显的方面进行更改，所有这些都不背离本公开内容。相应地，附图和描述将自然被视为是说明性的，而非限制性的。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图(在本文中也称作“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1为描绘了示例性系统的示意图。

图2A和2B为描绘了实施例1所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图3A和3B为描绘了实施例1所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图4A和4B为描绘了实施例2所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图5为描绘了实施例3所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图6A和6B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图7A和7B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图8A和8B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图9A和9B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图10A和10B为描绘了实施例4所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图11为描绘了实施例5所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图12为描绘了实施例5所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图13为描绘了实施例7所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图14为描绘了实施例9所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图15A和15B为描绘了实施例10所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图16A和16B为描绘了实施例10所述的示例性核酸扩增反应的结果的图。

图17为描绘了实施例11所述的核酸扩增反应的结果的图。

图18为描绘了实施例12所述的核酸扩增反应的结果的图。

图19A和图19B为描绘了实施例13所述的核酸扩增反应的结果的图。

图20为描绘了实施例14所述的核酸扩增反应的结果的图。

图21为描绘了实施例15所述的核酸扩增反应的结果的图。

图22A和图22B为描绘了实施例17所述的核酸扩增反应的结果的图。

图23A、图23B和图23C为描绘了实施例18所述的核酸扩增反应的结果的图。

图24A和图24B为描绘了实施例19所述的核酸扩增反应的结果的图。

图25A和图25B为描绘了实施例19所述的核酸扩增反应的结果的图。

图26A和图26B为描绘了实施例20所述的核酸扩增反应的结果的图。

图27为描绘了实施例21所述的核酸扩增反应的结果的图。

图28A为具有示例性用户界面的示例性电子显示的示意图。

图28B为具有示例性用户界面的示例性电子显示的示意图。

发明详述

虽然在本文中已示出并描述了本发明的各个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

如在本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的引用物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所使用的，术语“扩增(amplifying)”和“扩增(amplification)”可互换使用，并且通常指生成核酸的一个或多个拷贝或“扩增产物”。术语“DNA扩增”通常指生成DNA分子的一个或多个拷贝或“扩增的DNA产物”。术语“逆转录扩增”通常指经逆转录酶的作用从核糖核酸(RNA)模板生成脱氧核糖核酸(DNA)。

如本文所使用的，术语“循环阈值”或“Ct”通常指热循环过程中的循环，在该循环中由于扩增产物而导致的可检测信号的增加达到统计学显著的高于背景信号的水平。

如本文所使用的，术语“变性(denaturing)”和“变性(denaturation)”可互换使用，并且通常指双链核酸的螺旋结构的完全或部分解旋，并且在一些情况下指单链核酸的二级结构的解旋。变性可包括病原体细胞壁或病毒外壳的失活，以及抑制剂蛋白质的失活。可发生变性的条件包括“变性温度”和“变性持续时间”，“变性温度”通常指允许发生变性的温度，“变性持续时间”通常指为发生变性而分配的时间量。

如本文所使用的，术语“延伸(elongation)”通常指以模板引导的方式将核苷酸掺入核酸。延伸可借助于诸如例如聚合酶或逆转录酶的酶而发生。可发生延伸的条件包括“延伸温度”和“延伸持续时间”，“延伸温度”通常指允许发生延伸的温度，“延伸持续时间”通常指为发生延伸而分配的时间量。

如本文所使用的，术语“核酸”通常指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸(dNTP)或核糖核苷酸(rNTP))或其类似物的聚合形式。核酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。核酸的非限制性实例包括DNA、RNA、基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析确定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、分离的任意序列的DNA、分离的任意序列的RNA、核酸探针和引物。核酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在核酸组装之前或之后进行。核酸的核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。核酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与报告剂偶联或结合。

如本文所使用的，术语“引物延伸反应”通常指双链核酸变性，引物与变性的核酸的一条或两条链结合，随后引物延长。

如本文所使用的，术语“反应混合物”通常指包含对于完成核酸扩增(例如，DNA扩增、RNA扩增)所必需的试剂的组合物，此等试剂的非限制性实例包括对靶RNA或靶DNA具有特异性的引物组、由RNA的逆转录产生的DNA、DNA聚合酶、逆转录酶(例如，用于RNA的逆转录)、合适的缓冲液(包括两性离子缓冲液)、辅因子(例如，二价和一价阳离子)、dNTP和其他酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)等)。在一些情况下，反应混合物还可包含一种或多种报告剂。

如本文所使用的，“报告剂”通常指产生可检测信号的组合物，该信号的存在或不存在可用于检测扩增产物是否存在。

如本文所使用的，术语“靶核酸”通常指在核酸分子的起始群体中的、具有某种核苷酸序列的核酸分子，其存在、量和/或序列或者其中一项或多项的变化需要进行测定。靶核酸可以是任何类型的核酸，包括DNA、RNA和它们的类似物。如本文所使用的，“靶核糖核酸(RNA)”通常指作为RNA的靶核酸。如本文所使用的，“靶脱氧核糖核酸(DNA)”通常指作为DNA的靶核酸。

如本文所使用的，术语“受试者”通常指具有可测试或可检测的遗传信息的实体或介质。受试者可以是人或个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括鼠、猿猴、人、家畜、竞技动物(sportanimal)和宠物。受试者的其他实例包括食物、植物、土壤和水。

在一个方面，本发明提供了一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对靶RNA的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶RNA。

在另一方面，本发明提供了一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。该方法包括：(a)接收已从受试者获得的生物样品；(b)提供包含生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对靶RNA的引物组；(c)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(d)检测(c)的扩增DNA产物的量；及(e)将关于扩增DNA产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。

在一个方面，本发明提供了一种扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的方法。该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应以生成指示在生物样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

在所述多个方面中的任意方面，对来自从受试者获得的生物样品的核酸进行扩增。在一些情况下，该生物样品直接从受试者获得。直接从受试者获得的生物样品通常指这样的生物样品：其从受试者获得后，除了用于从受试者采集生物样品以供进一步处理的任意手段之外未进行进一步处理。例如，通过以下步骤直接从受试者获得血液：进入受试者的循环系统，从受试者中取出血液(例如，通过针)，并使取出的血液进入贮器中。该贮器可包含试剂(例如，抗凝血剂)，以使得血液样品可用于进一步的分析。在另一实例中，可使用拭子接近受试者的口咽表面上的上皮细胞。在从受试者获得生物样品后，可使含有生物样品的拭子与流体(例如，缓冲液)接触，以从拭子上收集生物流体。

在一些实施方案中，生物样品在提供于反应容器中时尚未纯化。在一些实施方案中，当生物样品提供至反应容器中时，生物样品的核酸尚未提取。例如，当将生物样品提供至反应容器中时，生物样品中的RNA或DNA可能未从生物样品中提取。此外，在一些实施方案中，在将生物样品提供至反应容器中之前，存在于生物样品中的靶核酸(例如，靶RNA或靶DNA)可能未经浓缩。

可从受试者获得包含核酸的任何合适的生物样品。生物样品可以是固体物质(例如，生物组织)，或者可以是流体(例如，生物流体)。通常，生物流体可包括与活生物体相关的任何流体。生物样品的非限制性实例包括从受试者的任何解剖学位置(例如，组织、循环系统、骨髓)获得的血液(或血液的成分—例如，白细胞、红细胞、血小板)、从受试者的任何解剖学位置获得的细胞、皮肤、心脏、肺、肾脏、呼出气、骨髓、粪便、精液、阴道液、来源于肿瘤组织的组织液、乳腺、胰腺、脑脊液、组织、咽喉拭子、活检物、胎盘液、羊水、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、腔液、痰、脓、微生物群(micropiota)、胎粪、乳汁、前列腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、泪液、眼部液体、汗液、粘液、耳垢、油、腺体分泌物、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脐带血、重点流体(emphaticfluid)和/或其他排泄物或身体组织。

可通过本领域中已知的任何手段从受试者获得生物样品。用于直接从受试者获得生物样品的手段的非限制性实例包括：进入循环系统(例如，经注射器或其他针静脉内或动脉内进入)、收集分泌的生物样品(例如，粪便、尿液、痰、唾液等)、外科手术(例如，活检)、擦拭(例如，口腔拭子、口咽拭子)、移液和呼吸。此外，可从受试者中期望的生物样品所处的任何解剖部位获得生物样品。

在所述多个方面中的任何方面，对靶核酸进行扩增以生成扩增产物。靶核酸可以是靶RNA或靶DNA。在靶核酸为靶RNA的情况下，靶RNA可以是任何类型的RNA，包括本文其他地方所述的RNA类型。在一些实施方案中，靶RNA是病毒RNA。在一些实施方案中，病毒RNA可能对于受试者是致病性的。致病病毒RNA的非限制性实例包括人免疫缺陷病毒I(HIVI)、人免疫缺陷病毒II(HIVII)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，H1N1、H3N2、H7N9或H5N1)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，具甲的RNA-HCV病毒)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒和麻疹病毒。

在靶核酸为靶DNA的情况下，靶DNA可以是任何类型的DNA，包括本文其他地方所述的DNA类型。在一些实施方案中，靶DNA是病毒DNA。在一些实施方案中，病毒DNA可能对于受试者是致病性的。DNA病毒的非限制性实例包括单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒、7型腺病毒)和水痘病毒(例如，禽痘)。在一些情况下，靶DNA可以是细菌DNA。细菌DNA可来自对受试者为致病性的细菌，例如，结核分枝杆菌——一种已知会引起肺结核的细菌。在一些情况下，靶DNA可以是来自致病原生动物(例如，一种或多种可引起疟疾的疟原虫类型的原生动物)的DNA。

在本发明的多个方面中的任何方面，从受试者获得的生物样品与对于在反应容器中进行核酸扩增所必需的试剂一起提供以获得反应混合物。可使用任何合适的反应容器。在一些实施方案中，反应容器包括主体，该主体可包括内表面、外表面、开口端和相对的封闭端。在一些实施方案中，反应容器可包括盖。所述盖可被配置为在其开口端与主体接触，使得当进行接触时该反应容器的开口端封闭。在一些情况下，所述盖永久地与反应容器相关联，使得其在打开和闭合配置下保持附接至反应容器。在一些情况下，所述盖是可移除的，以便在反应容器打开时，盖与反应容器分离。在一些实施方案中，反应容器可被密封，任选地气密密封。

反应容器可具有不同的大小、形状、重量和配置。在一些实例中，反应容器可以是圆形或椭圆形的管状。在一些实施方案中，反应容器可以是矩形、正方形、菱形、圆形、椭圆形或三角形。反应容器可以是规则形状或不规则形状。在一些实施方案中，反应容器的封闭端可具有锥形、圆形或平的表面。反应容器类型的非限制性实例包括管、孔、毛细管、筒、皿、离心管或移液管头。反应容器可由任何合适的材料构造，此等材料的非限制性实例包括玻璃、金属、塑料及其组合。

在一些实施方案中，反应容器是反应容器阵列的一部分。反应容器阵列尤其可用于自动化方法和/或同时处理多个样品。例如，反应容器可以是由许多孔组成的微孔板的孔。在另一实例中，反应容器可容纳在热循环仪的热块的孔中，其中热循环块包括各自能够接纳样品容器的多个孔。由反应容器组成的阵列可包括任何适当数目的反应容器。例如，阵列可包括至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、35、48、96、144、384个或更多个反应容器。反应容器阵列的反应容器部分也可以由流体处理装置单独寻址，使得该流体处理装置可正确识别反应容器，并将适当的流体材料分配到反应容器中。流体处理装置可用于将流体材料向反应容器中的添加自动化。

在一些实施方案中，反应容器可包含多个热区。反应容器内的热区可通过使反应容器的不同区域暴露于不同的温度循环条件来实现。例如，反应容器可包括上部热区和下部热区。上部热区能够接收生物样品和对于获得用于核酸扩增的反应混合物所必需的试剂。该反应混合物随后可经历第一热循环方案。在期望数目的循环之后，例如，反应混合物可缓慢地但连续地从上部热区泄漏到下部热区。在下部热区，反应混合物随后经历与上部热区的方案不同的第二热循环方案的期望数目的循环。此等策略在采用巢式PCR扩增DNA时可能特别有用。在一些实施方案中，热区可在反应容器内的热敏分层材料的辅助下在反应容器内产生。在此等情况下，可利用热敏分层材料的加热将反应混合物从一个热区释放到下一个热区中。在一些实施方案中，反应容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个热区。

在一些实施方案中，包含热区的反应容器可用于在核酸扩增前处理生物样品。例如，可在加入生物样品和对于核酸扩增所必需的试剂之前将裂解剂加入到反应容器的第一热区。当将生物样品和试剂加入到包含裂解剂的反应容器中时，获得能够裂解该生物样品内的种类(例如，细胞或病毒颗粒)的反应混合物。或者，可将裂解剂与生物样品和试剂同时加入到反应混合物的第一热区中。使第一热区经受适合于裂解剂作用的温度条件可用来在第一热区中裂解生物样品中的细胞和病毒颗粒，使得该生物样品中的核酸释放到反应混合物中。裂解之后，随后可使反应混合物进入反应容器的第二热区，以供使用本文所述的扩增方法对释放的核酸进行扩增。

在需要裂解剂的情况下，可使用本领域中已知的任何合适的裂解剂，包括可商购的裂解剂。裂解剂的非限制性实例包括Tris-HCl，EDTA，去污剂(例如，TritonX-100、SDS)，溶菌酶，葡萄糖酶(glucolase)，蛋白酶E，病毒内溶素，外溶素(exolysin)，消解酶(zymolose)，溶细胞酶(Iyticase)，蛋白酶K，来自噬菌体的内溶素和外溶素，来自噬菌体PM2的内溶素，来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)噬菌体PBSX的内溶素，来自乳杆菌原噬菌体Lj928、Lj965、噬菌体15Phiadh的内溶素，来自肺炎链球菌噬菌体Cp-I的内溶素，无乳链球菌噬菌体B30的双功能肽聚糖溶素，来自原噬菌体细菌的内溶素和外溶素，来自李斯特菌(Listeria)噬菌体的内溶素，穴蛋白(holin)-内溶素，细胞20裂解基因，holWMY沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswameri)M噬菌体varphiWMY，沃氏葡萄球菌M噬菌体varphiWMY的Iy5WMY，及其组合。在一些情况下，缓冲液可包含裂解剂(例如，裂解缓冲液)。裂解缓冲液的一个实例是氢氧化钠(NaOH)。

本领域已知的任何类型的核酸扩增反应均可用于扩增靶核酸并生成扩增产物。此外，核酸的扩增可以是线性的、指数式的或其组合。扩增可以是基于乳剂的或可以是非基于乳剂的。核酸扩增方法的非限制性实例包括逆转录、引物延伸、聚合酶链反应、连接酶链反应、解旋酶依赖的扩增、非对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增(MDA)。在一些实施方案中，扩增产物可以是DNA。在对靶RNA进行扩增的情况下，可通过RNA的逆转录来获得DNA并且可利用随后的DNA扩增来生成扩增的DNA产物。扩增的DNA产物可以指示在生物样品中存在靶RNA。在对DNA进行扩增的情况下，可以使用本领域中已知的任何DNA扩增方法。DNA扩增方法的非限制性实例包括聚合酶链反应(PCR)、PCR的变型(例如，实时PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、非对称PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR(dial-outPCR)、解旋酶依赖的PCR、巢式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR(miniprimerPCR)、多重PCR、巢式PCR、重叠-延伸PCR、热非对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)、递降PCR)以及连接酶链反应(LCR)。在一些情况下，DNA扩增是线性的。在一些情况下，DNA扩增是指数式的。在一些情况下，DNA扩增采用巢式PCR来实现，其可改善检测扩增的DNA产物的灵敏度。

在多个方面，本文所述的这些核酸扩增反应可平行进行。通常，平行的扩增反应是同时在同一反应容器内发生的扩增反应。平行的核酸扩增反应可以如下进行：例如，在反应容器中包括对于各个核酸扩增反应所必需的试剂以获得反应混合物，并且使该反应混合物经受对于各个核酸扩增反应所必需的条件。例如，逆转录扩增和DNA扩增可如下平行地进行：在反应容器中提供对于这两种扩增方法所必需的试剂以形成并获得反应混合物，并使该反应混合物经受适于进行这两个扩增反应的条件。由RNA的逆转录产生的DNA可以平行地进行扩增以产生扩增的DNA产物。任何合适数目的核酸扩增反应可以平行地进行。在一些情况下，平行地进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核酸扩增反应。

平行进行核酸扩增反应的优点可包括耦合的核酸扩增反应之间的快速转换。例如，可在平行核酸扩增的加热阶段从生物样品中提取或释放靶核酸(例如，靶RNA、靶DNA)。在靶RNA的情况下，例如，可加热包含靶RNA的生物样品并使靶RNA从生物样品中释放。所释放的靶RNA可以立即开始逆转录(经由逆转录扩增)以产生互补DNA。然后可立即扩增该互补DNA，通常在数秒的量级上。靶RNA从生物样品中释放与靶RNA逆转录为互补DNA之间的短时间间隔可有助于使生物样品中可能妨碍逆转录和/或DNA扩增的抑制剂的影响最小化。

在这些多个方面中的任何方面，可使用针对靶核酸的引物组来进行核酸扩增反应。引物组通常包含一种或多种引物。例如，引物组可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种引物。在一些情况下，引物组可包含针对不同的扩增产物或不同的核酸扩增反应的引物。例如，引物组可包含第一引物和与核酸链产物互补的第二引物，第一引物是生成与靶核酸的至少一部分互补的核酸产物的第一链所必需的，第二引物是生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物的第二链所必需的。

例如，引物组可针对靶RNA。引物组可包含可用于生成与靶RNA的至少一部分互补的核酸产物第一链的第一引物。在逆转录反应的情况下，核酸产物的第一链可以是DNA。引物组还可包含可用于生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物第二链的第二引物。在与DNA扩增平行进行的逆转录反应的情况下，核酸产物的第二链可以是与自RNA模板产生的DNA链互补的核酸(例如，DNA)产物的一条链。

如有需要，可以使用任何合适数目的引物组。例如，可以使用约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个引物组。当使用多个引物组时，一个或多个引物组可各自对应于特定的核酸扩增反应或扩增产物。

在一些实施方案中，使用DNA聚合酶。可以使用任何合适的DNA聚合酶，包括可商购的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常指能够以模板结合的方式将核苷酸掺入到DNA链中的酶。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热分布。

在一些实施方案中，使用逆转录酶。可使用任何合适的逆转录酶。逆转录酶通常指在与RNA模板结合时能够将核苷酸掺入到DNA链中的酶。逆转录酶的非限制性实例包括HIV-1逆转录酶、M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、端粒酶逆转录酶，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。

在多个方面，使用引物延伸反应来生成扩增产物。引物延伸反应通常包括以下的循环：将反应混合物在变性温度下孵育一段变性持续时间，以及将反应混合物在延伸温度下孵育一段延伸持续时间。

变性温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性温度可为约80℃至约110℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约100℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约97℃。在一些实例中，变性温度可为约92℃至约95℃。在另外其他的实例中，变性温度可为约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。

变性持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，变性持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

延伸温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸温度可为约30℃至约80℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约72℃。在一些实例中，延伸温度可为约45℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约40℃至约60℃。在一些实例中，延伸温度可为约50℃至约60℃。在另外其他的实例中，延伸温度可为约35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。

延伸持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，延伸持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

在所述多个方面中的任何方面，可进行多个循环的引物延伸反应。可进行任何适当数目的循环。例如，进行的循环数可以少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。进行的循环数可取决于，例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物)所必需的循环数(例如，循环阈值(Ct))。例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物)所必需的循环数可以少于约或为约100个循环、75个循环、70个循环、65个循环、60个循环、55个循环、50个循环、40个循环、35个循环、30个循环、25个循环、20个循环、15个循环、10个循环或5个循环。此外，在一些实施方案中，可检测量的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物)可以以小于100、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5的循环阈值(Ct)获得。

扩增产生指示存在所扩增的靶核酸的可检测量的扩增产物所需的时间可根据从中获得靶核酸的生物样品、将要进行的特定核酸扩增反应和所期望的扩增反应的特定循环数而变化。例如，靶核酸的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时段产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物。

在一些实施方案中，靶RNA的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时段产生指示存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物。

在一些实施方案中，可使反应混合物经历多个系列的引物延伸反应。所述多个系列中的单个系列可包括多个循环的特定引物延伸反应，该反应的特征在于，例如，如本文其他地方所述的特定的变性和延伸条件。通常，例如，就变性条件和/或延伸条件而言，每个单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。例如，就变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的任意一个、两个、三个或全部四个而言，单个系列可不同于所述多个系列中的另一个单个系列。此外，多个系列可包括任何数目的单个系列，例如，至少约或约为2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个单个系列。

例如，多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。第一系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃至约65℃下孵育不超过约一分钟。第二系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃至约60℃下孵育不超过约1分钟。在这一具体实例中，第一和第二系列在它们的延伸温度条件上不同。然而，该实例并非意在限制，因为可以使用不同延伸和变性条件的任意组合。

在一些实施方案中，斜变时间(即，热循环仪从一个温度转变至另一温度所花的时间)和/或斜变速率是扩增中的重要因素。例如，扩增产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物所需的温度和时间可根据斜变速率和/或斜变时间而变化。斜变速率可影响用于扩增的温度和时间。

在一些情况下，斜变时间和/或斜变速率在循环之间可以是不同的。然而在一些情况下，循环之间的斜变时间和/或斜变速率可以是相同的。斜变时间和/或斜变速率可基于正在处理的样品进行调整。

在一些情况下，例如可以根据样品的性质和反应条件来确定不同温度之间的斜变时间。也可根据样品的性质和反应条件来确定精确的温度和孵育时间。在一些实施方案中，可使用多个热循环将单个样品处理(例如，使之经受扩增条件)多次，各个热循环在例如斜变时间、温度和/或孵育时间上不同。随后可为该特定样品选择最好或最佳的热循环。这提供了针对被测试的特定样品或样品组合裁量热循环的稳健而高效的方法。

在一些实施方案中，靶核酸可在引物延伸反应启动之前经受变性条件。在多个系列的引物延伸反应的情况下，靶核酸可在执行所述多个系列之前经受变性条件，或者可在所述多个系列之间经受变性条件。例如，靶核酸可在多个系列中的第一系列与第二系列之间经受变性条件。此等变性条件的非限制性实例包括变性温度分布(例如，一个或多个变性温度)和变性剂。

进行多个系列的引物延伸反应的优点可能在于，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，多个系列的方法以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。与在相若的变性和延伸条件下的单一系列相比，使用多个系列的引物延伸反应可将此等循环阈值减少至少约或大约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在一些实施方案中，可在进行引物延伸反应之前预加热生物样品。预加热生物样品的温度(例如，预热温度)和持续时间(例如，预热持续时间)可根据例如所分析的特定生物样品而变化。在一些实例中，可将生物样品预加热不超过约60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、15秒、10秒或5秒。在一些实例中，可在约80℃至约110℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约100℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约97℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约92℃至约95℃的温度下预加热生物样品。在另外其他的实例中，可在约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃的温度下预加热生物样品。

在一些实施方案中，对于进行核酸扩增所必需的试剂(包括对于进行平行核酸扩增所必需的试剂)还可包括产生可检测信号的报告剂，该可检测信号的存在或不存在指示扩增产物是否存在。可检测信号的强度可与扩增产物的量成比例。在一些情况下，当扩增产物由与最初扩增的靶核酸不同类型的核酸所生成时，可检测信号的强度可与最初扩增的靶核酸的量成比例。例如，在通过平行地逆转录和扩增从逆转录获得的DNA来扩增靶RNA的情况下，对于这两个反应所必需的试剂还可包括可产生可检测信号的报告剂，该可检测信号指示扩增的DNA产物和/或扩增的靶RNA的存在。可检测信号的强度可与扩增的DNA产物和/或扩增的原始靶RNA的量成比例。报告剂的使用还使得实时扩增方法成为可能，包括用于DNA扩增的实时PCR。

报告剂可通过共价或非共价方式与包括扩增产物在内的核酸相连接。非共价方式的非限制性实例包括离子相互作用、范德华力、疏水相互作用、氢键键合及其组合。在一些实施方案中，报告剂可与初始反应物结合，并且报告剂水平的变化可用于检测扩增产物。在一些实施方案中，报告剂可以仅在核酸扩增进行时是可检测的(或不可检测的)。在一些实施方案中，光学活性染料(例如，荧光染料)可用作报告剂。染料的非限制性实例包括SYBR绿，SYBR蓝，DAPI，碘化丙啶(propidiumiodine)，Hoeste，SYBR金，溴化乙锭，吖啶，原黄素、吖啶橙，吖啶黄，荧光香豆素(fluorcoumanin)，玫瑰树碱，道诺霉素，氯喹，偏端霉素D，色霉素，胡米溴铵(homidium)，光辉霉素，多吡啶钌(rutheniumpolypyridyl)，安曲霉素(anthramycin)，菲啶和吖啶，溴化乙锭，碘化丙啶，碘化己啶(hexidiumiodide)，二氢乙锭，乙锭同型二聚体-1和乙锭同型二聚体-2，单叠氮化乙锭(ethidiummonoazide)和ACMA，Hoechst33258，Hoechst33342，Hoechst34580，DAPI，吖啶橙，7-AAD，放线菌素D，LDS751，羟茋巴脒(hydroxystilbamidine)，SYTOX蓝，SYTOX绿，SYTOX橙，POPO-1，POPO-3，YOYO-1，YOYO-3，TOTO-1，TOTO-3，JOJO-1，LOLO-1，BOBO-1，BOBO-3，PO-PRO-1，PO-PRO-3，BO-PRO-1，BO-PRO-3，TO-PRO-1，TO-PRO-3，TO-PRO-5，JO-PRO-1，LO-PRO-1，YO-PRO-1，YO-PRO-3，PicoGreen，OliGreen，RiboGreen，SYBR金，SYBR绿I，SYBR绿II，SYBRDX，SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)，SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)，SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)，SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)，荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)，罗丹明，四甲基罗丹明，R-藻红蛋白，Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7，德克萨斯红(TexasRed)，Phar-Red，别藻蓝蛋白(APC)，Sybr绿I，Sybr绿II，Sybr金，CellTracker绿，7-AAD，乙锭同型二聚体I，乙锭同型二聚体II，乙锭同型二聚体III，溴化乙锭，伞形酮，曙红，绿色荧光蛋白，赤藓红，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀绿，茋，荧光黄，级联蓝(cascadeblue)，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯，荧光镧系络合物(如那些包括铕和铽的络合物)，羧基四氯荧光素，5和/或6-羧基荧光素(FAM)，5-(或6-)碘乙酰胺基荧光素，5-{[2(和3)-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)，丽丝胺罗丹明B磺酰氯，5和/或6羧基罗丹明(ROX)，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，BODIPY荧光团，8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺，藻胆蛋白，AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料，DyLight350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料，或其他荧光团。

在一些实施方案中，报告剂可以是在与扩增产物杂交时具有光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。由于探针与扩增产物的序列特异性结合，寡核苷酸探针的使用可提高检测的特异性和灵敏度。探针可连接至本文所述的任何光学活性报告剂(例如，染料)，并且还可包括能够阻断相关联的染料的光学活性的猝灭剂。可用作报告剂的探针的非限制性实例包括TaqMan探针、TaqManTamara探针、TaqManMGB探针或Lion探针。

在一些实施方案中，报告剂可以是RNA寡核苷酸探针，其包含光学活性染料(例如，荧光染料)和相邻地位于探针上的猝灭剂。染料与猝灭剂的紧密靠近可阻断染料的光学活性。探针可与待扩增的靶序列结合。一旦在扩增期间DNA聚合酶的外切核酸酶活性使探针断裂，则猝灭剂与染料分离，而游离的染料重新获得其光学活性，该活性随后可被检测到。

在一些实施方案中，报告剂可以是分子信标(molecularbeacon)。分子信标包括，例如，在发夹构象的寡核苷酸的一端上连接的猝灭剂。在该寡核苷酸的另一端是光学活性染料，例如，荧光染料。在发夹构型中，光学活性染料和猝灭剂足够紧密地接近，使得猝灭剂能够阻断染料的光学活性。然而，一旦与扩增产物杂交，该寡核苷酸即呈线性构象并与该扩增产物上的靶序列杂交。寡核苷酸的线性化导致光学活性染料与猝灭剂的分离，从而使得光学活性恢复，并且可被检测到。分子信标对扩增产物上的靶序列的序列特异性可改善检测的特异性和灵敏度。

在一些实施方案中，报告剂可以是放射性种类。放射性种类的非限制性实例包括¹⁴C、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、Tc99m、³⁵S或³H。

在一些实施方案中，报告剂可以是能够产生可检测信号的酶。可检测信号可通过酶对其底物，或在酶具有多个底物的情况下对特定底物的活性来产生。可用作报告剂的酶的非限制性实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和萤光素酶。

在多个方面，可检测扩增产物(例如，扩增的DNA产物、扩增的RNA产物)。扩增产物(包括扩增的DNA)的检测可采用本领域已知的任何合适的检测方法来实现。所使用的检测方法的具体类型可取决于，例如，具体的扩增产物，用于扩增的反应容器的类型，反应混合物中的其他试剂，报告剂是否包括在反应混合物中，以及在使用报告剂时所使用的报告剂的具体类型。检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测、电化学检测等。光学检测方法包括但不限于荧光测定法和紫外-可见光吸收。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(NMR)波谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳。电化学检测方法包括但不限于在扩增产物的高效液相色谱分离后对扩增产物的电化学检测。

在所述多个方面中的任何方面，完成方法的要素所需的时间可根据该方法的具体步骤而变化。例如，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约120分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约60分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约30分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可以小于或等于120分钟，小于或等于90分钟，小于或等于75分钟，小于或等于60分钟，小于或等于45分钟，小于或等于40分钟，小于或等于35分钟，小于或等于30分钟，小于或等于25分钟，小于或等于20分钟，小于或等于15分钟，小于或等于10分钟，或者小于或等于5分钟。

在一些实施方案中，可将关于扩增产物(例如，扩增的DNA产物)的存在和/或量的信息输出至接收者。关于扩增产物的信息可经由本领域已知的任何适宜的方法输出。在一些实施方案中，此等信息可口头提供给接收者。在一些实施方案中，此等信息可在报告中提供。报告可包括任何数目的所期望的元素，该元素的非限制性实例包括关于受试者(例如，性别、年龄、种族、健康状况等)的原始数据、经处理的数据(例如，图形显示(例如，图、图表、数据表、数据汇总)、确定的循环阈值、靶多核苷酸起始量的计算值)的信息，关于是否存在靶核酸的结论，诊断信息，预后信息，疾病信息，等等，及其组合。该报告可作为打印的报告(例如，硬拷贝)提供，或者可作为电子报告提供。在一些实施方案(包括其中提供电子报告的情况)中，此等信息可经由诸如监视器或电视、可操作地与用于获得扩增产物的单元连接的屏、平板计算机屏、移动装置屏等电子显示器(例如，电子显示屏)输出。打印的报告和电子报告均可分别存储于文件或数据库中，使得它们可被访问以供与以后的报告进行比较。

此外，可使用任何合适的通信介质(包括，例如，网络连接、无线连接或因特网连接)将报告发送至本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，可将报告发送至接收者的装置，诸如个人计算机、电话、平板或其他装置。该报告可在线观看、保存在接收者的装置上或打印。还可通过用于传送信息的任何其他合适的手段传送报告，该手段的非限制性实例包括邮寄硬拷贝报告供接收和/或接收者查看。

此外，可将此等信息输出至各种不同类型的接收者。此等接收者的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医师、治疗受试者的医师、用于临床试验的临床监视器、护士、研究人员、实验室技术员、制药公司的代表、医疗保健公司、生物技术公司、医院、人类援助组织、医疗保健管理者、电子系统(例如，存储例如受试者的医疗记录的一台或多台计算机和/或一台或多台计算机服务器)、公共卫生工作者、其他医务人员和其他医疗设施。

在一个方面，本发明提供了一种实施根据本文所公开的任何方法的方法的系统。在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的系统。该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对靶RNA的引物组；及，使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ⅱ)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶RNA；及(c)可操作地耦合至该扩增模块的输出模块，其中该输出模块将关于靶RNA或DNA产物的信息输出至接收者。

在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的系统。该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：(i)在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含已经从受试者获得的生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂，该试剂包含(1)逆转录酶，和(2)针对靶RNA的引物组；及(ii)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(iii)检测(iii)的扩增DNA产物的量；及(iv)将关于扩增DNA产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(i)-(iv)的时间量小于或等于约30分钟；及(c)可操作地耦合至该扩增模块的输出模块，其中该输出模块将所述信息传送至接收者。

在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统。该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂，该试剂包含(i)DNA聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及，使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在生物样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列；及(c)可操作地耦合至该扩增模块的输出模块，其中该输出模块将关于靶RNA或DNA产物的信息输出至接收者。

在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统。该系统可包括具有显示图形元素的用户界面的电子显示屏，该图形元素可被用户访问，以执行用以扩增生物样品中的靶核酸的扩增方案。该系统还可包括计算机处理器(包括如本文其他地方所述的具有计算机处理器的任何适宜的装置)，其耦合至该电子显示屏并被编程为在用户选择所述图形元素时执行该扩增方案。该扩增方案可包括：使包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成扩增产物。该扩增产物可指示生物样品中靶核酸的存在。此外，每个系列的引物延伸反应可包括两个或更多个如下的循环：在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物。就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列可不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

在一些实施方案中，靶核酸可与疾病相关。例如，该疾病可与RNA病毒或DNA病毒相关。病毒的实例在本文其他地方提供。在一些实施方案中，该疾病可与致病细菌(如，结核分枝杆菌)或致病原生动物(例如，如疟疾中的疟原虫)(包括本文其他地方描述的此等病原体的实例)相关。在一些实施方案中，该扩增方案可指向基于扩增产物的存在来测定所述疾病的存在。

在一些情况下，用户界面可以是图形用户界面。此外，用户界面可包括一个或多个图形元素。图形元素可包括图像和/或文本信息，如图片、图标和文本。图形元素在用户界面上可具有不同的尺寸和方向。此外，电子显示屏可以是任何适宜的电子显示器，包括本文其他地方描述的实例。电子显示屏的非限制性实例包括监视器、移动装置屏、膝上型计算机屏、电视、便携式视频游戏系统屏和计算器屏。在一些实施方案中，电子显示屏可包括触摸屏(例如，电容式或电阻式触摸屏)，使得在电子显示屏的用户界面上显示的图形元素可经由用户触摸电子显示屏来选择。

在一些实施方案中，该扩增方案可进一步包括为靶核酸选择引物组。在此等情况下，引物组可以是为扩增靶核酸分子的一个或多个序列而特别设计的引物组。在一些实施方案中，该扩增方案可进一步包括选择对靶核酸分子的一个或多个序列具有特异性的报告剂(例如，包含光学活性种类的寡核苷酸探针或本文其他地方所述的其他类型的报告剂)。此外，在一些实施方案中，该试剂可包括如本文其他地方所述的对于核酸扩增所必需的任何适宜的试剂，例如脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、针对靶核酸的引物组以及(任选的)逆转录酶。

在一些实施方案中，用户界面可显示多个图形元素。每个图形元素可与多个扩增方案中的给定扩增方案相关联。所述多个扩增方案中的每个方案可包括系列引物延伸反应的不同组合。然而，在一些情况下，用户界面可显示与同一扩增方案相关联的多个图形元素。具有多个各自与给定扩增方案相关联的图形元素的用户界面的实例示于图28A中。如图28A所示，与计算机处理器相关联的示例性电子显示屏2800包括用户界面2801。用户界面2801包括图形元素2802、2803和2804的显示。各个图形元素图形元素可与特定的扩增方案相关联(例如，图形元素2802为“方案1(Prot.1)”，图形元素2803为“方案2(Prot.2)”以及图形元素2804为“方案4(Prot.4)”)。一旦用户选择(例如，当电子显示屏2800包括具有用户界面的触摸屏时，用户触摸)特定的图形元素，与该图形元素相关联的特定扩增方案即可由关联的计算机处理器来执行。例如，当用户选择图形元素2803时，由关联的计算机处理器来执行扩增“方案2”。尽管在图28A的示例性用户界面2801中仅示出三个图形元素，但用户界面可具有任何适当数目的图形元素。此外，尽管图28A的用户界面2801中显示的每个图形元素仅与一个扩增方案相关联，但用户界面的每个图形元素可与一个或多个扩增方案(例如，一系列的扩增方案)相关联，使得关联的计算机处理器在用户与图形元素交互后执行一系列的扩增方案。

在一些实施方案中，每个图形元素和/或可与疾病相关联，并且所述多个扩增方案中的给定扩增方案可指向测定受试者的疾病的存在。因此，在此等情况下，用户可选择图形元素以便运行一个扩增方案(或一系列的扩增方案)从而分析特定的疾病。在一些实施方案中，该疾病可与病毒(例如，任何RNA病毒或DNA病毒，包括本文其他地方描述的此等病毒的实例)相关。病毒的非限制性实例包括人免疫缺陷病毒I(HIVI)、人免疫缺陷病毒II(HIVII)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒或H5N1病毒)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV))、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒(ADV55)、7型腺病毒(ADV7))和水痘病毒。在一些实施方案中，该疾病可与致病细菌(例如，结核分枝杆菌)或致病原生动物(例如，疟疾中的疟原虫)(包括本文其他地方描述的此等病原体的实例)相关。

具有多个各自与给定扩增方案相关联的图形元素的用户界面的实例示于图28B中。如图28B所示，与计算机处理器相关联的示例性电子显示屏2810包括用户界面2811。用户界面2811包括图形元素2812、2813和2814的显示。各个图形元素可与特定的疾病相关联(例如，图形元素2812为“埃博拉”，图形元素2813为“H1N1”，以及图形元素2814为“HepC(丙型肝炎)”)，该疾病又与一个或多个指向特定疾病的扩增方案相关联。一旦用户选择(例如，当电子显示屏2810包括具有用户界面的触摸屏时，用户触摸)特定的图形元素，关联于该图形元素的疾病所关联的特定扩增方案即可由关联的计算机处理器来执行。例如，当用户与图形元素2812交互时，由关联的计算机处理器来执行一个或多个与分析埃博拉病毒相关联的扩增方案。尽管在图28B的示例性用户界面2811中仅示出三个图形元素，但用户界面可具有各自对应于多种疾病的任何适当数目的图形元素。此外，尽管图28B的用户界面2811中显示的每个图形元素仅与一种疾病相关联，但用户界面的每个图形元素可与一种或多种疾病相关联，使得关联的计算机处理器在用户选择该图形元素时执行一系列的扩增方案(例如，指向特定疾病的各种单个扩增方案)。例如，图形元素可对应于埃博拉病毒和H1N1病毒，使得该图形元素的选择导致关联的计算机处理器执行针对埃博拉病毒和H1N1病毒两者的扩增方案。

在多个方面，所述系统包括输入模块，该输入模块接收扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核酸(例如，靶RNA、靶DNA)的用户请求。可使用能够接收此等用户请求的任何合适的模块。该输入模块可包括，例如，包含一个或多个处理器的装置。包含处理器(例如，计算机处理器)的装置的非限制性实例包括：台式计算机、膝上型计算机、平板计算机(例如，iPad、GalaxyTab)、蜂窝电话、智能电话(例如，iPhone、支持的电话)、个人数字助理(PDA)、视频游戏控制台、电视、音乐播放设备(例如，iPod)、视频播放设备、寻呼机和计算器。处理器可与一个或多个控制器、计算单元和/或计算机系统的其他单元相关联，或者在需要时植入固件中。如果在软件中实施，则例程(或程序)可存储于任何计算机可读存储器如RAM、ROM、闪速存储器、磁盘、激光盘或其他存储介质中。同样地，该软件可经由任何已知的传送方法输送到装置，该方法包括，例如，经通信信道，如电话线、因特网、本地内联网、无线连接等，或者经由便携式介质，如计算机可读磁盘、闪盘驱动器等。各个步骤可作为各种区组、操作、工具、模块或技术来实施，后者又可以在硬件、固件、软件或其任意组合中实施。当在硬件中实施时，这些区组、操作、技术等中的一些或全部可在例如定制集成电路(IC)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程逻辑阵列(FPGA)、可编程逻辑阵列(PLA)等中实施。

在一些实施方案中，输入模块被配置成接收进行靶核酸扩增的用户请求。输入模块可直接地(例如，通过输入设备，诸如由用户操作的键盘、鼠标或触摸屏)或间接地(例如，通过有线或无线连接，包括经因特网)接收用户请求。输入模块可经由输出电子器件向扩增模块提供用户的请求。在一些实施方案中，输入模块可包括用户界面(UI)，如图形用户界面(GUI)，该用户界面被配置成能够使用户提供扩增靶核酸的请求。GUI可包括文本、图形和/或音频成分。GUI可在电子显示器上提供，该电子显示器包括含有计算机处理器的装置的显示器。此等显示器可包括电阻式或电容式触摸屏。

用户的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医务人员、临床医生(例如，医生、护士、实验室技术员)、实验室人员(例如医院实验室技术人员、研究科学家、药学科学家)、临床试验的临床监视者，或医疗保健行业中的其他用户等。

在多个方面，所述系统包括扩增模块，该扩增模块用于响应于由输入模块接收的用户请求而对靶核酸或其部分进行核酸扩增反应。该扩增模块可以能够执行本文所述的任何方法，并且可以包括流体处理装置、一个或多个热循环仪、用于接纳一个或多个反应容器(例如，热循环的热块的孔)的装置、能够检测扩增产物的检测器(例如，光学检测器、光谱检测器、电化学检测器)以及用于向接收者输出关于扩增产物(扩增的DNA产物)的存在和/或量的信息(例如，原始数据，经处理的数据或本文所述的任何其他类型的信息)的装置中的任何装置。在一些情况下，该扩增模块可包括具有如本文其他地方所述的计算机处理器的装置，并且还可以能够在适宜软件的辅助下分析自检测获得的原始数据。此外，在一些实施方案中，该扩增模块可包括从输入模块接收指令所必需的输入电子器件并且可包括与输出模块进行通信所必需的输出电子器件。

在一些实施方案中，向反应容器提供材料、扩增核酸、检测扩增产物和输出信息的一个或多个步骤可由扩增模块自动化操作。在一些实施方案中，自动化操作可包括使用一个或多个流体处理器和相关联的软件。可采用若干市售的流体处理系统来运行此等过程的自动化操作。此等流体处理器的非限制性实例包括来自Perkin-Elmer、CaliperLifeSciences、Tecan、Eppendorf、ApricotDesign和Velocity11的流体处理器。

在一些实施方案中，扩增模块可包括实时检测仪器。此等仪器的非限制性实例包括实时PCR热循环仪、ABI7000序列检测系统、ABI7700序列检测系统、AppliedBiosystems7300实时PCR系统、AppliedBiosystems7500实时PCR系统、AppliedBiosystems7900HT快速实时PCR系统(均来自AppliedBiosystems)；LightCycler^TM系统(RocheDiagnosticsGmbH)；Mx3000P^TM实时PCR系统、Mx3005P^TM实时PCR系统和多重定量PCR系统(MultiplexQuantitativePCRSystem)(Stratagene,LaJolla,Calif.)；以及智能循环仪系统(SmartCyclerSystem)(Cepheid，由FisherScientific分销)。在一些实施方案中，扩增模块可包括另一种自动化仪器，例如，AmpliPrep/系统(RocheMolecularSystems)、TIGRISDTS系统(HologicGen-Probe,SanDiego,CA)、PANTHER系统(HologicGen-Probe,SanDiego,CA)、BDMAX^TM系统(BectonDickinson)、GeneXpert系统(Cepheid)、(BioFireDiagnostics)系统、iCubate系统、IDBox系统(Luminex)、EncompassMDx^TM(Rheonix)系统、Liat^TMAanlyzer(IQuum)系统、Biocartis的MolecularDiagnosticPlatform系统、ML系统(EnigmaDiagnostics)、系统(T2Biosystems)、系统(NanoSphere)、GreatBasin的DiagnosticSystem、Unyvero^TM系统(Curetis)、PanNAT系统(Micronics)或Spartan^TMRX系统(SpartanBioscience)。

在各个方面，所述系统包含可操作地连接至扩增模块的输出模块。在一些实施方案中，该输出模块可包含具有如上所述的用于输入模块的处理器的装置。该输出模块可包括如本文所述的输入设备，并且/或者可包括用于与扩增模块通信的输入电子器件。在一些实施方案中，该输出模块可以是电子显示器，在一些情况下，该电子显示器包括UI。在一些实施方案中，该输出模块是可操作地耦合至计算机网络如因特网的通信接口。在一些实施方案中，该输出模块可使用任何合适的通信媒介(包括计算机网络、无线网络、本地内联网或因特网)将信息至传送至处于本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，该输出模块能够分析从扩增模块接收到的数据。在一些情况下，该输出模块包括能够生成报告并将报告传送至接收者的报告生成器，其中该报告包含如本文其他地方所述的关于扩增产物的量和/或存在的任何信息。在一些实施方案中，该输出模块可响应于从扩增模块接收到的信息自动地传送信息，例如以原始数据或由包含在扩增模块中的软件进行的数据分析的形式。或者，该输出模块可在接收用户指令后传送信息。由输出模块传送的信息可以经电子方式进行查看或者由打印机打印出来。

输入模块、扩增模块和输出模块中的一种或多种可包含在同一装置中，或者可包含一种或多种相同的组件。例如，扩增模块也可包含输入模块、输出模块或两者都包含。在其他实例中，包含处理器的装置既可包含在输入模块中也可包含在输出模块中。用户可使用该装置来请求对靶核酸进行扩增，并且也可将该装置用作将关于扩增产物的信息传送至接收者的工具。在一些情况下，包含处理器的装置可包含在全部三种模块中，使得该包含处理器的装置也可用于控制包含在扩增模块或任何其他模块中的仪器(例如，热循环仪、检测器、流体处理装置)，对该仪器提供指令，并接收从该仪器返回的信息。

用于根据本文所述方法扩增靶核酸的示例性系统示于图1中。该系统包括既可充当输入模块的一部分又可充当输出模块的一部分的计算机101。用户将包含准备进行核酸扩增的反应混合物的反应容器102放入扩增模块104中。该扩增模块包括热循环仪105和检测器106。输入模块107包括计算机101和相关的输入设备103(例如，键盘、鼠标等)，输入设备103可以接受用户对反应混合物中的靶核酸进行扩增的请求。输入模块107将用户的请求通信至扩增模块104，并且核酸扩增在热循环仪105中开始。随着扩增进行，扩增模块的检测器106对扩增产物进行检测。关于扩增产物的信息(例如，由检测器获得的原始数据)从检测器106传送回计算机101，计算机101也充当输出模块108的组件。计算机101接收来自扩增模块104的信息，对该信息进行任何额外的操作，随后生成包含经处理的信息的报告。一旦报告生成，计算机101随后经由计算机网络接口110通过计算机网络(例如，内联网、因特网)、经由打印机111以硬拷贝形式或者经由可操作地连接至计算机101的电子显示器112将报告传送至其最终接收者109。在一些情况下，电子显示器112

在一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，其被一个或多个处理器执行时，实施根据本文公开的任何方法的方法。在另一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，其被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对靶RNA的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶RNA。

在另一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，其被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，该方法包括：(a)接收已从受试者获得的生物样品；(b)提供包含生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对靶RNA的引物组；(c)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(d)检测(c)的DNA产物的量；及(e)将关于DNA产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。

在一方面，本发明提供了一种包含机器可执行码的计算机可读介质，其被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)DNA聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应以由靶核酸生成扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

计算机可读介质可采取许多形式，包括但不限于，有形(或非暂时性)存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机中的任何存储设备等等，例如可用于实施计算步骤、处理步骤等。易失性存储介质包括动态存储器，如计算机的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括计算机系统内包含总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波如射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中产生的那些的形式。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或匣盒、传输数据或指令的载波、传送此等载波的电缆或链路(link)、或计算机可从中读取程序代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可参与将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。

实施例

实施例1：病毒储备样品和生物样品中的核酸的扩增和检测

进行扩增和检测实验，以比较从病毒标准样品和生物样品获得的结果。使包含RNA病毒病原体的生物样品和病毒病原体的标准样品经受扩增条件，从而扩增病原体的RNA。对H3N2和H1N1(2007)流感病毒中的每一个进行一组实验。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。各个病毒标准样品作为包含病毒的储备溶液的系列稀释液而获得。H3N2和H1N1(2007)的浓度为10⁶IU/mL。对于H5N1和H1N1(2007)，将1/2、1/20、1/200、1/2000和1/20000的稀释液进行扩增。在各个实验组中，阴性对照(例如，不包含病毒RNA的样品)也进行扩增。

将5微升的每个样品在具有进行病毒RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增(例如，平行的核酸扩增)所必需的试剂的25μL反应管中合并。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂作为市售的预混合物(例如，QiagenOne-StepRT-PCR或One-StepRT-qPCR试剂盒)来提供，该预混合物包含逆转录酶(例如，Sensiscript和Omniscript转录酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaqDNA聚合酶)和dNTP。此外，该反应管还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。为了生成扩增的DNA产物，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在95℃下5分钟，随后在45℃下20分钟，然后在95℃下2分钟，并接着进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。

H3N2的扩增结果以图形示于图2中(图2A对应于各个病毒标准样品，图2B对应于生物样品)，而H1N1(2007)的扩增结果以图形示于图3中(图3A对应于各个病毒标准样品，图3B对应于生物样品)。所记录的FAM染料的荧光相对于循环数作图。

如图2A所示，各个H3N2病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为18至32。如图2B所示，各个病毒H3N2生物样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为29-35。

如图3A所示且除1/20000稀释液外，各个H1N1(2007)病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为24-35。如图3B所示，各个H1N1(2007)生物样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为28-35。

总体而言，图2和图3中所示的数据表明，在低至50IU/mL的浓度下以及在4-log浓度范围上，经由扩增的DNA产物可检测到所测试的病毒，且具有良好的灵敏度，循环阈值不超过约40。此外，数据还表明，检测从获自受试者的生物样品中获得的病毒RNA也可以以类似的方式进行检测。

实施例2：病毒核酸在不同的缓冲液体系中的扩增和检测

进行扩增和检测实验，以比较使用不同的缓冲液体系进行扩增而获得的结果。针对两种不同的缓冲液体系(S1和S2)进行一组实验。S1缓冲液包含两性离子缓冲剂和BSA，而S2缓冲液包含两性离子缓冲剂和氢氧化钠。使用一组作为包含病毒的储备溶液的系列稀释液而获得的H5N1流感病毒标准样品来完成针对每种缓冲液的实验。H5N1的浓度为10⁶IU/mL。对1/2、1/20、1/200、1/2000、1/20000、1/200000稀释液和阴性对照进行扩增。

将5微升的每个样品在具有进行病毒RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增(例如，平行的核酸扩增)所必需的试剂的25μL反应管中合并。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP和适宜的S1或S2缓冲液。此外，该反应管还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。为了生成扩增的DNA产物，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在95℃下5分钟，随后在45℃下20分钟，然后在95℃下2分钟，接着进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。

缓冲液体系S1的扩增结果以图形示于图4A中，而缓冲液体系S2的扩增结果以图形示于图4B中。所记录的FAM染料的荧光相对于循环数作图。

如图4A所示，在缓冲液体系S1中扩增的各个病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为25至36。如图4B所示，在缓冲液S2中扩增的各个病毒标准样品相对于阴性对照显示可检测信号，Ct值范围为25-35。

总体而言，图4中所示的数据表明，在低至50IU/mL的浓度下以及在5-log浓度范围上，经由扩增的DNA产物可检测到所测试的病毒，且具有良好的灵敏度，循环阈值不超过约40。此外，数据还表明，使用不同的缓冲液体系可获得类似的扩增结果。

实施例3：血浆样品中的乙型肝炎病毒(HBV)的扩增和检测

进行扩增实验，以确定用于检测生物样品中的靶核酸的扩增方法的稳健性。对包含不同浓度(例如，50感染单位/毫升(IU/mL)、200IU/mL、2000IU/mL、20000IU/mL)的乙型肝炎病毒(HBV)的稀释的人血浆样品分别进行扩增反应。HBV是经由RNA中间体进行复制的DNA病毒。HBV经由DNA病毒的直接PCR是可检测的。除阴性对照的多个样品(例如，不包含HBV的血浆)外，也对各个浓度下的多个样品(n＝2-4)进行了测试。

将2.5μL的每个样品与进行RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增(例如，平行的核酸扩增)所必需的试剂置于50μL反应管中以获得反应混合物。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂作为市售的预混合物(例如，QiagenOne-StepRT-PCR或One-StepRT-qPCR试剂盒)来提供，该预混合物包含逆转录酶(例如，Sensiscript和Omniscript转录酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaqDNA聚合酶)和dNTP。此外，该混合物还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。该反应混合物还包含两性离子缓冲剂和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)，以阻止在血浆中发现的扩增抑制剂的抑制效果。在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在94℃下1分钟，随后在50℃下10分钟，然后在94℃下2分钟，接着进行在94℃下5秒和在58℃下35秒的50个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。

扩增结果以图形示于图5中，而所确定的Ct值列表于表1中。在图5中，所记录的FAM染料的相对荧光单位(RFU)相对于循环数作图。如图5和表1所示，HBV在所测试的各个浓度下可以检测到，循环阈值的范围为28.99至39.39。通常，较高浓度的样品对应于较低的循环阈值。

总体而言，图5和表1中所示的数据表明，在低至50IU/mL(所测试的最低值)的浓度下，经由扩增的DNA产物可检测到HBV，且具有良好的灵敏度，循环阈值不超过约40。尽管测试的最高浓度(20000IU/mL)比测试的最低浓度(50IU/mL)浓缩了400倍，但对于较低浓度而言，循环阈值仅高出约25％，这表明该扩增方案总体上是稳健的。

表1：实施例3中的实验的Ct结果

样品编号	IU/mL	Ct
			1	2000	33.09
2	50	39.39
			3	2.00E+04	29

4	2000	32.97
			5	200	35.51
6	2000	33.07
			7	2.00E+04	30.03
8	200	35.78
			9	50	37.91
10	2.00E+04	29.37
			11	200	35.73
12	2.00E+04	28.99

实施例4：在扩增生物样品中的核酸前预加热生物样品以及一系列的扩增反应

进行扩增实验，以确定预加热生物样品对检测灵敏度的影响，并且还确定使用多个系列的扩增反应对检测灵敏度的影响。

制备20份25μL的反应混合物，每份反应混合物包含1μL的致病种类、完成适当的核酸扩增反应(例如，RNA种类的逆转录和DNA扩增，以及DNA种类的DNA扩增)所必需的试剂和包含FAM染料的TaqMan探针。其中四份反应混合物包含H1N1(2007)(即，RNA病毒)，四份反应混合物包含H3N2(即，RNA病毒)，四份反应混合物包含H1N1(2009)、四份反应混合物包含结核菌(TB)(即细菌样品)，而四份反应混合物包含阿留申病病毒(Aleutiandiseasevirus，ADV)(即DNA病毒)。H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2和ADV致病种类来自从受试者获得的口咽拭子。TB从细菌储备物获得。

使用预加热和扩增方案的各种组合并将其汇总于表2中。对于各种致病种类的第一反应混合物，将致病种类在加入至反应混合物之前在95℃下预加热10分钟。在将致病种类加入至反应混合物之后，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育该反应混合物，该方案包括在95℃下2分钟，随后进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PH-1混合物。

对于各个致病种类的第二反应混合物，将致病种类在加入至反应混合物之前在50℃下预加热30分钟。在将致病种类加入至反应混合物之后，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育该反应混合物，该方案包括在95℃下2分钟，随后进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PH-2混合物。

对于各个致病种类的第三反应混合物，致病种类在加入至反应混合物之前不进行预加热。在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育这些反应混合物，该方案包括在95℃下1分钟，随后在55℃下10分钟，然后在95℃下2分钟，接着进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PTC-1混合物。

对于各个致病种类的第四反应混合物，致病种类在加入至反应混合物之前不进行预加热。使这些反应混合物经历包括多个系列的扩增反应的方案，各个系列包括变性和延伸条件的多个循环。在实时PCR热循环仪中根据此方案孵育该反应混合物，该方案包括在95℃下1分钟，随后进行系列1(在95℃下5秒，在60-50℃下20秒(以1℃/循环步进下降)，及在60℃下10秒)的10个循环，然后在95℃下2分钟，接着进行系列2(在95℃下5秒，在55℃下30秒)的40个循环。系列1和系列2在它们的延伸温度和延伸持续时间上有所不同。在孵育期间进行扩增产物的检测。这些反应混合物被称为PTC-2混合物。

表2：实施例4的实验条件

各种致病种类的结果以图形示于图6(H1N1(2007))、图7(H3N2)、图8(H1N1(2009))、图9(TB)和图10(ADV)中。图6至图10中的每一个中的A项表示对于反应混合物PH-1和PH-2获得的结果，而图6至图10中的每一个中的B项表示对于反应混合物PTC-1和PTC-2获得的结果。对各个实验确定的Ct值汇总于表3中。对于PH-1和PH-2ADV反应混合物无法确定Ct值，这与图10A中所示的数据对应。

根据表3所示的数据，PH-1和PH-2反应混合物之间的Ct值非常相似，这表明可以在一系列条件下预加热致病种类(或包含致病种类的生物样品)，以获得类似的检测灵敏度。此外，PTC-1反应混合物具有与针对PH-1和PH-2反应混合物所确定的Ct值相似的Ct值。PTC-1与PH-1/PH-2方案相似，不同之处在于PTC-1不包括预加热步骤。因此，PTC-1数据与PH-1/PH-2数据的比较表明：在将致病种类提供至反应混合物之前预加热该致病种类对于以良好的灵敏度获得结果可能不是必要的。然而，在使用TB和ADV样品的一些情况下，预加热可能比不进行预加热更差。

然而，对于所测试的所有致病种类，PTC-2的Ct值比PH-1、PH-2或PTC-1中的任何一个的Ct值都低。PTC-1和PTC-2数据的比较表明：使反应混合物经历多个系列的扩增反应(各个系列包括变性和延伸条件的多个循环)可以提高检测灵敏度。

表3：实施例4中的实验的Ct结果

实施例5：样品的多重化(Multiplexing)

进行扩增和检测实验，以基准化(benchmark)各种扩增方案并确定是否可以实现多重化。使包含RNA(例如，H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2)或DNA(例如，ADV、人博卡病毒(HBoV)病毒病原体或DNA细菌病原体(例如，TB))的生物样品经受各种扩增条件。除了来自细菌储备物的TB样品外，各个生物样品均经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。

为了评估扩增方案的多重化能力，在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育三种反应混合物(各自包含H3N2、ADV或H3N2与ADV之混合物中的一种)，该扩增方案包括在94℃下2分钟，在45℃下20分钟，在94℃下1分钟，随后进行在94℃下5秒和在55℃下35秒的50个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。

实验结果以图形示于图11中并在以下示于表4中。如图11所示，H3N2和TB当组合在一起时或在另一个不存在时都可以相似地被检测到。当ADV不存在时，对于H3N2反应混合物记录到Ct值为26.03，而当H3N2不存在时，对于ADV反应混合物记录到Ct值为30.5。当H3N2和ADV合并为单一反应混合物时，得到26(H3N2)和30(ADV)的Ct值。合并的反应混合物与单一组分反应混合物相比，Ct值几乎相同。结果表明：能以良好的灵敏度实现多重化，且可检测RNA和DNA种类两者。

表4：实施例5中的H3N2和ADV多重化实验的结果

类型	样品	Ct
			RNA病毒	H3N2	26.03
DNA病毒	ADV	30.5
			RNA与DNA病毒	H3N2与ADV	26(H3N2)与30(ADV)

在另一个评估扩增方案的多重化能力的实验中，在实时PCR热循环仪中根据扩增方案(包括在95℃下2分钟，随后进行在95℃下5秒和在55℃下30秒的40个循环)孵育三种反应混合物(各自包含H3N2、TB或H3N2与TB之混合物中的一种)。在孵育期间进行扩增产物的检测。

实验结果以图形示于图12中并在以下示于表5中。如图12所示，H3N2和TB当组合在一起时或在另一个不存在时都可以相似地被检测到。当TB不存在时，对于H3N2反应混合物记录到Ct值为32，而当H3N2不存在时，对于TB反应混合物记录到Ct值为32。当H3N2和TB合并为单一反应混合物时，得到29(H3N2)和30(TB)的Ct值。合并的反应混合物与单一组分反应混合物相比，Ct值相似。结果表明：能以良好的灵敏度实现多重化，并且在多重化方案中，可检测RNA和DNA种类两者。

表5：实施例5中的H3N2和TB多重化实验的结果

类型	样品	Ct
			RNA病毒	H3N2	32
DNA病毒	TB	32
			RNA与DNA病毒	H3N2与TB	29(H3N2)与30(TB)

实施例6：多个系列的扩增反应的基准化

进行扩增和检测实验，以基准化包括多个系列的扩增反应的各种扩增方案。使包含RNA(例如，H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2)或DNA(例如，ADV、人博卡病毒(HBoV)病毒病原体或DNA细菌病原体(例如，TB))的生物样品经受各种扩增条件。除了来自细菌储备物的TB样品外，各个生物样品均经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。

在一组实验中，使扩增混合物经历包括两个系列的扩增反应的扩增方案，各个系列包括不同的变性和延伸条件。在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育六份反应混合物(两份包含H3N2，两份包含ADV，两份包含HBoV)，该扩增方案包括在94℃下1秒，随后进行系列1(在94℃下1秒，并且在45℃下10秒)的11个循环，接着进行系列2(在95℃下5秒，并在55℃下30秒)的40个循环。在孵育过程中进行扩增产物的检测。

实验结果在以下示于表6中。如表6所示，所确定的Ct值的范围为8.35至23。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：采用包括多个系列的扩增反应的方案可检测RNA和DNA种类两者。

表6：实施例6中的H3N2、ADV和HBoV实验的结果

类型	样品	Ct
			RNA病毒	H3N2-1	17
RNA病毒	H3N2-2	20
			DNA病毒	ADV-1	18.8
DNA病毒	ADV-2	23
			DNA病毒	HBoV-1	8.35
DNA病毒	HBoV-2	18.37

在另一组实验中，使扩增混合物经历包括三个系列的扩增反应的扩增方案，就其变性和/或延伸条件而言，各个系列彼此不同。在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育五份反应混合物(一份包含sH1N1(2007)，一份包含H3N2，一份包含pH1N1(2009)，一份包含ADV，且一份包含TB)，该扩增方案包括在94℃下1分钟，随后进行系列1(在94℃下5秒，以及在60-50℃下30秒(以1℃/循环步进下降))的5个循环，然后进行系列2(在94℃下5秒和在50℃下30秒)的5个循环，随后在95℃下2分钟，接着进行系列3(在95℃下5秒和在55℃下30秒)的40个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。

实验结果在以下示于表7中。如表7所示，所确定的Ct值的范围为20至30。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：采用包括多个系列的扩增反应的方案可检测RNA和DNA种类两者。

表7：实施例6中的sH1N1(2007)、H3N2、pH1N1(2009)、ADV和TB实验的结果

类型	样品	Ct
			RNA病毒	sH1N1(2007)	22
RNA病毒	H3N2	23
			RNA病毒	pH1N1(2009)	24
DNA病毒	ADV	30
			DNA细菌	TB	20

实施例7：多个系列的扩增反应的基准化

进行扩增和检测实验，以基准化包括多个系列的扩增反应的各种扩增方案。使包含H3N2的生物样品经受各种扩增条件。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。

使扩增混合物经历扩增方案，一些方案包括扩增反应的三个不同第一系列之一和相同的第二系列，所述三个第一系列包括与第二系列不同的变性和延伸条件。第一系列和第二系列中的每一个包括多个循环。另一个实验在没有第一系列的情况下进行，其仅包括第二系列。在实时PCR热循环仪中，根据以下表8中所示的扩增方案之一孵育四份包含H3N2的反应混合物中的每一份：

表8：实施例7中的实验方案

实验结果以图形示于图13中并在以下列于表9中。如图13所示，反应混合物3具有最高的Ct值(28.59)。其他包括多个系列的反应混合物具有范围为8.5至26.5的较低值。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：包括多个系列的扩增反应的方案与仅具有单一系列的方案相比可达到更佳的灵敏度。

表9：实施例7的实验结果

反应混合物	Ct
		1	22.97
2	26.5
		3	28.59
4	8.5

实施例8：多个系列的扩增反应的基准化

进行扩增和检测实验，以基准化包括多个系列的扩增反应的各种扩增方案。使包含H3N2的生物样品经受各种扩增条件。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。

使扩增混合物经历扩增方案，一些方案包括扩增反应的六个第一系列之一和相同的第二系列，所述六个第一系列包括与第二系列不同的变性和延伸条件。另外六个实验在没有第一系列的情况下进行。在实时PCR热循环仪中，根据以下表10中所示的扩增方案之一孵育十二份包含H3N2的反应混合物中的每一份：

表10：实施例8中的实验方案

实验结果在以下列于表11中。Ct值范围为14.53至27.28，且反应混合物2-5没有检测到产物。一般而言，未经历多个系列的扩增反应的反应混合物或者不具有可检测的产物，或者具有比经历多个系列的扩增反应的反应混合物更高的Ct值。结果表明：包括多个系列的扩增反应的方案可用于实现良好的灵敏度。此外，结果还表明：包括多个系列的扩增反应的方案与仅具有单一系列的方案相比可达到更佳的灵敏度。在一些情况下，多个系列的扩增反应对于产生可检测量的扩增产物可能是必需的。

表11：实施例8的实验结果

反应混合物	Ct
		1	26.03
2	-
		3	-
4	-
		5	-
6	27.28
		7	21.64
8	19.56
		9	17.2
10	14.53
		11	19.2
12	-

实施例9：比较经纯化的和未纯化的样品的结果

进行扩增和检测实验，以比较采用经纯化的和未纯化的样品获得的结果。使包含H1N1的经纯化的和未纯化的生物样品经历扩增方案。各个生物样品经由口咽拭子直接从受试者获得。将1微升的每个样品在25μL反应管中与如本文所述进行核酸扩增和检测扩增产物所必需的试剂合并，以获得反应混合物。产生三份反应混合物，其中两份反应混合物包含通过柱纯化或磁性纯化之一纯化的样品。第三份反应混合物包含未纯化的样品。

在实时PCR热循环仪中根据扩增方案孵育反应混合物，该扩增方案包括在94℃下2分钟，在45℃下20分钟，在94℃下1分钟，随后进行在94℃下5秒和在55℃下35秒的50个循环。在孵育过程中进行扩增产物的检测。

实验结果以图形示于图14中并在以下示于表12中。如表12所示，所确定的Ct值的范围为27至31，且在未纯化的样品与通过各种手段纯化的样品之间是相似的。结果表明：样品的纯化对于达到类似的检测灵敏度可能不是必要的。

表12：实施例9的实验结果

样品类型	Ct
		柱纯化	31
磁珠纯化	27
		未纯化的	28

实施例10：全血和唾液样品的分析

对包含H3N2病毒的血液和唾液样品进行扩增和检测实验。测试了四个不同的样品。两个样品包含全血或唾液样品之一，且两个样品包含全血或唾液样品之一的10倍稀释液(在PBS中)。将这四个样品中的每一个与进行病毒RNA的逆转录所必需的试剂和完成从逆转录获得的互补DNA的扩增所必需的试剂合并。进行逆转录和DNA扩增所必需的试剂作为市售的预混合物(例如，TakaraOne-StepRT-PCR或One-StepRT-qPCR试剂盒)来提供，该预混合物包含逆转录酶(例如，Sensiscript和Omniscript转录酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaqDNA聚合酶)和dNTP。此外，该反应管还包含TaqMan探针，该探针包含用于检测扩增的DNA产物的FAM染料。为了生成扩增的DNA产物，在实时PCR热循环仪中根据变性和延伸条件的方案孵育各反应混合物，该方案包括在45℃下20分钟，随后在94℃下2分钟，接着进行在94℃下5秒和在55℃下35秒的42个循环。在孵育期间进行扩增产物的检测。

H3N2的扩增结果以图形示于图15(图15A对应于未稀释的血液，图15B对应于稀释的血液)和图16(图16A对应于未稀释的唾液，图16B对应于稀释的唾液)中。所记录的FAM染料的荧光相对于循环数作图。

如图15和图16所示，未稀释的和经稀释的血液和唾液反应混合物均显示可检测信号，Ct值的范围为24-33。因此，图15和图16所示的数据表明：能以良好的灵敏度分析未稀释的生物样品，Ct值不大于约40。此外，数据还表明：在样品的稀释对于分析是必要的情况下，也可以以类似的方式检测扩增产物。在一些情况下，如果来自样品的抑制剂太多，稀释可以为用于消除来自样品(例如，全血)的抑制的另一种方式。

实施例11：巢式PCR

对含有H1N1病毒的样品进行扩增和检测实验。测试了八个样品。每个样品均包括H1N1(2007)病毒储备物。将样品分别在PBS中按以下表13中所示的稀释度进行稀释。病毒储备物的浓度为1x10⁶IU/mL。为了生成扩增的DNA产物，根据变性和延伸条件的方案对包含给定样品的反应混合物进行孵育。该方案包括：(i)在第一次运行中，将混合物在热循环仪中在94℃下加热1分钟，随后进行10或15个如下循环(如以下表13所示)：在94℃下5秒和在57℃下10秒；以及(ii)在第二次运行中，将混合物在热循环仪中在94℃下加热1分钟，随后进行35个如下循环：在94℃下5秒和在57℃下30秒。将1μL系列稀释样品添加至25μL反应体积的TakaraOne-stepqPCR预混合物中。在第一次运行经过某些循环后，将来自于该反应的1μL添加至第二次运行的反应混合物中。H1N1的扩增结果以图形示于图17中。该图显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。8个样品(1-8)中的每一个的曲线图均已在该图中示出。具有可检测信号的样品具有表13所示的Ct值。

表13：实施例11的实验结果

实施例12：埃博拉重组质粒的扩增和检测

对人全血样品进行扩增和检测实验，该样品包含不同拷贝数的与扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)相对应的重组质粒。测试了八个样品。其中六个样品包含特定拷贝数(250000、25000、2500、250、25和2.5个拷贝)的重组质粒，而两个样品(一个仅含有血液，一个仅含有水)作为对照样品。在未进行样品纯化的情况下对全血样品进行了分析。

将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、dNTP、引物、辅因子、合适的缓冲液、引物等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。按照样品编号对各反应混合物的汇总(包括重组质粒的拷贝数)示于表14中。为了生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。所述两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图18中，每条曲线均用与表14中示出的样品编号相对应的样品编号标出。图18所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图18中的曲线获得的Ct值汇总于表15中。

如图18所示，除样品6外，对于所有包含重组质粒的样品，均经由扩增产物检测到重组质粒。此外，在任一对照样品(样品7和8)中均未检测到重组质粒。因此，图18所示的结果表明，在一些情况下，使用多个系列的变性和延伸条件，并且在不进行样品纯化的情况下，可获得25个质粒拷贝/反应(rxn)的检测灵敏度。

表14：实施例12的实验反应混合物

样品	质粒(拷贝/反应)
		1	250000
2	25000
		3	2500
4	250
		5	25
6	2.5
		7	0(仅有血液)
8	0(仅有水)

表15：由实施例12中的实验确定的Ct值

样品	拷贝/反应	Ct
			1	250000	26.12
2	25000	33.61
			3	2500	37.61
4	250	40.61
			5	25	42.97
6	2.5	---
			7	0	---
8	0	---

实施例13：埃博拉病毒的扩增和检测

对包含不同拷贝数的扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血样品进行扩增和检测实验。一式两份测试了八种样品(重复组1和重复组2)，共16个样品。其中六种样品包含特定拷贝数(2500000、250000、25000、2500、250和25个拷贝)的假病毒，而两种样品(一种仅含有血液，一种仅含有水)作为对照样品。在未进行样品纯化的情况下对全血样品进行了分析。

将每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP、辅因子、引物、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。反应混合物按样品编号的汇总(包括假病毒的拷贝数)示于表16中。为了由假病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图19A(重复组1)和图19B(重复组2)中，每条曲线均用与表16中示出的那些样品编号相对应的样品编号标出。图19A和图19B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图19A和图19B中的曲线获得的Ct值汇总于表17中，其中“Ct1”对应于重复组1，而“Ct2”对应于重复组2。

如图19A和图19B所示，对于所有包含假病毒的样品(样品1-6)，经由扩增产物在两个重复组中均检测到假病毒。此外，在任何对照样品(样品7和8)中均未检测到假病毒。因此，图19A和图19B所示结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件在不进行样品纯化的情况下获得25个病毒拷贝/反应的检测灵敏度。

表16：实施例13的实验反应混合物

样品	假病毒(拷贝/反应)
		1	2500000
2	250000
		3	25000
4	2500
		5	250
6	25
		7	0(仅有血液)
8	0(仅有水)

表17：由实施例13中的实验确定的Ct值

样品	拷贝/反应	Ct 1	Ct 2
				1	2500000	8.57	8.44
2	250000	12.09	11.27
				3	25000	15.03	14.99
4	2500	18.90	18.87
				5	250	21.71	21.71
6	25	27.86	39.42
				7	0(仅有血液)	---	---
8	0(仅有水)	---	---

实施例14：埃博拉病毒的扩增和检测

对包含不同拷贝数的扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血样品进行扩增和检测实验。测试了八个样品。其中六个样品包含特定拷贝数(2500000、250000、25000、2500、250和25)的假病毒，而两个样品(一个含有20000个拷贝的假病毒阳性对照，一个仅含有水)作为对照样品。在未进行样品纯化的情况下对全血样品进行了分析。

将每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。各反应混合物按样品编号的汇总(包括假病毒的拷贝数)示于表18中。为了由假病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的35个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图20中，每条曲线均用与表18中示出的那些样品编号相对应的样品编号标出。图20所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图20中的曲线获得的Ct值汇总于表19中。

如图20所示，对于所有包含假病毒的样品(样品1-6)，包括包含阳性对照假病毒的样品(样品7)，经由扩增产物均检测到假病毒。此外，在仅含水的对照样品(样品8)中未检测到假病毒。因此，图20所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件在不进行样品纯化的情况下获得25个病毒拷贝/反应的检测灵敏度。

表18：实施例14的实验反应混合物

样品	假病毒(拷贝/反应)
		1	2500000
2	250000
		3	25000
4	2500
		5	250

6	25
		7	20000(阳性对照假病毒)
8	0(仅有水)

表19：由实施例14中的实验确定的Ct值

样品	拷贝/反应	Ct
			1	2500000	10.44
2	250000	13.30
			3	25000	16.14
4	2500	19.62
			5	250	22.92
6	25	30.00
			7	20000(阳性对照)	15.94
8	0(仅有水)	---

实施例15：埃博拉病毒的扩增和检测

对包含两种拷贝数(250个拷贝/反应或25个拷贝/反应)之一的扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血样品进行扩增和检测实验。对于总共八个样品，每个全血样品均使用四种试剂体系之一进行测试。每种试剂体系(B-1、B-2、B-3和B-4)均包含对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)。各种不同的试剂体系在试剂体系中含有不同浓度的多种组分。将每个全血样品与其适当的试剂体系合并成30μL的反应混合物。各反应混合物按样品编号的汇总(包括假病毒的拷贝数和试剂体系)在以下示于表20中。为了由假病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的15个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的40个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。该实验的扩增曲线以图形示于图21中，每条曲线均用与表20中所示的那些样品编号相对应的样品编号标出。图21所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图21中的曲线获得的Ct值汇总于表21中。

如图21所示，对于所有样品，包括含有25个拷贝/反应的样品，经由扩增产物均检测到假病毒。因此，图21所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件，使用不同的试剂体系，且在不进行样品纯化的情况下，获得25个病毒拷贝/反应的检测灵敏度。

表20：实施例15的实验反应混合物

表21：由实施例15中的实验确定的Ct值

样品	拷贝/反应	Ct
			1	250	20.38
2	25	24.82

3	250	20.62
			4	25	24.05
5	250	20.26
			6	25	25.09
7	250	19.86
			8	25	24.00

实施例16：扎伊尔埃博拉病毒的实时PCR检测

使用本发明的一步(one-step)qPCR方法来分析患者血清样品的扎伊尔埃博拉病毒。该样品未经纯化。该样品包括九个扎伊尔埃博拉病毒阳性样品和七个扎伊尔埃博拉病毒阴性样品。使用RocheLC96实时PCR系统。

本实施例中用于分析样品的程序示于表22中。

表22：热循环程序

该一步qPCR方法的结果示于表23中。与经验证的试剂和方法相比，该一步qPCR方法在测试扎伊尔埃博拉病毒方面显示出100％的一致性。

表23：结果

实施例17：疟疾的扩增和检测

对包含未知浓度的疟疾病原体的人全血样品进行扩增和检测实验。完成了两组实验。在第一组实验中，对人全血样品的1：4稀释液(在1XPBS中)完成了重复实验；对包含全血和与疟疾病原体相对应的质粒的样品完成了实验；并且对仅含水的对照完成了实验。在第二组实验中，对包含人全血样品在1XPBS中的多个稀释液(1：4、1：40、1：400、1：4000、1：40000和1：400000)的样品与仅有血液和仅有水的对照样品完成了实验。在未进行样品纯化的情况下分析了全血样品。

将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、引物、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。第一组实验的反应混合物按样品编号的汇总(包括稀释度)示于表24中。第二组实验的反应混合物按样品编号的汇总(包括稀释度)示于表25中。为了由疟疾病原体生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的13个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线。第一组实验的扩增曲线以图形示于图22A中，而第二组实验的扩增曲线以图形示于图22B中。各条曲线分别用其在表24和表25中相应的样品编号标出。图22A和图22B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。

如图22A所示，对于包含全血样品(样品1和2)的两种反应混合物以及对于包含重组质粒的阳性对照(样品3)，经由扩增产物检测到疟疾病原体。此外，在仅有水的对照样品(样品4)中未检测到疟疾病原体。因此，图22A所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件在不进行样品纯化的情况下对疟疾病原体进行检测。

如图22B所示，对于包含全血样品(样品1-6)的所有反应混合物，经由扩增产物检测到疟疾病原体。此外，在仅有水和仅有血液的对照样品(样品7和8)中未检测到疟疾病原体。因此，图22B所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件且在不进行样品纯化的情况下，在高达1：400000的稀释度下检测病原体，包括疟疾病原体。

表24：实施例17中的第一组实验的实验反应混合物

样品	稀释度
		1	1：4
2	1：4

3	1：2(全血对照中的质粒)
		4	零(仅有水)

表25：实施例17中的第二组实验的实验反应混合物

样品	稀释度
		1	1：4
2	1：40
		3	1：400
4	1：4000
		5	1：40000
6	1：400000
		7	0(仅有血液)
8	0(仅有水)

实施例18：登革病毒的扩增和检测

对从包含未知浓度的登革病毒的培养物中获得的样品进行扩增和检测实验。完成了三组实验。在第一组实验中，对未稀释的培养物完成了重复实验；对培养物的1：10稀释液完成了实验；并对仅有水的对照完成了实验。在第二组实验中，对培养物的多个稀释液(未稀释、1：10、1：100、1：1000、1：10000、1：100000和1：1000000)以及仅有水的对照样品完成了实验。在第三组实验中，对培养物的多个稀释液(未稀释、1：10、1：100、1：1000和1：10000)以及仅有水的对照样品完成了实验。在未进行样品纯化的情况下分析了培养物样品。

将2μL的每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成30μL反应混合物。关于反应混合物的汇总(包括稀释度)，第一组实验的示于表26中，第二组实验的示于表27中，而第三组实验的示于表28中。为了由病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，在42℃下1分钟，进行在95℃下5秒和在45℃下10秒的10个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在55℃下10秒的45个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线。第一组实验的扩增曲线以图形示于图23A中，第二组实验的扩增曲线以图形示于图23B中，而第三组实验的扩增曲线以图形示于图23C中。每条曲线分别用其在表26、表27和表28中相应的样品编号标出。图23A、图23B和图23C所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。由示于图23A、图23B和图23C中的曲线获得的Ct值分别示于表26、表27和表28中。

如图23A所示，对于包含病毒的三种反应混合物(样品1-3)，经由扩增产物检测到病毒。此外，在仅有水的对照样品(样品4)中未检测到病毒。因此，图23A所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件检测登革病毒。

如图23B所示，对于包含登革病毒并且未稀释(样品1)或稀释至最高达1：1000(样品2、3和4)的反应混合物，经由扩增产物检测到病毒。然而，未确定1：1000反应混合物(样品4)的Ct值。在较高稀释度(样品5、6和7)或在仅有水的对照样品(样品8)中均未检测到病毒。因此，图23B所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件并在不进行样品纯化的情况下，在最高达1：1000的稀释度时检测到病毒，其中在最高达1：100的稀释度时可产生Ct值。

如图23C所示，对于包含登革病毒并且未稀释(样品1)或稀释至最高达1：1000(样品2、3和4)的反应混合物，经由扩增产物检测到病毒。然而，未确定1：1000反应混合物的Ct值。在较高稀释度(样品5)或在仅有水的对照样品(样品6)中均未检测到病毒。因此，图23C所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的变性和延伸条件并在不进行样品纯化的情况下，在最高达1：1000的稀释度时检测到病毒，其中在最高达1：100的稀释度时可产生Ct值。

表26：实施例18中第一组实验的实验反应混合物和确定的Ct值

样品	稀释度	Ct值
			1	未稀释	19.32
2	未稀释	20.40
			3	1：10	23.23
4	不含病毒(仅有水)	---

表27：实施例18中第二组实验的实验反应混合物和确定的Ct值

样品	稀释度	Ct值
			1	未稀释	20.85
2	1：10	25.14
			3	1：100	31.57
4	1：1000	---
			5	1：10000	---
6	1：100000	---
			7	1：1000000	---
8	不含病毒(仅有水)	---

表28：实施例18中第三组实验的实验反应混合物和确定的Ct值

样品	稀释度	Ct值
			1	未稀释	19.22
2	1：10	22.43

2	1：100	26.55
			4	1：1000	---
5	1：10000	---
			6	不含病毒(仅有水)	---

实施例19：单核苷酸多态性(SNP)的检测

对包含特定基因型的细胞色素P4502C19、CYP2C19*2(具有“GA”基因型)或CYP2C19*3(具有“GG”基因型)的人口咽拭子或血液样品进行扩增和检测实验。进行了两组实验—一组针对从人口咽拭子获得的样品且一组针对从血液获得的样品。在第一组实验中，在未进行样品纯化的情况下分析了从人口咽拭子获得的七个不同的样品。在第二组实验中，在未进行样品纯化的情况下分析了五个不同的血液样品。

将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、引物、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及两种报告剂(例如，用于检测核酸扩增的包含FAM染料的寡核苷酸探针，用于检测“GA”基因型的包含德克萨斯红染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。为了产生扩增产物，使各反应混合物经历热循环方案，该方案包括在95℃下5分钟，随后进行在95℃下5秒和在49℃下10秒的50个循环。在热循环过程中，记录来自报告剂的信号以产生扩增曲线。第一组实验(人口咽拭子)的扩增曲线以图形示于图24A(对应于FAM寡核苷酸探针的信号)和图24B(对应于德克萨斯红寡核苷酸探针的信号)中。第二组实验(血液样品)的扩增曲线以图形示于图25A(对应于FAM寡核苷酸探针的信号)和图25B(对应于德克萨斯红寡核苷酸探针的信号)中。图24A、图24B、图25A和图25B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。每条曲线均用其在表29(口咽拭子实验)或表30(血液实验)中相应的反应混合物编号标出。由扩增曲线确定的Ct值也与确定的基因型一起示于表29或表30中。在图24B或图25B中，在观察到来自德克萨斯红的信号的扩增曲线中，确定相应的反应混合物具有“GA”基因型。此外，在图24B或图25B中，在未观察到来自德克萨斯红的信号的扩增曲线中，确定相应的反应混合物具有“GG”基因型。

如图24A所示，对于含有从口咽拭子获得的样品的每种反应混合物均观察到扩增产物，表明发生了核酸的扩增。然而，如图24B所示，仅在一些含有从口咽拭子获得的样品的反应混合物(反应混合物1、4、6和7)中观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GA”基因型。在其他反应混合物(反应混合物2、3和5)中，未观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GG”基因型。使用从口腔拭子样品提取的DNA通过扩增和检测实验验证了图24A和24B所示的结果(数据未示出)。因此，图24A和图24B所示的结果表明，在一些情况下，可在从口咽拭子获得的样品中通过实时扩增在不进行样品纯化的情况下检测SNP。

如图25A所示，对于含有从血液获得的样品的每种反应混合物均观察到扩增产物，表明发生了核酸的扩增。然而，如图25B所示，仅在一些含有从血液获得的样品的反应混合物(反应混合物1、2和5)中观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GA”基因型。在其他反应混合物(反应混合物3和4)中，未观察到扩增产物，这些反应混合物对应于“GG”基因型。使用核酸测序验证了图25A和25B所示的结果。因此，图25A和图25B所示的结果表明，在一些情况下，可在从血液获得的样品中通过实时扩增在不进行样品纯化的情况下检测SNP。

表29：对于实施例19中的口咽拭子实验所确定的Ct值和基因型

表30：对于实施例19中的血液实验所确定的Ct值和基因型

实施例20：55型腺病毒(ADV55)和7型腺病毒(ADV7)的扩增和检测

对从口咽拭子获得的包含不同拷贝数的55型腺病毒(ADV55)或未知浓度的7型腺病毒(ADV7)的样品进行扩增和检测实验。完成了两组实验—一组针对具有ADV55的样品且一组针对采有ADV7的实验。在第一组实验中，在未进行样品纯化的情况下完成了采用包含不同拷贝数(1、10、100、1000、10000和100000个拷贝)的ADV55的样品的六个不同实验，并一起完成了阴性对照实验。在第二组实验中，在未进行样品纯化的情况下，完成了采用包含未知拷贝数的ADV7的样品的八个不同实验。

将每个样品与对于核酸扩增所必需的试剂(例如，DNA聚合酶、引物、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。对第一组实验的反应混合物的汇总(包括ADV55的拷贝数)示于表31中。为了由病毒生成扩增产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的20个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在60℃下34秒的35个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线并获得Ct值。第一组实验的扩增曲线以图形示于图26A中，每条曲线均用与表31中示出的那些反应混合物编号相对应的反应混合物编号标出。第二组实验的扩增曲线以图形示于图26B中并且相应的Ct值示于表32中。在图26B中的扩增曲线与表32所示的反应混合物编号相对应时，标出该扩增曲线。图26A和图26B所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。

如图26A所示，对于所有包含含有病毒的样品的反应混合物(反应混合物1-6)，经由扩增产物均检测到ADV55。此外，在阴性对照反应混合物(反应混合物7)中未检测到病毒。因此，图26A所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件，在不进行样品纯化的情况下且在多种稀释水平下检测ADV55病毒。

如图26B所示，对于所有反应混合物经由扩增产物均检测到ADV7。因此，图26B所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件且在不进行样品纯化的情况下检测ADV7病毒。

表31：实施例20中的ADV55实验的实验反应混合物

反应混合物	ADV55拷贝数/反应
		1	1
2	10
		3	100
4	1000
		5	10000
6	100000
		7	0(阴性对照)

表32：对于实施例20中的ADV7实验所确定的Ct值

反应混合物	Ct值
		1	5.12
2	7.16
		3	10.97
4	14.15
		5	17.58
6	20.29
		7	22.13
8	17.66

实施例21：具甲的RNA丙型肝炎病毒(RNA-HCV)的扩增和检测

对包含不同拷贝数的具甲的RNA丙型肝炎病毒(RNA-HCV)的血浆样品进行扩增和检测实验。在未进行样品纯化的情况下完成了采用包含不同拷贝数(10、100和500个拷贝)的RNA-HCV的样品的三个不同实验，并一起完成了针对阴性对照的实验。

将每个样品与对于逆转录和核酸扩增所必需的试剂(例如，逆转录酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以及报告剂(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探针)合并成反应混合物。反应混合物的汇总(包括RNA-HCV的拷贝数)示于表33中。为了由病毒生成扩增的DNA产物，使各反应混合物经受两个系列的变性和延伸条件。这两个系列如下：(i)在第一系列中，进行在95℃下1秒和在45℃下1秒的20个循环，随后在95℃下1分钟；及(ii)在第二系列中，进行在95℃下5秒和在60℃下34秒的55个循环。在第二系列期间，记录来自于报告剂的信号从而产生扩增曲线。第一组实验的扩增曲线以图形示于图27中，每条曲线用与表33中示出的反应混合物编号相对应的编号标出。图27所示的结果显示了作为循环数的函数的所记录的相对荧光单位(RFU)。

如图27所示，对于所有包含含有病毒的样品的反应混合物(反应混合物1-3)，经由扩增产物均检测到RNA-HCV。此外，在阴性对照反应混合物(反应混合物4)中未检测到RNA-HCV。因此，图27所示的结果表明，在一些情况下，可使用多个系列的延伸和变性条件在不进行样品纯化的情况下检测RNA-HCV。也可达到10个拷贝/反应的检测灵敏度。

表33：实施例21中的RNA-HCV实验的实验反应混合物

反应混合物	RNA-HCV拷贝数/反应
		1	10
2	100
		3	500
4	0(阴性对照)

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅仅是以示例的方式提供的。本领域技术人员在不背离本发明的情况下，现将想到大量变化、改变和替代。应当理解，本文描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于，用以下权利要求限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (84)

1.一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，其包括：

(a)提供包含所述生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对所述靶RNA的引物组；及

(b)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶RNA。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述试剂进一步包含报告剂，该报告剂产生指示存在所述扩增DNA产物的可检测信号。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述可检测信号的强度与所述扩增DNA产物或靶RNA的量成比例。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述报告剂是染料。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述引物组包含一条或多条引物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述引物组包含用于产生与所述靶RNA互补的链的第一引物。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述靶RNA为病毒RNA。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述反应容器包含主体和盖。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述反应容器采取移液管头的形式。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述反应容器是反应容器阵列的一部分。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述反应容器可被液体处理装置单独地寻址。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述反应容器包含两个或更多个热区。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述变性温度为约90℃至100℃。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述变性温度为约92℃至95℃。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述延伸温度为约35℃至72℃。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述延伸温度为约45℃至65℃。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述变性持续时间少于或等于30秒。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述延伸持续时间少于或等于30秒。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述靶RNA在步骤(a)前未经历浓缩。

20.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)中，所述生物样品未经历RNA提取。

21.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之前或期间向所述反应容器中加入裂解剂的步骤。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是来自所述受试者的生物流体。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增以小于40的循环阈值(Ct)产生指示在所述生物样品中存在所述靶RNA的可检测量的DNA产物。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增在10分钟或更短的时段产生指示在所述生物样品中存在所述靶RNA的可检测量的DNA产物。

25.如权利要求1所述的方法，其中所述反应容器是密封的。

26.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA扩增是聚合酶链反应。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述聚合酶链反应是巢式聚合酶链反应。

28.如权利要求1所述的方法，其中在所述引物延伸反应的一个或多个循环期间，所述靶RNA从所述生物样品中释放。

29.一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，其包括：

(a)接收已从所述受试者获得的所述生物样品；

(b)提供包含所述生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对所述靶RNA的引物组；

(c)使所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在所述生物样品中存在所述靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；

(d)检测(c)的扩增DNA产物的所述量；及

(e)将关于扩增DNA产物的所述量的信息输出至接收者，

其中，用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述接收者是进行治疗的医师、制药公司或所述受试者。

31.如权利要求29所述的方法，其中(b)包括DNA扩增。

32.如权利要求29所述的方法，其中(c)进行30个或更少的循环。

33.如权利要求29所述的方法，其中所述信息作为报告而输出。

34.如权利要求29所述的方法，其中所述信息输出至电子显示器。

35.如权利要求29所述的方法，其中所述时间量小于或等于10分钟。

36.一种扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的方法，其包括：

(a)提供包含所述生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组；及

(b)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述靶核酸是核糖核酸。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述试剂对于与脱氧核糖核酸扩增平行地进行逆转录扩增是必需的。

39.如权利要求36所述的方法，其中，在(b)中，所述扩增产物是扩增的脱氧核糖核酸产物。

40.如权利要求36所述的方法，其中，在(a)中，所述生物样品未经纯化。

41.如权利要求36所述的方法，其中，在(a)中，所述生物样品经浓缩。

42.如权利要求36所述的方法，其中，在(a)中，所述生物样品经稀释。

43.如权利要求36所述的方法，其进一步包括使所述靶核酸在(b)之前经受一个或多个变性条件。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述一个或多个变性条件选自变性温度分布和变性剂。

45.如权利要求36所述的方法，其进一步包括使所述靶核酸在所述多个系列的引物延伸反应的第一系列与第二系列之间经受一个或多个变性条件。

46.如权利要求36所述的方法，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意一个而言，所述单个系列不同。

47.如权利要求46所述的方法，其中就变性温度与延伸温度之间的斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的至少任意两个而言，所述单个系列不同。

48.如权利要求36所述的方法，其中所述多个系列的引物延伸反应包括第一系列和第二系列，所述第一系列包括超过10个循环，所述第一系列的每个循环包括(i)在约92℃-95℃下孵育所述反应混合物不超过30秒，随后(ii)在约35℃-65℃下孵育所述反应混合物不超过1分钟，所述第二系列包括超过10个循环，所述第二系列的每个循环包括(i)在约92℃-95℃下孵育所述反应混合物不超过30秒，随后(ii)在约40℃-60℃下孵育所述反应混合物不超过1分钟。

49.如权利要求36所述的方法，其中与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，所述多个系列的引物延伸反应以较低的循环阈值产生指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的可检测量的扩增产物。

50.如权利要求36所述的方法，其进一步包括，在(b)之前，将所述生物样品在90℃至100℃的预加热温度下预加热不超过10分钟的预加热持续时间。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述预加热持续时间不超过约1分钟。

52.一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的系统，其包括：

(a)输入模块，其接收扩增所述生物样品中的所述靶RNA的用户请求；

(b)扩增模块，其响应于所述用户请求：

在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含所述生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂，所述试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对所述靶RNA的引物组；及

使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶RNA；及

(c)可操作地耦合至所述扩增模块的输出模块，其中所述输出模块将关于所述靶RNA或所述DNA产物的信息输出至接收者。

53.一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的系统，其包括：

(a)输入模块，其接收扩增所述生物样品中的所述靶RNA的用户请求；

(b)扩增模块，其响应于所述用户请求：

(i)在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含已从所述受试者获得的所述生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂，所述试剂包含(1)逆转录酶，和(2)针对所述靶RNA的引物组；及

(ii)使所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在所述生物样品中存在所述靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；

(iii)检测(iii)的扩增DNA产物的所述量；及

(iv)将关于扩增DNA产物的所述量的信息输出至接收者，

其中，用于完成(i)-(iv)的时间量小于或等于约30分钟；及

(c)可操作地耦合至所述扩增模块的输出模块，其中所述输出模块将所述信息传送至接收者。

54.一种用于扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统，其包括：

(a)输入模块，其接收扩增所述生物样品中的所述靶核酸的用户请求；

(b)扩增模块，其响应于所述用户请求：

在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含所述生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂，所述试剂包含(i)DNA聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组；及

使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列；及

(c)可操作地耦合至所述扩增模块的输出模块，其中所述输出模块将关于所述靶核酸或所述扩增产物的信息输出至接收者。

55.一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，该机器可执行代码在被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核酸(RNA)的方法，该方法包括：

(a)提供包含所述生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对所述靶RNA的引物组；及

(b)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶RNA。

56.一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，该机器可执行代码在被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，该方法包括：

(a)接收已从所述受试者获得的所述生物样品；

(b)提供包含所述生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对所述靶RNA的引物组；

(c)使所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在所述生物样品中存在所述靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；

(d)检测(c)的DNA产物的所述量；及

(e)将关于DNA产物的所述量的信息输出至接收者，

其中，用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。

57.一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，该机器可执行代码在被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的方法，该方法包括：

(a)提供包含所述生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)DNA聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组；及

(b)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

58.一种用于扩增从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统，其包括：

电子显示屏，其包含显示图形元素的用户界面，该图形元素可被用户访问，以执行用以扩增所述生物样品中的所述靶核酸的扩增方案；和

计算机处理器，其耦合至所述电子显示屏，并且被编程为在所述用户选择所述图形元素时执行所述扩增方案，该扩增方案包括：

使包含所述生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

59.如权利要求58所述的系统，其中所述扩增方案进一步包括为所述靶核酸选择引物组。

60.如权利要求58所述的系统，其中所述试剂包含(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组。

61.如权利要求58所述的系统，其中所述用户界面显示多个图形元素，其中所述图形元素中的每一个与多个扩增方案中的给定扩增方案相关联。

62.如权利要求61所述的系统，其中所述图形元素中的每一个与疾病相关联，并且其中所述多个扩增方案中的给定扩增方案指向测定所述受试者中所述疾病的存在。

63.如权利要求62所述的系统，其中所述疾病与病毒相关。

64.如权利要求63所述的系统，其中所述病毒是RNA病毒。

65.如权利要求63所述的系统，其中所述病毒是DNA病毒。

66.如权利要求63所述的系统，其中所述病毒选自人免疫缺陷病毒I(HIVI)、人免疫缺陷病毒II(HIVII)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒和水痘病毒。

67.如权利要求66所述的系统，其中所述流感病毒选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。

68.如权利要求66所述的系统，其中所述腺病毒是55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。

69.如权利要求66所述的系统，其中所述丙型肝炎病毒是具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。

70.如权利要求61所述的系统，其中所述疾病与致病细菌或致病原生动物相关。

71.如权利要求68所述的系统，其中所述致病细菌是结核分枝杆菌。

72.如权利要求68所述的系统，其中所述致病原生动物是疟原虫。

73.如权利要求58所述的系统，其中所述靶核酸与疾病相关。

74.如权利要求73所述的系统，其中所述扩增方案指向基于所述扩增产物的存在而测定所述疾病的存在。

75.如权利要求73所述的系统，其中所述疾病与病毒相关。

76.如权利要求75所述的系统，其中所述病毒是RNA病毒。

77.如权利要求75所述的系统，其中所述病毒是DNA病毒。

78.如权利要求75所述的系统，其中所述病毒选自人免疫缺陷病毒I(HIVI)、人免疫缺陷病毒II(HIVII)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒和水痘病毒。

79.如权利要求78所述的系统，其中所述流感病毒选自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。

80.如权利要求78所述的系统，其中所述腺病毒是55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。

81.如权利要求78所述的系统，其中所述丙型肝炎病毒是具甲的RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。

82.如权利要求73所述的系统，其中所述疾病与致病细菌或致病原生动物相关。

83.如权利要求82所述的系统，其中所述致病细菌是结核分枝杆菌。

84.如权利要求82所述的系统，其中所述致病原生动物是疟原虫。