CN105116068A - 一种香型可可育种材料的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物信息技术领域，公开了一种香型可可育种材料的鉴定方法。本发明所述鉴定方法包括：1)可可样品中香气组分的检测；2)可可样品中香气物质的鉴定与数据矩阵的建立；3)计算香型可可与普通可可样品间的香气组成的平均欧氏距离，并利用组间平均距离法进行香型可可与普通可可聚类分析；4)未知可可材料的快速识别。本发明提供的鉴定方法，可广泛用于可可选育种中香型材料的快速鉴定和市场上香型可可豆的真伪识别，其分析时间短，准确率高，实用性强，解决了可可选育种中香型可可材料鉴定技术缺乏、鉴定难度大、耗时长的问题。

Description

一种香型可可育种材料的鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，具体的说是涉及一种香型可可育种材料的鉴定方法。

背景技术

可可(TheobromacacaoL.)又称巧克力树，为热带重要的多年生经济作物，与茶叶、咖啡并称为“世界三大饮料作物”。其种子富含脂肪、多酚、黄酮类化合物和膳食纤维等活性成分，具有改善心脏、肾脏、肠道功能、缓解心绞痛、促进消化、治疗贫血等保健作用，是制作巧克力、高级饮品、糖果、糕点和冰淇淋等主要原料。作为一种深受人们喜爱的饮料食品和具有重要用途的热带农产品，长期以来存在需求旺盛与供应不足的问题。近年来，世界可可豆年产量约500万吨，其产品出口量为494.9万吨，贸易额达139亿美元。随着生活水平不断提高和饮食结构变化，可可的需求量还将大幅增加。可可已成为发展中国家热区农业经济收入的特殊组成，对发展热带经济，提高边远地区农民收入和生活水平具有重要意义。

目前，国际可可贸易市场将可可豆分为普通级(Bulkcocoa,BC)和香型级(Finecocoa，FC)两类，后者具有明显的“花香”和“果香”风味，且其市场价格是普通豆的140％。然而，世界香型可可豆年产量仅16万吨，约占可可总产量的4％，香型可可原料的供需矛盾极为突出。据国际可可组织市场调研报告显示，仅厄瓜多尔、秘鲁、哥伦比亚、墨西哥、巴布新几内亚等8个国家生产香型可可，且品种香气品质受地域限制性极强。比如，哥伦比亚出口的香型可可品种为Criollo，年产量仅为42.2吨；多米尼加出口的香型可可品种为HispaniolaTrinitario，年产量仅为54.0吨；墨西哥出口的香型可可品种为arribaNacional、XoconuscoCriollo，年产量为21.0吨；委内瑞拉出口的香型可可品种为Criollo和Trinitario，年产量仅为18.0吨。目前，全球香型可可供给量以厄瓜多尔的arribaNacional品种为主，占世界香型可可产量的75％，但品种间杂交导致品质退化，约1/4产量被列入普通级可可。同时，不法商贩在香型可可豆中掺杂普通级豆的现象屡见不鲜，严重制约了可可市场的良性发展。因此，香型可可新品种的选育成为产业发展的迫切需要。而获得优异性状的香型可可育种材料是提高优质可可育种效率的充要条件。

可可为热带木本经济作物，其杂交育种新品种选育周期在10年以上。在杂交亲本的选配中，如果对育种材料的性状鉴定不准确，往往会使育种成效进展缓慢，甚至劳而无功。尤其在香型可可品种选育种中该问题更为突出，主要表现在(1)香型育种材料缺乏、资源混杂，如目前世界主栽的香型可可品种是厄瓜多尔的arribaNacional，其次为秘鲁的Nacional，在香型遗传资源上表现为遗传基础狭窄；目前，可可栽培品种均是由其三大遗传类群Criollo,Forastero和Trinitario中演化而来，但因Criollo、Trinitario遗传类群与Forastero遗传类群的香味差异很大，有时人们常将Criollo和Trinitario遗传类群笼统地归为香型可可。这在一定程度上扩大了香型可可品种的范畴，而将普通可可品种错误地归为香型可可品种，在市场上容易造成掺假问题。如厄瓜多尔的arribaNacional品种属于Forastero遗传类群，而非Criollo和Trinitario遗传类群；(2)香型可可与普通可可鉴定难度大、周期长，准确性低，如厄瓜多尔的arribaNacional品种是厄瓜多尔本土生长的味觉独特的香型可可，该品种是自然杂交的结果，因其独特的“果香”、“花香”味觉，被定义为香型可可。目前，国际可可市场香型可可75％供给量都是该品种，因此，该品种是香型可可的典型代表。秘鲁的Nacional品种，该品种生长在秘鲁的马拉尼峡谷(MaranonCanyon)，为当地农户栽培种植的农家种，但是直到2011年美国农业部(USDAARS)对秘鲁可可资源考察时，才发现秘鲁的Nacional品种属于香型可可，且该品种曾被错误地鉴定位厄瓜多尔的arribaNacional品种。综上所述，目前，香型可可品种很少，而判断与普通可可的区别，多依靠栽培地域来源、品种属三大遗传类群的哪一类别及其长期从事可可工作的经验来判断(具有这种经验的人并不是很多，也就是说靠经验判断的方法不具有普遍性)，尚缺乏科学的可可香味品质的精确鉴定技术，给可可杂交育种中香型可可育种材料的准确选配造成很大困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种准确度高、周期短、简便的香型可可育种材料的鉴定方法，为香型可可品种的鉴定和选育提供科学的依据和指导。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种香型可可育种材料的鉴定方法，包括

步骤1、将未经发酵和烘焙的至少4种已知香型可可和至少4种已知普通可可，采用顶空固相微萃取方法分别富集其中的香气成分，利用GC/MS技术进行香气成分的检测分析；

步骤2、利用GC/MS获得香气成分出峰时间、含量、强度及其分子量大小信息，在GC/MS系统数据库NIST2008中鉴定出相匹配的香气物质，同时测定其相同升温程序下的Kovats保留指数辅助鉴定香气物质；

步骤3、将步骤1和步骤2中GC/MS系统获得的香气成分信息转化为“m×(K+n)”矩阵，m代表鉴定获得的香气物质数量总和，K代表各香气物质的Kovats保留指数，n代表共n个已知香型可可与已知普通可可样品的各香气物质的含量；

步骤4、待测的未知可可按照步骤2、步骤3的方法，将其GC/MS香气成分信息全部转化后，汇编入步骤3所形成的“m×(K+n)”矩阵，形成“m×(K+(n+x))”矩阵，x代表x个未知可可的的各香气物质的含量；然后，通过计算x个待测未知可可样品与共n个已知香型可可和已知普通可可样品之间的香气组成平均欧氏距离，并利用组间平均距离法进行聚类分析，获得未知可可和已知香型可可以及已知普通可可香气组成的聚类分析谱系图，从而判别x个待测可可样品是否属于香型可可。

本发明为解决香型可可新品种选育中香型育种材料鉴定难度大、周期长、准确性低等鉴定技术问题，采用顶空固相微萃取方法分别富集已知香型可可品种与普通可可品种中的香气成分，利用气相色谱—质谱联用(GC-MS)技术进行香气成分的检测分析，筛选出香型可可品种的特征香气因子，提供一种基于GC-MS技术的香型可可育种材料鉴定方法。

其中，作为优选，所述已知香型可可数量为4种，普通可可数量为4种；或已知香型可可数量为4种，普通可可数量为5种；或已知香型可可数量为5种，普通可可数量为6种；或已知香型可可数量为5种，普通可可数量为7种。

作为优选，所述未经发酵和烘焙的已知香型可可和已知普通可可的含水量均低于8％。

作为优选，所述固相微萃取方法具体步骤为：

选择二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维头，使用前将固相微萃取纤维头在气相色谱的进样口老化；

准确称取已粉碎的可可样品，置于萃取瓶底部，水浴加热，用老化后的固相微萃取纤维头通过聚四氟乙烯瓶垫插入到萃取瓶中，置于可可样品正上方进行顶空萃取。

更优选地，所述固相微萃取方法具体步骤为：

选择50/30μm、二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维头；使用前将固相微萃取纤维头在气相色谱的进样口老化，老化温度250℃，老化时间30min；

准确称取2.00g已粉碎的可可样品，置于15ml萃取瓶底部，于60℃水浴中加热30min，用老化后的固相微萃取纤维头通过聚四氟乙烯瓶垫插入到萃取瓶中，置于可可样品正上方0.5cm左右，顶空萃取15min。

作为优选，所述利用GC/MS技术进行香气成分的检测分析具体为：

采用顶空固相微萃取方法富集的香气成分，即富集香气成分的固相微萃取纤维头，插入GC进样口，解析5min，同时以吸附空顶空样品瓶中的气体作为空白对照，然后以DB-WAX毛细管柱为色谱柱进行GC/MS检测分析。

更优选地，所述GC的参数条件为：

载气为高纯氦气，不分流进样，恒流流速1mL·min^-1，柱箱采用程序升温，起始40℃，保持5min，以速度4℃/min升到180℃，保持2min，再以10℃/min升到260℃，保持3min。进样口温度250℃，接口温度280℃。

更优选地，所述MS的参数条件为：

电子轰击离子源，电子能量69.922eV，离子源温度230℃，MS四级杆150℃，电子倍增器电压1670.588V，质量扫描范围m/z35-500aum，全扫描快速扫描。

作为优选，所述Kovats保留指数的测定步骤为：

利用1μlC₇–C₃₀正构烷烃混标按香气成分GC/MS测定时的程序升温进行分析，测定其相同升温程序下的Kovats保留指数(Kovats保留指数是Kovats1958年提出来的，LRI是计算Kovats保留指数的一种方法，指的是线性程序升温保留指数)

$LRI=100\×n+\frac{100\×\left(t_x-t_n\right)}{t_{n+1}-t_n}$

其中，t_x，t_n，t_n+1分别为被分析成分和碳原子数处于n和n+1之间的正构烷烃的流出峰的保留指数，t_n＜t_x＜t_n+1。

作为优选，所述利用GC/MS获得香气成分含量步骤为：

以3-辛醇为内标化合物(浓度0.814g·ml^-1)进行半定量分析，计算各香气物质组分的含量，计算公式如下：

其中，f为个香气组分对内标物的矫正因子。

为了确保本发明所述鉴定方法运用聚类分析的可行性，本发明在步骤3获得矩阵信息后，利用ANOSIM非参数检验法，依据步骤3中矩阵信息检验已知香型可可与已知普通可可香气组成的差异性，若已知香型可可与普通可可在香气物质组成上存在显著性差异，从数理统计角度说明香气物质组成的差异，可以衡量香型可可与普通可可的不同之处，通过计算已知香型可可样品与已知普通可可样品间的平均欧氏距离，并利用组间平均距离法进行已知香型可可与已知普通可可聚类分析，获得已知香型可可与已知普通可可香气组成的聚类分析谱系图；若香型可可与普通可可在香气物质组成不存在显著性差异，则其香气组成类同，将不能进行聚类分析；

所述ANOSIM非参数检验具体为：

按照以下公式通过999次随机化检验得出检验统计量R值，若R≈0，则已知普通可可样品与已知香型可可样品的香气组成相同；若R>0，则已知普通可可样品与已知香型可可样品的香气组成有所不同；

$R=\frac{r_B-r_w}{n(n-1)/4}$

式中，n为已知香型可可样品与已知普通可可样品共采集的样本数，r_B为组间所有样本的平均秩相似性，r_W为组内样本的平均秩相似性，r_B与r_W的差异程度用R(-1≤R≤1)来衡量。

本发明选取不同香型可可与普通可可进行ANOSIM分析，结果表明不同香型可可与普通可可的香气组成均具有显著的差异(n＝8/9/11/12)。

本发明选取基本覆盖本领域常见的香型可可与普通可可育种材料作为已知品种进行聚类分析谱系图的绘制，然后以已知的厄瓜多尔香型可可arribaNacional品种、多米尼加香型可可HispaniolaTrinitario品种、厄瓜多尔普通可可CCN51品种和普通可可ZYP8种质作为待测样品进行检测(为保证鉴定方法的准确性，在鉴定上述待测可可样品时已知可可样品中并不包括待测品种)，结果显示，依照本发明鉴定方法可准确鉴定arribaNacioanl、HispaniolaTrinitario品种为香型可可，CCN51、ZYP8为普通可可。

由以上技术方案可知，本发明结合顶空固相微萃取、气相色谱—质谱联用(GC-MS)、平均欧氏距离、聚类分析中的组间平均距离法多项技术手段，从香型可可和普通可可在香气成分上的差别出发，通过更加科学、严谨的方式，提供了一套系统鉴定香型可可的方法，该方法分析时间短，准确率高，实用性强，解决了可可选育种中香型可可材料鉴定技术缺乏、鉴定难度大、耗时长的问题。

附图说明

图1所示为基于组间平均距离法的已知香型可可与已知普通可可香气成分的聚类分析谱系图；

图2所示为基于组间平均距离法的待鉴定样品普通可可CCN51品种聚类分析谱系图；

图3所示为基于组间平均距离法的待鉴定样品厄瓜多尔香型可可arribaNacional品种聚类分析谱系图；

图4所示为基于组间平均距离法的待鉴定样品多米尼加香型可可HispaniolaTrinitario品种聚类分析谱系图；

图5所示为基于组间平均距离法的待鉴定样品普通可可ZYP8种质聚类分析谱系图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种香型可可育种材料的鉴定方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施方式中，本发明选取比较具有代表性的香型可可与普通可可育种材料，共计11份。

其中香型可可(FC)5份：FC1为厄瓜多尔PORVENIR7品种，属arribaNacional品系，购于中国热带农业科学院香料饮料研究所；FC2为斯里兰卡Trinitario品种，购买于DRUERA公司；FC3为墨西哥arribaNacional品种，购买于LiveSuperfoods公司；FC4为多米尼加HispaniolaTrinitario，购买于ebay平台；FC5为秘鲁Nacional品种，购买于Nukraft公司；

普通可可(BC)6份：BC1为印度尼西亚品种，购于江苏无锡；BC2为尼日利亚品种，购于江苏无锡；BC3为ZYP8可可种质资源，购于中国热带农业科学院香料饮料研究所；BC4为ZYP15可可种质资源，购于中国热带农业科学院香料饮料研究所；BC5为ZYP3可可种质资源，购于中国热带农业科学院香料饮料研究所；BC6为ZYP16可可种质资源，购于中国热带农业科学院香料饮料研究所。

本发明所选可可品种基本覆盖本领域常见香型可可与普通可可育种材料。需要说明的是，本发明所选择的已知普通可可和已知香型可可的数量可以具体调整，既可以按照本发明鉴定方法所限定地至少选择4种已知香型可可和至少4种已知普通可可，也可以继续增加两者的数量，这属于本发明鉴定方法的保护范围内。具体实施方式所选择11份已知可可仅是为了更加清楚的描述本发明鉴定方法，并非限制本发明仅能选择此11份已知可可。如本发明实施例2，在本发明实施例1验证了厄瓜多尔普通可可CCN51后，即将厄瓜多尔普通可可CCN51增加至谱系图中，已知可可数量增加为12份(也可选择不增加)；同样，在实施例2验证厄瓜多尔香型可可arribaNacional品种后，所形成的矩阵和谱系图也可相应增加或不增加。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种香型可可育种材料的鉴定方法进行详细说明。

实施例1：普通可可CCN51验证本发明鉴定方法

考虑到可可豆因发酵、烘焙的程度对其香味的影响差异较大，且不能反映可可香味的前体物质，为避免这些因素对可可香气的影响，本发明要求可可样品未经发酵和烘焙处理。

准确称取未经发酵、烘焙，且含水量低于8％的500g～1000g可可豆，放入不锈钢研钵中粉碎，过40目筛，待用。

可可样品中香气组分检测：

A)、萃取头选择及老化：选择50/30μm、二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)固相微萃取(SPME)纤维头；使用前将SPME的萃取头在气相色谱(GC)的进样口老化，老化温度250℃，老化时间30min。

B)、顶空固相微萃取条件：准确称取2.00g已粉碎的可可样品，小心置于15ml萃取瓶底部(尽量避免沾到萃取瓶的内表面)，于60℃水浴中加热30min。用型号为DVB/CAR/PDMS的50/30μm手动SPME纤维头通过聚四氟乙烯瓶垫插入到顶空样品瓶中，置于可可样品正上方0.5cm左右。顶空萃取15min，然后将纤维头插入GC进样口，解析5min。吸附空顶空样品瓶中的气体作为空白对照。

C)、气相色谱(GC)分析条件：色谱柱的选择对检测可可香味组成成分特别重要。本发明选用DB-5MS(非极性色谱柱，长30m，内径0.25mm，液膜厚0.25μm)和DB-WAX毛细管柱色谱柱(强极性色谱柱，长20m，内径0.18mm，液膜厚0.18μm)作为分离香味组成的柱管进行预实验，结果表明，DB-WAX色谱柱比DB-5MS多分离出20余种香气物质，且一些呋喃类物质如糠醛、吡嗪类物质如2-乙酰基吡咯等在DB-5MS色谱柱条件下未被检测到。故本发明专利优选DB-WAX色谱柱。载气为高纯氦气，不分流进样，恒流流速1mL·min-1。柱箱采用程序升温，起始40℃，保持5min，以速度4℃/min升到180℃，保持2min，再以10℃/min升到260℃，保持3min。进样口温度250℃，接口温度280℃。

D)、质谱(MS)分析条件：电子轰击(EI)离子源，电子能量69.922eV，离子源温度230℃，MS四级杆150℃，电子倍增器电压1670.588V，质量扫描范围m/z35-500aum，全扫描快速扫描。

可可样品中香气物质的鉴定与数据矩阵的建立：

A)、利用GC/MS系统数据库NIST2008及其Kovats保留指数进行物质鉴定：利用GC/MS获得的香气物质出峰时间、强度及其分子量大小等信息，在GC/MS系统数据库NIST2008中鉴定出相匹配的香气物质。

同时，利用1μl正构烷烃混标(C₇–C₃₀)按香气成分测定时的程序升温进行分析，测定其相同升温程序下的Kovats保留指数，再查询文献中的保留指数数据进行物质鉴定。

$LRI=100\×n+\frac{100\×\left(t_x-t_n\right)}{t_{n+1}-t_n}$

其中，t_x，t_n，t_n+1分别为被分析成分和碳原子数处于n和n+1之间的正构烷烃(t_n＜t_x＜t_n+1)的流出峰的保留指数(min)。

以3-辛醇为内标化合物(浓度0.814g·ml^-1)进行半定量分析，计算各香气物质组分的含量，计算公式如下：

其中，f为个香气组分对内标物的矫正因子。

B)、可可香气物质数据矩阵的建立：将GC/MS系统获得的香气成分信息转化为“m×(K+n)”矩阵，m代表鉴定获得的香气物质数量总和，K代表各香气物质的Kovats保留指数，n代表共n个已知香型可可与已知普通可可样品的各香气物质的含量；

利用GC/MS分析技术共检测出54个香气物质，并利用Kovats保留指数进行定性分析，“m×(K+n)”矩阵见表1。

表1基于GC/MS技术的香型可可样品(FC)与普通可可样品(BC)香气成分组成鉴定及含量(μg·kg^-1FW)分析

香型可可与普通可可组间ANOSIM差异性检验：

在GC/MS分析技术基础上，基于R(Version3.1.2)的自编软件，对香型可可(FC)与普通可可(BC)香气成分进行ANOSIM非参数检验，确定是否香型可可与普通可可在香气组成分存在差异。

按照以下公式通过999次随机化检验得出检验统计量R值，若R≈0，则已知普通可可样品与已知香型可可样品的香气组成相同；若R>0，则已知普通可可样品与已知香型可可样品的香气组成有所不同；R<0的情况几乎不会发生；

$R=\frac{r_B-r_w}{n(n-1)/4}$

式中，n为已知香型可可样品与已知普通可可样品共采集的样本数，r_B为组间所有样本的平均秩相似性，r_W为组内样本的平均秩相似性，r_B与r_W的差异程度用R(-1≤R≤1)来衡量。

ANOSIM分析结果表明，香型可可与普通可可的香气组成具有显著的差异(R＝0.504,n＝11,p＝0.005)。

香型可可与普通可可聚类分析：

在ANOSIM差异性检验的基础上，计算香型可可样品与普通可可样品间的平均欧氏距离(SquaredEuclideanDistance)并利用组间平均距离法(Between-Groupslinkage)进行香型可可与普通可可聚类分析，结果见图1。

待测可可的检测：

利用GC/MS检测CCN51可可品种的香气成分及其含量，并将CCN51可可样品的GC/MS香气物质信心全部转化导出数据，汇编入上述所形成的“m×(K+11)”矩阵，形成“m×(K+12)”矩阵，见表2。然后，计算CCN51可可样品的香气组成与11个香型可可与普通可可样品之间的平均欧氏距离，并利用组间平均距离法(Between-Groupslinkage)进行聚类分析，判别CCN51属于普通可可还是香型可可。结果表明，CCN51属于普通可可类别，见图2。

表2基于GC/MS技术的CCN51可可品种香气成分组成鉴定及含量(μg·kg^-1FW)分析

实施例2：厄瓜多尔香型可可arribaNacional验证本发明鉴定方法

已知可可豆选择见表3，其余可可样品中香气组分检测、可可样品中香气物质的鉴定与数据矩阵的建立、香型可可与普通可可组间ANOSIM差异性检验、香型可可与普通可可聚类分析等步骤同实施例1；

ANOSIM分析结果表明，香型可可与普通可可的香气组成具有显著的差异(R＝0.3991,n＝12,p＝0.015)。

待测可可的检测：

利用GC/MS检测厄瓜多尔香型可可arribaNacional品种的香气组成及其含量，并将arriba可可样品的GC/MS香气物质信心全部转化导出数据，汇编入实例1中所形成的“m×(K+12)”矩阵，形成“m×(K+13)”矩阵，见表3。然后，计算arribaNacional可可样品的香气组成与12个香型可可与普通可可样品之间的平均欧氏距离，并利用组间平均距离法(Between-Groupslinkage)进行聚类分析，判别arribaNacional属于普通可可还是香型可可。结果表明，arribaNacional属于香型可可类别，见图3。

表3基于GC/MS技术的arribaNacional可可品种香气成分组成鉴定及含量(μg·kg^-1FW)分析

实施例3：多米尼加香型可可HispaniolaTrinitario品种验证本发明鉴定方法

已知可可豆选择见表4、可可样品中香气组分检测、可可样品中香气物质的鉴定与数据矩阵的建立、香型可可与普通可可组间ANOSIM差异性检验、香型可可与普通可可聚类分析同实施例1；

可可样品中香气物质的鉴定与数据矩阵的建立：

同实施例1，“m×(K+9)”矩阵见表4。

表4基于GC/MS技术的香型可可样品(FC)与普通可可样品(BC)香气成分组成鉴定及含量(μg·kg^-1FW)分析

ANOSIM分析结果表明，香型可可与普通可可的香气组成具有显著的差异(R＝0.4875,n＝9,p＝0.023)。

待测可可的检测：

利用GC/MS检测多米尼加香型可可HispaniolaTrinitario品种的香气组成及其含量，并将HispaniolaTrinitario可可样品的GC/MS香气物质信心全部转化导出数据，汇编入所形成的“m×(K+9)”矩阵，形成“m×(K+10)”矩阵，见表5。然后，计算HispaniolaTrinitario可可样品的香气组成与9个香型可可与普通可可样品之间的平均欧氏距离，并利用组间平均距离法(Between-Groupslinkage)进行聚类分析，判别HispaniolaTrinitario属于普通可可还是香型可可。结果表明，HispaniolaTrinitario属于香型可可类别，见图4。

表5基于GC/MS技术的HispaniolaTrinitario可可品种香气成分组成鉴定及含量(μg·kg^-1FW)分析

实施例4：普通可可ZYP8可可种质验证本发明鉴定方法

已知可可豆选择见表6、可可样品中香气组分检测、可可样品中香气物质的鉴定与数据矩阵的建立、香型可可与普通可可组间ANOSIM差异性检验、香型可可与普通可可聚类分析同实施例1；

可可样品中香气物质的鉴定与数据矩阵的建立：

同实施例1，“m×(K+9)”矩阵见表6。

表6基于GC/MS技术的香型可可样品(FC)与普通可可样品(BC)香气成分组成鉴定及含量(μg·kg^-1FW)分析

ANOSIM分析结果表明，香型可可与普通可可的香气组成具有显著的差异(R＝0.5208,n＝8,p＝0.026)。

待测可可的检测：

利用GC/MS检测ZYP8可可种质的香气组成及其含量，并将ZYP8可可样品的GC/MS香气物质信心全部转化导出数据，汇编入实例1中所形成的“m×(K+8)”矩阵，形成“m×(K+9)”矩阵，见表7。然后，计算ZYP8可可样品的香气组成与8个香型可可与普通可可样品之间的平均欧氏距离，并利用组间平均距离法(Between-Groupslinkage)进行聚类分析，判别ZYP8属于普通可可还是香型可可。结果表明，ZYP8属于普通可可类别，见图5。

表7基于GC/MS技术的ZYP8可可种质香气成分组成鉴定及含量(μg·kg^-1FW)分析

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种香型可可育种材料的鉴定方法，其特征在于，包括

步骤1、将未经发酵和烘焙的至少4种已知香型可可和至少4种已知普通可可，采用顶空固相微萃取方法分别富集其中的香气成分，利用GC/MS技术进行香气成分的检测分析；

步骤2、利用GC/MS获得香气成分出峰时间、含量、强度及其分子量大小信息，在GC/MS系统数据库NIST2008中鉴定出相匹配的香气物质，同时测定其相同升温程序下的Kovats保留指数辅助鉴定香气物质；

步骤3、将步骤1和步骤2中GC/MS系统获得的香气成分信息转化为“m×(K+n)”矩阵，m代表鉴定获得的香气物质数量总和，K代表各香气物质的Kovats保留指数，n代表共n个已知香型可可与已知普通可可样品的各香气物质的含量；

步骤4、待测的未知可可按照步骤2、步骤3的方法，将其GC/MS香气成分信息全部转化后，汇编入步骤3所形成的“m×(K+n)”矩阵，形成“m×(K+(n+x))”矩阵，x代表x个未知可可的的各香气物质的含量；然后，通过计算x个待测未知可可样品与共n个已知香型可可和已知普通可可样品之间的香气组成平均欧氏距离，并利用组间平均距离法进行聚类分析，获得未知可可和已知香型可可以及已知普通可可香气组成的聚类分析谱系图，从而判别x个待测可可样品是否属于香型可可。

2.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述未经发酵和烘焙的已知香型可可和已知普通可可的含水量均低于8％。

3.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述固相微萃取方法具体步骤为：

选择二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维头，使用前将固相微萃取纤维头在气相色谱的进样口老化；

准确称取已粉碎的可可样品，置于萃取瓶底部，水浴加热，用老化后的固相微萃取纤维头通过聚四氟乙烯瓶垫插入到萃取瓶中，置于可可样品正上方进行顶空萃取。

4.根据权利要求3所述鉴定方法，其特征在于，所述固相微萃取方法具体步骤为：

选择50/30μm、二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维头；使用前将固相微萃取纤维头在气相色谱的进样口老化，老化温度250℃，老化时间30min；

准确称取2.00g已粉碎的可可样品，置于15ml萃取瓶底部，于60℃水浴中加热30min，用老化后的固相微萃取纤维头通过聚四氟乙烯瓶垫插入到萃取瓶中，置于可可样品正上方0.5cm左右，顶空萃取15min。

5.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述利用GC/MS技术进行香气成分的检测分析具体为：

采用顶空固相微萃取方法富集的香气成分，即富集香气成分的固相微萃取纤维头，插入GC进样口，解析5min，同时以吸附空顶空样品瓶中的气体作为空白对照，然后以DB-WAX毛细管柱为色谱柱进行GC/MS检测分析。

6.根据权利要求5所述鉴定方法，其特征在于，所述GC的参数条件为：

载气为高纯氦气，不分流进样，恒流流速1mL·min^-1，柱箱采用程序升温，起始40℃，保持5min，以速度4℃/min升到180℃，保持2min，再以10℃/min升到260℃，保持3min，进样口温度250℃，接口温度280℃。

7.根据权利要求5所述鉴定方法，其特征在于，所述MS的参数条件为：

电子轰击离子源，电子能量69.922eV，离子源温度230℃，MS四级杆150℃，电子倍增器电压1670.588V，质量扫描范围m/z35-500aum，全扫描快速扫描。

8.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述Kovats保留指数的测定步骤为：

利用1μlC₇–C₃₀正构烷烃混标按香气成分GC/MS测定时的程序升温进行分析，测定其相同升温程序下的Kovats保留指数

$LRI=100\&times;n+\frac{100\&times;\left(t_x-t_n\right)}{t_{n+1}-t_n}$

其中，t_x，t_n，t_n+1分别为被分析成分和碳原子数处于n和n+1之间的正构烷烃的流出峰的保留指数，t_n＜t_x＜t_n+1。

9.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述利用GC/MS获得香气成分含量步骤为：

以3-辛醇为内标化合物(浓度0.814g·ml^-1)进行半定量分析，计算各香气物质组分的含量，计算公式如下：

其中，f为个香气组分对内标物的矫正因子。