CN105106188A - 绿原酸作为Sortase A抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绿原酸的新用途，将绿原酸作为Sortase？A抑制剂进行应用，包括绿原酸直接添加以及以绿原酸为主要成分的植物提取物为添加物用于治疗病原菌感染。本发明的优点是在绿原酸添加剂量远低于其MIC的浓度下即可有效抑制SortaseA的活性，从而抑制其与细胞外基质的粘附，来有效治疗金黄色葡萄球菌等病原菌的感染。这种以毒力因子为靶标的作用机制有别于传统的抗生素，不易产生耐药性，也与现有抗生素没有交叉耐药性，因此对现在临床耐药病原菌感染也能有效治疗。

Description

绿原酸作为Sortase A抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及绿原酸的用途，具体涉及一种绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用。

背景技术

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，异名咖啡单宁酸，化学名3-0-咖啡酰奎尼酸，分子式：C16H1809，分子量：354.30，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。它是许多中药材的有效成分之一，又是某些成药的指标性成分。SortaseA为一种介导革兰氏阳性菌表面蛋白在细菌粘附蛋白锚定的关键蛋白酶，存在于金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌中且序列保守。作为重要的毒力因子的细菌粘附蛋白在病原菌治病过程中起到关键作用。因此通过抑制SortaseA的活性可以有效治疗金黄色葡萄球菌等病原菌菌的感染。绿原酸应用非常广泛，主要为医药、日用化工和食品等行业，关于其在SortaseA抑制剂方面的应用未见报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种绿原酸的新用途，即绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用。

经检测：

绿原酸通过抑制SortaseA催化的转肽作用抑制表面粘附蛋白的锚定，其抑制SortaseA的IC₅₀为33.86±5.55μg/mL。

绿原酸可作为SortaseA抑制剂用于金黄色葡萄球菌感染治疗，绿原酸对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度超过1024μg/mL。

绿原酸可抑制金黄色葡萄球菌对纤维蛋白的黏附。

本发明具有以下有益效果：绿原酸通过抑制SortaseA从而有效治疗感染。同时其抑制SortaseA浓度远低于其MIC，因此不会产生耐药性。又因其作用机制不同于现有抗生素，因此对于临床耐药菌感染的治疗同样有效。

绿原酸作为SortaseA抑制剂的可应用于金黄色葡萄球菌等病原菌感染治疗。包括绿原酸直接添加以及以绿原酸为主要成分的植物提取物为添加物用于治疗金黄色葡萄球菌等病原菌感染。

附图说明

图1(A)为绿原酸的结构(Chlorogenicacid(CHA))。

图1(B)为不同浓度绿原酸对金黄色葡萄球菌NewmanD2CSrtA的体外抑制活性。

图1(C)为金黄色葡萄球菌NewmanD2C(WT)、绿原酸(256μg/ml)作用的金黄色葡萄球菌NewmanD2C和ΔSrtA的生长曲线。

图2为纤维蛋白(Fg)结合实验.ΔSrtA作为理想的sortaseA抑制剂阳性对照。(A)肉眼观察的结果(B)细菌黏附Fg的黏附率.绿原酸以剂量依赖的方式降低金黄色葡萄球菌对Fg的黏附率。每个实验至少重复三次，结果以mean±SEM表示.**P<0.01vs.theWTgroup.

图3为SortaseA(SrtA)蛋白和proteinA(Spa)蛋白的免疫印迹实验.提取金黄色葡萄球菌NewmanD2C(WT)(lanes1)，不同浓度绿原酸作用下的WT(lanes3-8)和ΔSrtA(lane2)的细胞膜蛋白(SrtA)和细胞壁蛋白(Spa)。然后用SrtA和Spa的特异性抗体检测。

图4(A)为SrtA-CHA复合物的所有原子的均方根偏差(RMSD)，以其初始结构作为时间的函数。图4(B)根据分子动力学模拟推测CHA在SrtA结合口袋里的结合模式。图4(C)SrtA-CHA复合物和自由SrtA全蛋白残基的最后10-ns仿真时间的RMSF图4(D)结合能的分解基于SrtA-CHA复合物(a)、C184A-CHA复合物(b)和G192A-CHA复合物(c)的每个残基。

图5为CHA对BALB/c小鼠存活率的影响。静脉注射2×10⁹CFU金黄色葡萄球菌(WT)和ΔSrtA后BALB/c小鼠(N＝10)的生存率。另一组注射野生型菌的BALB/c小鼠(N＝10)腹腔注射绿原酸(50mg/kg，每天三次)进行治疗.生存率差异的显著性通过Log-rank(Mantel-Cox)Test进行统计.结果如下：WTvs.ΔSrtA，P<0.0001；WTvs.WT+CHA，P<0.05。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

在本实施例中使用的菌株和质粒列于表1。所使用的荧光肽DABCYL-QALPETGEE-EDANS由吉尔生化合成。复合绿原酸(CHA)购买自国家食品药品检验所。

表1菌和质粒列表

将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，37℃振荡培养，加氨苄青霉素(为100μg/mL)。将金黄色葡萄球菌菌株接种于脑心浸液(BHI)肉汤(Sigma公司)中，37℃剧烈振荡培养，加红霉素(EM，2.5μg/mL)和氯霉素(15μg/mL)。以GST亲和层析将金黄色葡萄球菌的重组SrtA从大肠杆菌菌株BL21(DE3)中纯化。从金黄色葡萄球菌Newman基因组DNA选取指定PsrtA59F和PsrtA59R引物用于扩增SrtAΔN59序列(仅表达60-206)，并克隆到pGEX-6P-1载体内，生成产物pGSrtAΔN59。将pGSrtAΔN59作为模板对C184A和G192A的定点突变照试剂盒上所述进行。用于构建SrtAΔN59变体的互补性正向和反向引物对列于表2。所有的表达载体通过DNA测序证实。

表2本研究中使用的寡核苷酸引物

a限制性内切核酸酶识别位点或密码子突变位点用下划线表示。

pGSrtAΔN59和突变构建体转化到大肠杆菌菌株BL21。将转化的细胞在加入氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养，直到OD₆₀₀达到0.6～0.8。加入终浓度1mM/L的IPTG，16℃下诱导过夜。收集菌体，重悬于反应缓冲液(Tris-HCl50mM，CaCl₂5mM，NaCl150mM，pH7.5)。超声处理后，将溶菌产物进行离心并将上清液加到填装好的GST亲和柱(2mLglutathioneSepharose4B)(GEAmersham)上。洗去未结合杂蛋白后，加入PP酶，4℃酶切过夜，GST标签被洗掉，然后用反应缓冲液洗脱。重组蛋白通过SDS-PAGE电泳鉴定，它们的浓度使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)测定。

CHA对SrtAΔN59的活性使用荧光共振能量转移(FRET)测定来确定。在该测定中，IC₅₀的值是通过监测CHA对酶稳态裂解底物肽DABCYL-QALPETGEE-EDANS的影响效果来确定的。FRET的实验方法参考之前文章中的描述。简言之，将反应缓冲液，重组SrtA4mM，以及梯度浓度的CHA共300ul加入到96孔板，并在37℃下孵育30分钟。然后加入修饰的底物肽，并在37℃下孵育1小时。在350nm激发，495nm吸收，测定样品荧光。每个实验至少重复3次，以确保重现性。

本实施例根据NCCLS准则M₃₁-A₂，通过肉汤微量稀释法来测定CHA的最小抑制浓度(MIC)。CHA溶解于二甲亚砜(DMSO)和使用前用无菌蒸馏水进行稀释(终浓度为0.5％的DMSO，对酶活性无影响)。对生长曲线绘图，将1mL的金黄色葡萄球菌过夜的细菌培养物加入到50mL的新鲜BHI肉汤，并在37℃下分别用具有或不具有CHA孵育不同的时间。吸光度读数采取OD₆₀₀。

金黄色葡萄球菌野生株在BHI培养基中培养，37℃振荡培养生长至对数生长期，稀释至初始OD(600nm)＝0.05，加入不同浓度的CHA。NewmanΔSrtA菌株作为阳性对照，在相同条件下生长。所有样品均在37℃摇床培养2h。细胞通过离心分离沉淀(5000rpm，5min)，用PBS清洗两次，再重悬至OD₆₀₀＝1。

将20μg/mL的牛纤维蛋白原100μL(Fg)加入聚苯乙烯96孔板置于4℃环境包被过夜。将板进行清洗并用BSA封闭37℃孵育2h。用PBS清洗后，依次加入100μL细胞悬液，37℃孵育2h。倒去板中液体。清洗后加入25％(v/v)甲醛固定30min。用100μL结晶紫染料(12.5g/L)染色10min，再次清洗并干燥，将吸收板用酶标仪在570nm处测定。结果为与野生型对照相比的细菌黏附率。每个实验至少重复三次，以确保重现性。

如前所述方法提取溶解的细胞壁蛋白和胞质膜。蛋白质用12％SDS-PAGE凝胶萃取分离，并转移到PVP膜。金黄色葡萄球菌表面蛋白A的抗体和分选酶A抗体购自Abcam公司；HRP标签的goatanti-chickenIgY购自SantaCruz和HRP标签的goatanti-rabbitIgG购自Proteintech。

本实施例中使用的六到八周大的雌性BALB/C小鼠购自吉林大学医学部实验动物中心。

金黄色葡萄球菌的过夜培养物以1∶100接种到新鲜BHI培养基中，37℃培养3小时。葡萄球菌用PBS洗涤两次，并悬浮于BHI培养基。菌液浓度为2×109CFU，通过尾静脉注射进行生存率研究。肾脏感染模型中，BALB/c小鼠(每组N＝8)尾静脉注射200μL的金黄色葡萄球菌悬浮液(2×108CFU)。感染6天后，将小鼠处死，肾脏切除，左肾脏匀浆，稀释于生理盐水并铺板以测定CFUs。将每组小鼠的右肾脏固定在10％福尔马林中，在常温下放置24小时。将组织包埋在石蜡中，薄切片，用苏木精和曙红(H&E)染色，并通过显微镜检查。所有动物研究均至少进行两次，在所有的重复实验中都观察到类似的结果。

统计分析，使用Log-rank(Mantel-Cox)对生存研究的统计学意义进行了评估；细菌学载菌量和纤维蛋白原结合百分比的显著性检验使用不成对双尾学生t检验。当P<0.05有显著统计学差异。

如图1B所示，在IC₅₀33.86±5.55μg/mL的CHA表现出强大的分选酶抑制活性。CHA对金黄色葡萄球菌株的最低抑菌浓度要超过1024μg/mL。如图1C所示，在CHA计量达到8倍的IC₅₀，野生型金黄色葡萄球菌+CHA和ΔSrtA的生长速率与野生型基本相同。

上述的结果表明，CHA(图1A)对SrtA有重要的抑制作用。金黄色葡萄球菌能表达多至21种不同的膜蛋白，例如凝集因子、纤连蛋白A和纤连蛋白B，他们主要是通过SrtA转肽酶被锚定在细胞壁上。纤维蛋白原与纤连蛋白的结合对金黄色葡萄球菌的发病机理十分重要。而金黄色葡萄球菌的突变体由于缺乏SrtA，将不能表达膜蛋白，因而缺乏感染能力。能够推测CHA能干扰Fg/Fn结合，减弱金黄色葡萄球菌的毒力。因此，我们使用纤维蛋白原结合实验验证这一假设，通过对黏附在纤维蛋白原包被的平板上的细胞进行结晶紫染色测定吸光度来定量。首先，检测金黄色葡萄球菌株D2C(WT)和基因敲除突变体ΔSrtA对纤维蛋白原包被面的黏附。如图2A，B，该ΔSrtA以最小的结合率3.7±2.1％结合到纤维蛋白原上。在32，64，128，256μg/ml浓度下的CHA对野生株纤维蛋白原的粘附率分别为89.8±5.2％，45.0±4.3％，27.7±5.1％和16.7±3.2％(图2B)。可以看到，不同浓度CHA降低了细菌与纤维蛋白原黏附程度。与野生菌株相比在64，128，256μg/ml浓度下可以显著降低细菌与纤维蛋白原黏附程度。

为了验证CHA是否通过减少锚定在细胞壁上蛋白的量来干扰表面蛋白的功能，我们提取细胞壁相关蛋白。在这项研究中，我们也通过免疫印迹分析证明CHA不影响SrtA的表达。当用免疫印迹法分析细胞壁中提取相关的A蛋白时，我们发现培养具有CHA的金黄色葡萄球菌后A蛋白显着下降(图3)。这些结果表明，CHA可以被认为是一个有潜力的抑制剂，可以直接影响细菌体内SrtA。

本具体实施在探索CHA与SrtA潜在的结合模式，分子对接，分子动力学模拟时用AutoDock4.0和Gromacs4.5.1的软件包进行。从X射线结构(PDB代码：1T2P)，得到SrtA的初始结构。CHA与SrtA之间的结合模式是由基于所述对接结果20-ns的分子动力学模拟来确定。探索模型的动态稳定性，确保了采样策略的合理性，蛋白质骨架的根均方差(RMSD)值的基础上沿模拟时间在这里进行计算并绘制在图的起始结构。正如我们在图4A看到，所有系统的蛋白质结构在模拟中被稳定化。

在模拟中，CHA表示可以通过氢键和疏水性相互作用结合SrtA的配体。在模拟的过程中，CHA定位于“活性”的区域，该区域被报道为参与反应并且对SrtA是重要的。预测CHA与SrtA的结合模式示于图4A，周围的结合位点中残基的静电势是使用APBS软件(Bakeretal.，2001)进行映射产生的。详细讲，CHA与SrtA(图4B)活性区域的结合模型揭示，CHA的环己烷羟基既能形成与Arg197侧链氨基的氢键，又是Gly192的骨干。此外，CHA侧链的Cys184和Ile182可以形成范德华力，如图4B所示，这将由能量分解分析来证实。

对SrtA-CHA络合物和游离SrtA整个蛋白质的残基的均方根涨落(RMSF)进行了计算，以揭示这些残基的适应性。这些残基的RMSF示于图4C中，清楚地描绘不同的灵活性在SrtA与CHA存在和不存在的结合位点。所有与CHA结合在SrtA结合位点的残基与游离SrtA相比显示出小的灵活性RMSF小于 表明这些残基结合CHA更加牢固。

上述资料表明，SrtA在这个复杂的结合腔的稳定性主要是取决于残基Ile182，Cys184，Gly192和Arg197，如图4B所示。

识别SrtA-CHA复合结合位点。为了获得更多关于结合位点周围残基的信息和它们对整个系统，静电力，范德华力，溶剂化的贡献，残基对结合自由能总贡献需要用(MM-GBSA)方法计算。通过10ns的模拟进行了100MD快照的计算。每个残基相互作用自由能的总共分成范德华力(ΔEvdw)，静电力(ΔEele)，溶剂化(ΔEsol)，和总贡献(ΔEtotal)。所选残基的能量贡献示与图4D-a。在SrtA-CHA复合物中，Arg197和Gly192具有明显的静电力(ΔEele)贡献，具有≤-3.0kcal/mol的ΔEele(图4D-a)。事实上，Arg197和Gly192接近CHA的环己烷组，并且存在两个静电相互作用，导致SrtA和CHA之间存在两个强力氢键。另外，残基Ile182和Cys184，具有≤-2.0kcal/mol的ΔEvdw，由于残基和CHA之间的紧密接近使之与配基产生强力的范德华相互作用。除残基Gly192和Arg197，大部分分解能量的相互作用源自范德华相互作用，显然通过在SrtA-CHA复合物中形成疏水相互作用。此外，SrtA-CHA复合物总结合自由能和其详细的能量贡献根据MM-GBSA方法算出，示于表3。具有溶质熵项的总和(～6.7kcal/mol)，CHA中ΔGbind预估为-15.2kcal/mol，显示出CHA可以与SrtA的结合位点结合并产生强烈的相互作用。

为了检验在SrtA-CHA复合结合位点的准确度，C184A-CHA和G192A-CHA突变体复合物用作MD模拟初步结构，MD轨迹依次用MMGBSA法进行分析。C184A和G192A突变体表达和纯化，CHA和两个突变体之间的结合常数和结合位点的数目是由荧光光谱猝灭法(LakowiczandWeber，1973)研究的。

如图4D-b和c所示，CHA可与两个突变菌株结合，同样可与WT-SrtA结合，经证实是由所分解的自由能相互作用的结果。能提供自由能的主要是Ile182，Cys184，Gly192和Arg197。然而，通过MM-GBSA计算预测可知，C184AandG192A与CHA结合较弱，与WT-SrtA(-7.9kcal/molforC184Aand-8.4kcal/molforG192A)相比，见表3。对C184A和G192A计算结果表明这些突变菌株可降低将近7kcal/mol的自由能，与WT-SrtA相比。根据这些实验结果，CHA与SrtA之间的结合常数，KA，降低情况如下：WT>G192A>C184A，这意味着WT-SrtA与CHA有很强的结合能力，C184A结合能力较弱。如表3所示。对自由能的计算结果与我们的实验数据一致。我们相信MD分子动力学模型中产生了一个稳定的SrtA-CHA复合物。

表3采用荧光猝灭法考察WT-CHA，C184A-CHA和G192A-CHA系统，计算能源组件，结合自由能(kcal/mol)，结合常数和结合位点的数量。

Ile182，Cys184，Gly192和Arg197的残基在SrtA与亚基的结合中有着举足轻重的作用(Ton-Thatetal.，1999，2000)。由于CHA与活性区域结合(Ile182，Cys184，Gly192和Arg197的残基)，SrtA的生物学活性被抑制。

将2×10⁹CFU和2×10⁸CFU分别注入小鼠体内以观察存活率和脓肿形成。注入2×10⁹CFU金黄色葡萄球菌9天后，WT菌株与ΔSrtA菌株相比产生很大的致死性，7天内杀死90％的小鼠，而ΔSrtA菌的致死性为0％(图5)。WT菌感染的小鼠皮下注射CHA，150mg/kg/d。存活率结果表明，WT+CHA组表现出明显的生存优势，尤其是在感染早期(图5)。WT+CHA组小鼠在感染5天后(我们停止给药的那天)开始死亡。这些结果表明CHA可延长存活率且在早期感染中可保护以免死亡。

随着进入血液，金黄色葡萄球菌可逃避免疫细胞的吞噬作用，然后与特异性组织结合，造成器官脓肿。如ClfA和FnbpA这些表面蛋白，它们的功能是由SrtA所表现，在这个过程中有着重要的作用)。为检测在金黄色葡萄球菌疾病中作为一个潜在的SrtA抑制剂的CHA的功能。我们研究了在小鼠感染模型中肾脓肿的形成情况。这个模型中金黄色葡萄球菌的浓度为2×10⁸CFU。注射金黄色葡萄球菌后，皮下注射CHA(150mg/kg/d)。24h后对感染动物的肾脏进行组织病理学分析表明，其器官表面没有出现脓肿。肾脏表面的脓肿数量72h为25％，6天后上升至75％。感染6天后，小鼠安乐死，摘除肾脏以检测组织中金黄色葡萄球菌的载菌量。我们发现肾组织中，金黄色葡萄球菌D2C中载菌量为6×10⁶CFU/g，金黄色葡萄球菌ΔSrtA(p<0.01vs.WT组)为40CFU/g，CHA处理组为10⁴CFU/g(p<0.01vs.theWTgroup)。在10×镜下观察脓肿表面，右肾用10％的福尔马林浸泡。组织经石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色(H&E)最后显微镜下观察。在WT组小鼠的肾表面有较大的脓肿(>50％ofSurface)，包括一个葡萄球菌中央区域，被一层嗜酸性不定性物质和多型核白细胞(PMNs)所环绕。ΔSrtA组无论是宏观上还是组织病理学检测，都未能发现脓肿。经CHA处理后，脓肿的大小显著性减小，且只能看到有少量的PMNs和金黄色葡萄球菌感染器官。这些结果表明，SrtA在金黄色葡萄球菌介导的脓肿形成中是一个重要的毒力因子。此外，CHA可保护小鼠以抵抗金黄色葡萄球菌诱导的脓肿形成，减轻感染情况。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用。

2.如权利要求1所述的绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用，其特征在于，绿原酸抑制SortaseA的IC₅₀为33.86±5.55μg/mL。

3.如权利要求1所述的绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用，其特征在于，绿原酸作为SortaseA抑制剂在金黄色葡萄球菌感染的治疗中的应用。

4.如权利要求3所述的绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用，其特征在于，绿原酸可抑制金黄色葡萄球菌对纤维蛋白的黏附。

5.如权利要求3所述的绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用，其特征在于，绿原酸对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度超过1024μg/mL。

6.如权利要求1所述的绿原酸作为SortaseA抑制剂的应用，其特征在于，绿原酸通过抑制SortaseA催化的转肽作用抑制金黄色葡萄球菌粘附蛋白的细菌表面锚定。