CN105092628A - 一种鉴别奶品品质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴别奶品品质的方法，分别对标准奶样品、掺假奶样品和待测奶样品利用核磁共振技术对样品中的代谢物进行定性和定量分析；根据标准奶样品的表征因子含量数据，对标准奶样品进行主成分分析，利用Fisher判别法建立标准奶样品的判别模型；对掺假奶样品中的表征因子进行定量，利用偏最小二乘法建立多元回归定量模型，并测定其定量限和回收率；将待测奶样品各表征因子的含量数据带入判别模型中判别样品的种类，将各表征因子含量数据带入定量模型中可判别待测奶样品是否掺假，且可定量出掺假比例。本发明提供的方法回收率好、自动化程度高、操作简单易行，能够快速检测出奶品中掺入廉价奶的含量。

Description

一种鉴别奶品品质的方法

技术领域

本发明涉及食品检验，具体地说，涉及一种利用核磁共振鉴别奶品品质的方法。

背景技术

近年来，市场上牛奶、羊奶中掺假廉价奶(如豆奶)的问题备受关注。另外，在国际市场上羊奶比牛奶价格普遍贵2-5倍，这是由于羊奶的资源相对牛奶较少，而且奶羊与奶牛对生存环境的要求不同，例如奶牛适宜圈养，以喂食人工饲料为主；而奶羊适宜散养，以吃青草和干草为主，因此奶羊对植被有一定的破坏性，一些发达国家已禁止增加奶羊的数量。此外，羊奶具有极高的医药价值、保健价值及美颜养肤价值，所生产的产品附加值也较高，更加减少了市场上食用羊奶的数量，导致市场上羊奶货源少、价格高。羊奶中掺假廉价豆奶或牛奶的问题尤为突出。为了保障消费者的权益和健康，消除消费恐慌，建立牛奶中掺假豆奶，羊奶中掺假豆奶或牛奶的定量检测方法，意义重大。

核磁共振技术在食品成分安全检测中发挥着重大作用，与传统鉴别牛奶中掺假廉价奶的方法相比，该技术前处理方法简单、方便，可通过一维与二维相结合的核磁共振技术实现对牛奶中各代谢物的全面分析，并准确定量。结合统计分析法，找出不同种类奶中各表征因子，并建立可行性强，准确度高的廉价奶掺假定量模型，可为日后奶品的真实性鉴别提供了强有力的技术支撑。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种鉴别奶品品质的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种鉴别奶品品质的方法，所述方法包括如下步骤：

1)对标准奶样品进行预处理；

2)利用一维核磁共振技术(¹HNMR，¹³CNMR)和二维核磁共振技术(¹H-¹³CHSQC，¹H-¹³CHMBC)，对标准奶样品中的代谢物进行定性和定量分析；

3)根据表征因子含量数据，对标准奶样品进行主成分分析，利用Fisher判别法建立标准奶样品的判别模型；

所述表征因子包含：柠檬酸、肌酸、卵磷脂、D型乳糖和D型蔗糖；

4)配制不同比例的掺假奶样品，按照步骤1)预处理方法进行预处理，之后利用¹HNMR技术对各掺假奶样品中上述表征因子进行定量，利用偏最小二乘法建立多元回归定量模型，并测定其定量限和回收率；

5)对待测奶样品进行检测，按照步骤1)预处理方法进行预处理，之后利用¹HNMR技术对样品中上述表征因子进行定量，将各表征因子的含量数据带入步骤3)所得模型中可判别样品的种类，再将各表征因子含量数据带入步骤4)所得模型中可判别是否掺假廉价奶，且可定量出掺假廉价奶的比例。

进一步地，所述标准奶为纯牛奶、纯羊奶和豆奶。

进一步地，步骤1)中预处理的具体方法为：

取5～10份奶样，加入10～20份无水乙醇蜗旋混匀；离心取上层溶液用氮气吹干；加入2～4份重水进行水浴超声，涡旋混匀重新溶解样品，离心取上层溶液，供下一步检测。

其中，所述重水含1～5mM的内标物TSP(2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸)。

其中，离心条件为10000～15000rpm离心10～30min。

其中，水浴超声的条件为20～30℃水浴超声10～30min。

进一步地，步骤2)包括：

I.不同种类奶中各表征因子的定性分析：

利用一维核磁共振(¹HNMR,¹³CNMR)和二维核磁共振(¹H-¹³CHSQC,¹H-¹³CHMBC)技术对样品进行分析测定，并推断各代谢物的峰归属信息。

核磁共振仪器型号需为400MHz或400MHz以上，检测温度为298K；利用一维(¹HNMR,¹³CNMR)和二维(¹H-¹³CHSQC,¹H-¹³CHMBC)核磁共振技术对样品进行检测分析，技术参数设置如下：

¹HNMR参数如下：数据点数，64K；谱宽，8223.7Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，8-32；采集时间，4s；¹³CNMR参数设置如下：数据点数，64K；谱宽，24038.5Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，1024-2048；采集时间，1.36s；

¹H-¹³CHSQC参数设置如下：数据点数，F2为2048，F1为256；谱宽，F2为8223.7Hz，F1为24038.5Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，16-64；空扫次数，16-32；采集时间，0.13s；

¹H-¹³CHMBC参数设置如下：数据点数，F2为2048，F1为256；谱宽，F2为8223.7Hz，F1为24038.5Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，32-128；空扫次数，16-32；采集时间，0.13s；

II.不同种类奶中各表征因子的定量分析：

核磁共振图谱经相位调整和基线校正后，以1～5mMTSP为内标物，利用以下定量公式，对不同种类奶中的表征因子进行定量分析(图1)。

n代表奶样的浓度倍数；Met代表奶中的代谢物；Ref代表内标物(例如：TSP)。

进一步地，步骤3)包括：

Ⅰ.主成分分析：

利用one-wayANOVA法分析不同种类奶中代谢物含量差异的显著性(表1)，找出不同种类奶的表征因子。根据各表征因子的含量原始数据，对不同种类牛奶进行主成分分析，结果表明提取两个主成分后，纯牛奶、纯羊奶、豆奶可以完全区分开，前两个主成分的方差累积贡献率达98％。

表1.One-wayANOVA分析结果

^a***代表P<0.001；^bP值是由SPSS21.0版软件计算所得；^cCM代表牛奶；EM代表羊奶；SM代表豆奶。

Ⅱ.Fisher判别模型建立：

基于各表征因子的含量原始数据，利用Fisher判别法建立纯牛奶、纯羊奶、豆奶的判别模型，所得模型如下：

y₁＝26.179x₁+200.635x₂+245.065x₃+1.786x₄+0.839x₅-413.914(1)

y₂＝18.802x₁+209.010x₂+195.290x₃+1.602x₄+0.726x₅-334.685(2)

y₃＝16.312x₁+45.188x₂+186.795x₃+0.064x₄+3.335x₅-342.107(3)

y₁代表牛奶；y₂代表羊奶；y₃豆奶。

x₁为柠檬酸含量；x₂为肌酸含量；x₃为卵磷脂含量；x₄为D型乳糖含量；x₅为D型蔗糖含量，含量单位为mmol/L。

使用方法：利用核磁共振技术检测待测奶样品中上述五种表征因子的含量，将含量数值分别代入上述三个模型，计算y₁，y₂，y₃值，三者中的最大值代表待测奶样品的种类(例如y₁，y₂，y₃中y₂值最大，则代表该待测奶样品中主要成分为羊奶)。

进一步地，步骤4)包括：

Ⅰ.掺假奶样品配制及预处理：

纯牛奶中掺假不同比例的豆奶，牛奶:豆奶(v/v)为1:1至19:1；

纯羊奶中掺假不同比例的豆奶，羊奶:豆奶(v/v)为1:1至19:1；

纯羊奶中掺假不同比例的牛奶，羊奶:牛奶(v/v)为1:1至9:1；

分别取上述掺假奶样5～10ml，加入10～20ml无水乙醇蜗旋混匀；10000～15000rpm离心10～30min后，分离上层溶液用氮气吹干；加入2～4ml重水(含1～5mMTSP)20～30℃水浴超声10～30min，涡旋混匀重新溶解样品，然后10000～15000rpm离心10～30min后，取400～600μL上层溶液于5mm核磁样品管中，供下一步检测使用。

Ⅱ.掺假奶样品种表征因子的定量分析与掺假定量模型建立：

利用核磁共振技术(¹HNMR)对掺假奶样品中的柠檬酸、肌酸、卵磷脂、乳糖、蔗糖进行内标法定量。基于样品中各表征因子的含量原始数据，利用偏最小二乘法建立多元线性回归模型，即奶品掺假廉价奶定量模型。模型如下所示：

Y₁＝0.071X₁-0.360X₃+0.004X₅+0.055(线性范围：50％-5％)(4)

Y₂＝0.026X₁-0.434X₂+0.004X₅+0.513(线性范围：50％-5％)(5)

Y₃＝-2.143X₂+0.568X₃+0.009X₄+1.690(线性范围：80％-10％)(6)

Y₁为牛奶中掺假豆奶的比例(v/v,％)；

Y₂为羊奶中掺假豆奶的比例(v/v,％)；

Y₃为羊奶中掺假牛奶的比例(v/v,％)；

X₁为柠檬酸含量；X₂为肌酸含量；X₃为卵磷脂含量；X₄为D型乳糖含量；X₅为D型蔗糖含量，含量单位为mmol/L。

使用方法：利用核磁共振技术检测待测奶样品中上述五种表征因子的含量，将含量数值分别代入模型(1)、(2)、(3)中，比较y_1、y_2、y₃值，其中最大值所代表的种类为待测奶样品所属类别。再将五种表征因子的含量数值根据所判的待测奶样品的类别，带入模型(4)、(5)、(6)中某一对应奶样类别的模型中，计算所得Y值为掺假某种廉价奶的比例。例如：若经模型(1)、(2)、(3)判定后，y₂值最大，则该待测奶样中羊奶占主要成分，再将表征因子含量数据带入羊奶对应的掺假判别模型(5)和(6)中，即可判断该羊奶中是否掺假豆奶或牛奶，Y₂值代表掺假豆奶的比例，Y₃值则代表掺假牛奶的比例。若Y₂、Y₃值为0，则表示该羊奶中没有掺假豆奶或牛奶。

与传统技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明采用的样品前处理方法简单、方便，极大提高了检测效率；采用一维和二维核磁共振技术进行检测，实现了样品中各表征因子结构及含量的全面分析，极大提高了样品检测的准确率；采用Fisher判别法建立的判别模型，可实现市场上纯牛奶、纯羊奶、豆奶的种类判别；利用偏最小二乘法建立的多元线性回归模型，可实现廉价奶的定量检测，准确度高，且本发明的掺假检测方法回收率好、自动化程度高、操作简单易行，能够快速检测出奶品中掺入廉价奶的含量。

附图说明

图1为各表征因子在牛奶、羊奶、豆奶中的含量柱形图。

图2为样品真空冷冻干燥后重溶于重水(a)，以及样品经乙醇提取后上清液氮吹蒸干后重溶于重水(b)两种前处理方法得到的¹HNMR谱图。

图3为豆奶(a)，牛奶(b)和羊奶(c)的一维核磁共振氢谱对比图，数字1-10代表不同代谢物的峰，具体代谢物名称在图中已注明。

图4为牛奶(a)和豆奶(b)的二维核磁共振¹H-¹³CHSQC对比图，以及羊奶(c)二维核磁共振¹H-¹³CHMBC对比图，不同信号点所代表的代谢物名称已在图中标注。

图5牛奶、羊奶、豆奶的主成分分析三维图(a)和二维图(b)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1样品的预处理

8个品牌的牛奶，8个品牌的羊奶，8个品牌的豆奶分别购自北京的各大超市，分别取上述各奶样5ml，加入10ml无水乙醇蜗旋混匀；13000rpm离心15min后，分离上层溶液用氮气吹干；加入2ml重水(含3mMTSP),20℃水浴超声10min，涡旋混匀重新溶解样品，然后13000rpm离心10min后，取500μL上层溶液于5mm核磁样品管中，供下一步检测使用，每个样品重复实验3次。

本发明还使用了另一种样品预处理方法：将样品真空冷冻干燥后重溶于重水，相对于本发明技术方案将样品经乙醇提取后上清液氮吹蒸干后重溶于重水进行对比。对比后发现：前者处理后得到的谱图峰形宽，且重叠较多，定量不准确，如图2(a)所示；后者处理后得到的谱图可以去掉一些无关物质的干扰，减少峰的重叠，使重要表征因子的峰显现出来，并且可以准确定量，如图2(b)所示。由此可知，本发明所述的预处理方法，准确度更高。

实施例2不同种类奶中各表征因子的定性和定量分析：

Ⅰ.利用核磁共振技术进行检测：

实验所用的核磁共振仪器型号为BrukerAdvanceⅢ400MHz，检测温度为298K。利用一维(¹HNMR,¹³CNMR)和二维(¹H-¹³CHSQC,¹H-¹³CHMBC)核磁共振技术对样品进行检测分析，检测所得图谱见图3和4；技术参数设置如下：

¹HNMR参数如下：数据点数，64K；谱宽，8223.7Hz；弛豫时间，2s；扫描次数，8；采集时间，4s。¹³CNMR参数设置如下：数据点数，64K；谱宽，24038.5Hz；弛豫时间，2s；扫描次数，1024；采集时间，1.36s。

¹H-¹³CHSQC参数设置如下：数据点数，F2为2048，F1为256；谱宽，F2为8223.7Hz，F1为24038.5Hz；弛豫时间，2s；扫描次数，8；空扫次数，16；采集时间，0.13s。

¹H-¹³CHMBC参数设置如下：数据点数，F2为2048，F1为256；谱宽，F2为8223.7Hz，F1为24038.5Hz；弛豫时间，2s；扫描次数，32；空扫次数，16；采集时间，0.13s。

II.不同种类奶中各表征因子的定量分析：

利用核磁共振图谱分析软件Topspin2.1版对图谱进行相位调整和基线校正。以3mMTSP为内标物，利用以下定量公式，对不同种类奶中的表征因子进行定量分析。

n代表奶样的浓度倍数(n＝2.5)；Met代表奶中的代谢物；Ref代表内标物(例如：TSP)；摩尔浓度(Ref)＝3mM；氢的个数(Ref)＝9。

实施例3主成分分析与判别模型的建立

基于不同种类奶中各特征因子的含量数据，进行one-wayANOVA和主成分分析处理，主成分分析图见图5。从图中可得前三种主成分得方差累积贡献率达99.61％，提取前两种主成分即可将牛奶、羊奶、豆奶区分开。其中根据主成分1(PC1)可知，豆奶分布在-3.3到-2.3之间，另外两种奶分布在1.1到2.0之间。根据主成分2(PC2)可知，在PC2＝0.1处，牛奶和羊奶可以完全分开，羊奶位于-1.2<PC2<0.1，牛奶位于0.4<PC2<1.2。由此表明，五种表征因子(柠檬酸、肌酸、卵磷脂、D型乳糖、D型蔗糖)可用于三种奶的分类判别。之后基于五种表征因子在不同种类奶中的含量数据，利用Fisher判别法建立牛奶、羊奶、豆奶的分类判别模型，对市场上的24种品牌的奶样品进行验证，准确率达100％。

实施例4掺假奶样品定量限、回收率的测定

准备分别掺入5％-50％(v/v)不同比例梯度的豆奶的牛奶样品，分别掺入5％-50％(v/v)的豆奶的羊奶样品和分别掺入10％-80％(v/v)的牛奶的羊奶样品。分别取上述不同比例梯度的各掺假奶样品5ml，加入10ml无水乙醇蜗旋混匀；13000rpm离心15min后，分离上层溶液用氮气吹干；加入2ml重水(含3mMTSP),20℃水浴超声10min，涡旋混匀重新溶解样品，然后13000rpm离心10min后，取500μL上层溶液于5mm核磁样品管中，供下一步检测使用，每个样品重复实验3次。利用核磁共振一维氢谱技术定量出各表征因子的含量，基于表征因子的含量数据，建立多元线性回归模型即掺假定量模型。经测定样品得出定量限、回收率结果见表2。

表2.检测结果

由表2可知，本发明可检测的牛奶中掺假豆奶的定量限为5％，羊奶中掺假豆奶的定量限为5％，羊奶中掺假牛奶的检出限为10％，定量限为20％(当RSD值低于10％时为定量限，当RSD值低于30％时为检出限)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种鉴别奶品品质的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)对标准奶样品进行预处理；

2)利用一维核磁共振技术和二维核磁共振技术，对标准奶样品中的代谢物进行定性和定量分析；

3)根据表征因子含量数据，对标准奶样品进行主成分分析，利用Fisher判别法建立标准奶样品的判别模型；

所述表征因子包含：柠檬酸、肌酸、卵磷脂、D型乳糖和D型蔗糖；

4)配制不同比例的掺假奶样品，按照步骤1)预处理方法进行预处理，之后利用¹HNMR技术对各掺假奶样品中上述表征因子进行定量，利用偏最小二乘法建立多元回归定量模型，并测定其定量限和回收率；

5)对待测奶样品进行检测，按照步骤1)预处理方法进行预处理，之后利用¹HNMR技术对样品中上述表征因子进行定量，将各表征因子的含量数据带入步骤3)所得模型中可判别样品的种类，再将各表征因子含量数据带入步骤4)所得模型中可判别是否掺假廉价奶，且可定量出掺假廉价奶的比例。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准奶为纯牛奶、纯羊奶和豆奶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中预处理的具体方法为：

取5～10份奶样，加入10～20份无水乙醇蜗旋混匀；离心取上层溶液用氮气吹干；加入2～4份重水进行水浴超声，涡旋混匀重新溶解样品，离心取上层溶液，供下一步检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重水含1～5mM的内标物TSP(2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸)。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，离心条件为10000～15000rpm离心10～30min。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，水浴超声的条件为20～30℃水浴超声10～30min。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中核磁共振定性及定量检测的具体方法为：

I.不同种类奶中各表征因子的定性分析：

利用一维(¹HNMR,¹³CNMR)和二维(¹H-¹³CHSQC,¹H-¹³CHMBC)核磁共振技术对样品进行检测分析，技术参数设置如下：

¹HNMR参数如下：数据点数，64K；谱宽，8223.7Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，8-32；采集时间，4s；¹³CNMR参数设置如下：数据点数，64K；谱宽，24038.5Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，1024-2048；采集时间，1.36s；

¹H-¹³CHSQC参数设置如下：数据点数，F2为2048，F1为256；谱宽，F2为8223.7Hz，F1为24038.5Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，16-64；空扫次数，16-32；采集时间，0.13s；

¹H-¹³CHMBC参数设置如下：数据点数，F2为2048，F1为256；谱宽，F2为8223.7Hz，F1为24038.5Hz；弛豫时间，2-4s；扫描次数，32-128；空扫次数，16-32；采集时间，0.13s；

II.不同种类奶中各表征因子利用内标法定量：

核磁共振图谱经相位调整和基线校正后，以1～5mMTSP为内标物，利用以下定量公式，对不同种类奶中的表征因子进行定量分析；

n代表奶样的浓度倍数；Met代表奶中的代谢物；Ref代表内标物。