CN105087811A - Sirt3基因的用途及其相关药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物研发领域，具体公开了SIRT3基因的用途及其相关药物。本发明首次发现，SIRT3在HBV复制细胞系中的显著低表达。过表达SIRT3能够显著抑制HBV复制。沉默SIRT3能够显著促进HBV复制。基于上述研究成果，本发明首次提供了分离的SIRT3基因在筛选乙型肝炎治疗药物以及在制备或筛选乙型肝炎诊断试剂中的用途，并提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，具有广阔的应用前景。

Description

SIRT3基因的用途及其相关药物
技术领域
本发明涉及药物研发领域，具体公开了SIRT3基因的用途及其相关药物。
背景技术
乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)感染呈世界范围广泛流行，全球有超过3亿慢性感染者；并逐步发展为慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌，每年约有100万人死于乙肝相关的各种终末期疾病。目前，治疗乙型肝炎现症患者的主要药物包括干扰素和核苷类似物。干扰素仅对不到30％的患者效果明显，且副反应较大，应用受到一定限制。已上市的核苷类似物(nucleotideanalog，NAs)包括拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩替卡韦和替诺福韦共五种。这些药物可在一定时期内降低多数患者的血清HBV载量，改善转氨酶水平及肝脏组织学表现，但最终达到病毒cccDNA清除这一理想治疗目标的比例仍然较低，而且，NAs通常需要长期用药以维持效果，但长期用药又可能产生病毒耐药问题。
因此，寻找新的分子生物学治疗靶点，发展新的治疗策略，尤其是发展阻断HBVcccDNA新靶点或策略显得尤为重要。
HBV基因组长约3.2kb,为部分环状双链DNA，其复制过程中最基本的事件是rcDNA转化成cccDNA。cccDNA是HBV所有mRNA转录的模板，与多种组蛋白和非组蛋白共同组成病毒微染色体，其形成标志着病毒初始感染。目前，多项研究证实cccDNA的表观遗传修饰可以过程调控HBV的复制过程。
Sirtuin家族是一组依赖烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。它包括7个家族成员(SIRT1-7)，分别通过其去乙酰化的活性广泛参与了多种细胞生理过程的调节，如应激反应、能量代谢、细胞增殖、DNA修复、细胞衰老和细胞凋亡等。SIRT3对HBV复制和转录的影响，现有技术中未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供SIRT3基因的用途及其相关药物。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种分离的SIRT3基因在筛选乙型肝炎治疗药物中的用途。
将分离的SIRT3基因用于筛选乙型肝炎治疗药物，是指将SIRT3基因作为药物或制剂
针对乙型肝炎的作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物或制剂。
所述将SIRT3基因作为药物或制剂针对乙型肝炎的作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物或制剂具体是指：将SIRT3基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以提高或促进SIRT3基因表达的药物作为乙型肝炎治疗备选药物。如本发明所述的过表达SIRT3基因的质粒，是以SIRT3基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制乙型肝炎病毒作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将SIRT3基因及其蛋白作为作用对象。
所述乙型肝炎治疗药物为能够特异性提高或促进SIRT3基因的转录或翻译，或能够特异性提高或促进SIRT3蛋白的表达或活性的分子，从而提高细胞中SIRT3基因的表达水平，达到抑制乙肝病毒的复制或存活的目的。
所述通过分离的SIRT3基因筛选获得的乙肝病毒治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或病毒。
所述乙型肝炎治疗药物的施用量为足够提高或促进SIRT3基因的转录或翻译，或者足够提高或促进SIRT3蛋白的表达或活性的剂量。
采用前述乙型肝炎治疗药物治疗乙型肝炎的方法，主要是通过提高或促进SIRT3基因的表达水平抑制乙型肝炎病毒的复制来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效促进或提高SIRT3基因表达水平的物质给药于患者。
本发明的第二方面，提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，包括步骤：
(1)将待测物质加入表达SIRT3基因的体系中；
(2)检测所述体系中SIRT3基因的转录或表达水平，其中，与未加入待测物质的实验相比，若所述待测物质能够促进或提高SIRT3基因的转录或表达，则表明该待测物质可作为候选乙型肝炎治疗药物。
本发明的第三方面，提供了一种分离的SIRT3基因/蛋白在制备或筛选乙型肝炎诊断试剂中的用途。
优选地，所述SIRT3基因/蛋白作为生物标志物。更优选地，所述SIRT3基因基因/蛋白作为血清生物标志物。
优选地，所述乙型肝炎诊断试剂用于乙型肝炎的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于制备乙型诊断试剂，是指将SIRT3基因/蛋白作为基于检测SIRT3基因/蛋白含量的乙型肝炎诊断试剂的标准品或阳性对照，用于样本血清中的SIRT3基因/蛋白的检测。
将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于筛选乙型肝炎诊断试剂，是指将SIRT3基因/蛋白作为靶标应用于乙型肝炎诊断试剂的筛选。具体地，可以基于所述的SIRT3基因的序列，筛选特异性扩增SIRT3基因转录本的引物从而作为检测乙型肝炎的试剂，来检测样本血清中SIRT3基因水平。或者，可以基于所述SIRT3蛋白，筛选特异性针对SIRT3蛋白的抗体，来检测样本血清中SIRT3蛋白水平。
本发明的第四方面，提供了一种乙型肝炎诊断试剂盒，包括特异性扩增SIRT3基因转录本的引物或特异性抗SIRT3蛋白的抗体。
本发明的第五方面，提供了一种诊断乙型肝炎的方法，包括步骤：检测样本血清中SIRT3基因或蛋白的水平。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，SIRT3在HBV复制细胞系中的显著低表达。并且，过表达SIRT3能够显著抑制HBV复制中间体的表达；过表达SIRT3能够显著抑制HBVcore(HBc)蛋白的表达；过表达SIRT3能够显著抑制HBsAg和HBeAg的分泌；过表达SIRT3能够显著抑制HBV复制的模板HBV3.5kbmRNA表达。综上所述，过表达SIRT3能够显著抑制HBV复制。
此外，本发明还首次发现，沉默SIRT3能够显著促进HBV复制中间体的表达；沉默SIRT3能够显著促进HBVcore(HBc)蛋白的表达；沉默SIRT3能够显著促进HBsAg和HBeAg的分泌；沉默SIRT3能够明显促进HBV3.5kbmRNA的表达。综上所述，沉默SIRT3能够显著促进HBV复制。
基于上述研究成果，本发明首次提供了分离的SIRT3基因在在筛选乙型肝炎治疗药物以及在制备或筛选乙型肝炎诊断试剂中的用途，并提供了一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：Westernblot检测SIRT3在HBV复制细胞系中的表达；其中，图1A表示通过weaternblot检测发现SIRT3的蛋白表达水平在HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15显著低于对照细胞HepG2；图1B表示SIRT3在四环素未处理的HepAD38细胞中的表达水平显著低于四环素处理的HepAD38细胞。
图2：westernblot验证SIRT3过表达。
图3：Real-timePCR检测SIRT3对HBV复制中间体表达的影响；其中，图3A表示通过real-timePCR检测发现在SIRT3过表达后HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体的表达水平下降了约75％；图3B表示SIRT3过表达后HepAD38细胞中HBV复制中间体的表达水平下降了约55％。
图4：Southernblot检测过表达SIRT3对HBV复制中间体表达的影响，M:marker；rcDNA:不饱和双链DNA；dsDNA:双链线性DNA；ssDNA:单链线性DNA。
图5：Westernblot检测过表达SIRT3对病毒蛋白HBc表达的影响。
图6：ELISA分析过表达SIRT3对HBV抗原分泌的影响。
图7：RT-PCR检测过表达SIRT3对HBV3.5kbmRNA表达的影响。
图8：Real-timePCR和southernblot检测过表达SIRT3对环化HBV复制的影响；其中图8A表示real-timePCR分析发现SIRT3过表达后，环化的HBV的复制水平下降了约45％；图8B表示southernblot进一步证实过表达SIRT3抑制HBV的复制。
图9：Westernblot检测SIRT3基因沉默效果。
图10：Real-timePCR验证SIRT3基因沉默对HBV复制中间体表达的影响；图10A表示通过real-timePCR检测发现HepG2.2.15细胞在转染siSIRT3-1和siSIRT3-2后，HBV复制中间体的表达水平分别升高约75％和130％；图10B表示HepAD38细胞在转染siSIRT3-1和siSIRT3-2后，HBV复制中间体的表达水平分别升高约50％和95％。
图11：Southernblot检测SIRT3基因沉默对HBV复制中间体表达的影响。
图12：Westernblot检测SIRT3基因沉默对HBc表达的影响。
图13：ELISA分析SIRT3基因沉默对HBV抗原分泌的影响；其中图13A表示ELISA分析发现SIRT3沉默也明显促进了HBsAg和HBeAg的分泌；图13B表示siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后HBsAg的分泌分别增加约30％和35％，HBeAg的分泌分别增加约35％和40％。
图14：RT-PCR检测SIRT3基因沉默对HBV3.5kbmRNA表达水平的影响；图14A表示在HepG2.2.15细胞中转染siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后HBV3.5kbmRNA的表达分别升高约85％和115％；图14B表示在HepAD38细胞中转染siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后HBV3.5kbmRNA的表达分别升高约70％和90％。
图15：Real-timePCR和southernblot分别检测SIRT3基因沉默对环化HBV复制的影响；其中图15A表示real-timePCR分析发现siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后，环化的HBV的复制水平分别升高了约100％和65％；图15B表示southernblot进一步证实SIRT3沉默促进了HBV的复制。
图16：TaqMan探针real-timePCR分析过表达SIRT3对HBVcccDNA表达的影响。
图17：TaqMan探针real-timePCR分析SIRT3沉默对HBVcccDNA表达的影响。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
实施例1实验方法
1.细胞培养和转染方法
HepG2.2.15和HepAD38细胞系培养于含有10％胎牛血清，400μg/mlG418的MEM培养基中，Huh-7细胞系培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，所有细胞均在含5％C02，37℃孵箱中常规培养。质粒按照X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent(Roche)说明书转染，siRNA按照Lipofectamin2000TM(Invitrogen)的说明书转染。
2.HBVDNA环化
以pGEM-HBV1.3为模板PCR扩增HBVDNA全基因组，PCR引物F:CCGGAATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTARTCATC(SEQIDNO.1)，R:CCGGAATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG(SEQIDNO.2)，采用Roche公司DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，BspQⅠ酶切处理纯化产物，胶回收纯化酶切产物后，采用T4DNA连接酶连接纯化产物，并用酚氯仿抽提法得到纯的环化后的HBVDNA。
3.Westernblotting检测
细胞转染3-5天后用RIPA裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量(30μg)细胞总蛋白上样，于10％的SDS-PAGE中分离蛋白后，在BioRad湿式转移电泳槽中，以90V电转膜4h。将转移好的NC膜用5％脱脂牛奶封闭1h。将经过封闭处理的NC膜孵育于一抗(以封闭液1：2000稀释一抗)，4℃摇床孵育过夜。然后以TBS-T洗涤3次，每次10min。二抗(即HRP标记的兔抗人IgG抗体，以封闭液按1：3000稀释)室温下摇床孵育2h，洗涤3次后，ECL显影。以β-actin为内参。
4.细胞内HBV复制中间体提取和southernblot分析
PBS清洗六孔板中细胞2次后，加入0.5ml细胞裂解液(10mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、1％NP-40、和2％sucrose)，混匀后，37℃孵育15min，收集细胞裂解液，15000g离心5min。在上清中加入40U/mlDNase1和10mMMgCl2，37℃孵育4h后加入200μl35％PEG8000(含1.5MNaCl),冰浴1h后11000g、4℃离心5min，弃上清，加入0.5ml蛋白酶K消化液(0.5％SDS,150mMNaCl,25mMTris-HClpH8.0和10mMEDTA)和0.5mg/ml蛋白酶K(Takara)，45℃水浴过夜。等体积酚氯仿抽提、70％乙醇沉淀,TE缓冲液溶解HBVDNA。提取的HBVDNA经0.9％琼脂糖凝胶电泳，毛细管虹吸法转膜，120℃固定。预杂交lh，加人地高辛标记DNA探针杂交过夜。然后洗膜、化学发光、采集图片、标记结果。
5.实时荧光定量PCR(qPCR)
①检测HBV复制中间体：提取HBV复制中间体，按照SYBRGreen(Roche,Germany)说明书配制反应体系和设置反应条件，HBVDNA引物，F：CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC(SEQIDNO.3)，R:TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA(SEQIDNO.4)。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。②检测HBV3.5kbmRNA:Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA，DNA酶处理样本，采用Bio-Rad公司iScriptTMcDNASynthesisKit逆转录RNA合成cDNA，按照SYBRGreen(Roche)说明书配制反应体系和设置反应条件，HBV3.5kbmRNA引物，F:CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT，R:AGCACTGTGTTGGCGTACAG，每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。
6.HBsAg和HBeAg的检测
按照酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒操作说明检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg的分泌水平。
7.Hirt法提取HBVcccDNA
HepAD38细胞接种于六孔板中，转染4d后，PBS清洗细胞，胰酶消化，计数，在等量的细胞中加入500μLSDS细胞裂解液(50mmol/LTris-HClpH8.0，10mmol/LEDTA，150mmol/LNaCl，1％SDS)，轻柔混匀，37℃孵育15min后，加入125μL2.5mol/LKCl，轻柔混匀后置于摇床，冰浴过夜。第二日，4℃，14000×g离心20min，取上清，酚氯仿抽提上清3次，70％异丙醇沉淀cccDNA，70％乙醇洗涤cccDNA，干燥后用Elutionbuffer溶解cccDNA。
8.TaqMan探针法检测HBVcccDNA表达水平
Hirt法提取HBVcccDNA，PSAD酶处理后，按照TIANGEN公司RealMasterMix(probe)操作说明书配置反应体系和设置PCR反应条件，HBVcccDNA引物F：CTCCCCGTCTGTGCCTTCT，HBVcccDNA引物R：GCCCCAAAGCCACCCAAG，probe：FAM-ACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCC-TAM，每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次
9.统计处理
采用SPSS17.0软件进行统计，两组间比较采用配对t检验和多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
实施例2实验结果分析
1.SIRT3在HBV复制细胞系中的表达
我们通过weaternblot检测发现SIRT3的蛋白表达水平在HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15显著低于对照细胞HepG2(如图1A所示)，同时我们也检测了SIRT3在另一个HBV稳定复制细胞系HepAD38(四环素处理时HBV不复制)中的表达水平，westernblot分析证实SIRT3在四环素未处理的HepAD38细胞中的表达水平显著低于四环素处理的HepAD38细胞(如图1B所示)。表明SIRT3在HBV复制细胞系中的表达水平显著降低。
2.过表达SIRT3对HBV复制的影响
首先，为了验证过表达SIRT3对HBV复制的影响，我们分别将25×104的HepG2.2.15细胞和20×104的HepAD38细胞接种于六孔板，24h后分别转染SIRT3过表达质粒(Addgene,货号#13814)和空白对照质粒，5d后裂解细胞，提取细胞蛋白，westernblot证实SIRT3成功过表达(如图2所示)；同时，提取HBV复制中间体，通过real-timePCR检测发现在SIRT3过表达后HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体的表达水平下降了约75％(如图3A所示)，HepAD38细胞中HBV复制中间体的表达水平下降了约55％(如图3B所示)，southernblot检测进一步证实过表达SIRT3显著抑制了HBV复制中间体的表达(图4)。
其次，我们也检测了过表达SIRT3对HBV蛋白表达的影响，westernblot检测发现SIRT3显著抑制了HepG2.2.15和HepAD38细胞中HBVcore(HBc)蛋白的表达(如图5所示)，ELISA分析发现SIRT3也明显抑制了HBsAg和HBeAg的分泌，抑制率分别约为25％和26％(如图6所示)。
再次，我们也检测了过表达SIRT3对HBV复制的模板HBV3.5kbmRNA表达的影响，RT-PCR分析证实SIRT3显著抑制了HepG2.2.15和HepAD38细胞中HBV3.5kbmRNA的表达水平，抑制率分别约为80％和70％(如图7所示)。
最后，我们也检测了过表达SIRT3对外源性HBV复制的影响，我们将16×104的Huh-7细胞接种于六孔板，24h后共转染环化HBV和SIRT3表达质粒及对照质粒，3d后提取HBV复制中间体，real-timePCR分析发现SIRT3过表达后，环化的HBV的复制水平下降了约45％(如图8A所示)，southernblot进一步证实过表达SIRT3抑制HBV的复制(如图8B所示)。
3.SIRT3沉默对HBV复制的影响
首先，我们分别将25×104的HepG2.2.15细胞和20×104的HepAD38细胞接种于六孔板，24h后分别转染靶向沉默SIRT3的siSIRT3-1、siSIRT3-2和siCont，si-SIRT3-1:GCCCGACAUUGUGUUCUUUTT(SEQIDNO.5)；
si-SIRT3-2:CCAGUGGCAUUCCAGACUUTT(SEQIDNO.6)。
5d后提取细胞总蛋白，westernblot验证SIRT3在两个细胞系中的沉默是有效的(如图9所示)；同时，我们提取了HBV复制中间体，通过real-timePCR检测发现HepG2.2.15细胞在转染siSIRT3-1和siSIRT3-2后，HBV复制中间体的表达水平分别升高约75％和130％(如图10A所示)，HepAD38细胞在转染siSIRT3-1和siSIRT3-2后，HBV复制中间体的表达水平分别升高约50％和95％(如图10B所示)，southernblot检测进一步证实SIRT3沉默显著促进了HBV复制中间体的表达(如图11所示)。
其次，我们也检测了SIRT3沉默对HBV蛋白表达的影响，westernblot检测发现SIRT3沉默明显促进了HepG2.2.15和HepAD38细胞中HBc蛋白的表达(如图12所示)，ELISA分析发现SIRT3沉默也明显促进了HBsAg和HBeAg的分泌(如图13A所示)，siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后HBsAg的分泌分别增加约30％和35％，HBeAg的分泌分别增加约35％和40％(如图13B所示)。
再次，我们也检测了SIRT3沉默对HBV3.5kbmRNA表达的影响，RT-PCR分析证实SIRT3沉默明显促进了HBV3.5kbmRNA的表达，在HepG2.2.15细胞中转染siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后HBV3.5kbmRNA的表达分别升高约85％和115％(如图14A所示)，在HepAD38细胞中转染siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后HBV3.5kbmRNA的表达分别升高约70％和90％(如图14B所示)。
最后，我们也检测了SIRT3沉默对环化HBV复制的影响，在Huh-7细胞中分别共转染环化HBV和siSIRT3-1，siSIRT3-2及siCont,3d后提取HBV复制中间体，real-timePCR分析发现siSIRT3-1和siSIRT3-2转染后，环化的HBV的复制水平分别升高了约100％和65％(如图15A所示)，southernblot进一步证实SIRT3沉默促进了HBV的复制(如图15B所示)。
4.SIRT3对HBVcccDNA表达的影响
HBVcccDNA作为HBV3.5kbmRNA转录的模板，是HBV复制最原始的模板，我们也检测了SIRT3对HBVcccDNA表达的影响。在HepAD38细胞中过表达SIRT3后，Hirt法提取HBVcccDNA，TaqMan探针real-timePCR分析发现HBVcccDNA的表达水平下降了约50％(图16)。为进一步确定SIRT3对HBVcccDNA表达的影响，我们用siSIRT3-1和siSIRT3-2沉默SIRT3表达后，TaqMan探针real-timePCR分析证实HBVcccDNA的表达水平分别升高约70％和105％(如图17所示)，表明SIRT3明显抑制HBVcccDNA的表达。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.分离的SIRT3基因在筛选乙型肝炎治疗药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，将分离的SIRT3基因用于筛选乙型肝炎治疗药物，是指将SIRT3基因作为药物或制剂针对乙型肝炎病毒的作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物或制剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述将SIRT3基因作为药物或制剂针对乙型肝炎病毒的作用靶标应用于筛选乙型肝炎治疗药物或制剂具体是指：将SIRT3基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以提高或促进SIRT3基因表达的药物作为乙型肝炎治疗备选药物。
4.一种筛选乙型肝炎治疗药物的方法，包括步骤：
(1)将待测物质加入表达SIRT3基因的体系中；
(2)检测所述体系中SIRT3基因的转录或表达水平，其中，与未加入待测物质的实验相比，若所述待测物质能够促进或提高SIRT3基因的表达或提高SIRT3蛋白酶活性，则表明该待测物质可作为候选乙型肝炎治疗药物。
5.分离的SIRT3基因/蛋白在制备或筛选乙型肝炎诊断试剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述SIRT3基因/蛋白作为生物标志物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于制备乙型诊断试剂，是指将SIRT3基因/蛋白作为基于检测SIRT3基因/蛋白含量的乙型肝炎诊断试剂的标准品或阳性对照，用于样本血清中的SIRT3基因/蛋白的检测。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，将SIRT3基因/蛋白作为生物标志物用于筛选乙型肝炎诊断试剂，是指将SIRT3基因/蛋白作为靶标应用于乙型肝炎诊断试剂的筛选。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，可以基于所述的SIRT3基因的序列，筛选特异性扩增SIRT3基因转录本的引物从而作为检测乙型肝炎的试剂，来检测样本血清中SIRT3基因水平；或者，可以基于所述SIRT3蛋白，筛选特异性针对SIRT3蛋白的抗体，来检测样本血清中SIRT3蛋白水平。
10.一种乙型肝炎诊断试剂盒，包括特异性扩增SIRT3基因转录本的引物或特异性抗SIRT3蛋白的抗体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109507430A (zh) * 2018-09-06 2019-03-22 重庆医科大学 Sirt7的功能与用途
CN112725418A (zh) * 2021-01-25 2021-04-30 深圳乐土生物科技有限公司 基于游离rna检测pd-l1表达量的方法及其试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012106509A1 (en) * 2011-02-02 2012-08-09 The Trustees Of Princeton University Sirtuin modulators as virus production modulators

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012106509A1 (en) * 2011-02-02 2012-08-09 The Trustees Of Princeton University Sirtuin modulators as virus production modulators

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JI-HUA REN ET AL.: "Protective Role of Sirtuin3 (SIRT3) in Oxidative Stress Mediated by Hepatitis B Virus X Protein Expression", 《PLOS ONE》 *
任吉华 等: "SIRT3在HBV感染诱导的氧化应激反应中的作用及其对HBV复制的影响", 《中国生物化学与分子生物学会第十一次会员代表大会暨2014年全国学术会议》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109507430A (zh) * 2018-09-06 2019-03-22 重庆医科大学 Sirt7的功能与用途
CN112725418A (zh) * 2021-01-25 2021-04-30 深圳乐土生物科技有限公司 基于游离rna检测pd-l1表达量的方法及其试剂盒

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