CN105076915A - 一种酶法制备得到的脂溶性竹叶抗氧化物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酶法制备得到的脂溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)及其用途。具体地，本发明的eAOB-o包括以下特征性成分：对香豆酸、和一种或多种5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物被酰基修饰的产物；其中，所述的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物为取代的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；所述的取代指苯并吡喃环被以下取代：苯并吡喃环的苯环部分上的任意一个氢原子被一个糖基所取代，且苯并吡喃环的2位被具有1-3个羟基取代基的苯基取代；其中，所述的酰基修饰指所述糖基上的羟基被C8-C18的酰基修饰基所修饰；且所述5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物与酰基修饰基的摩尔比为1:0.5-2。

Description

一种酶法制备得到的脂溶性竹叶抗氧化物及其用途

技术领域

本发明涉及食品添加剂领域，具体是指以酶法催化的方式实现水溶性竹叶抗氧化物(AOB-w)的酯化，产物脂溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)在食品工业中主要作为油脂抗氧化剂，并可同步抑制高温加工过程中美拉德反应伴生危害物丙烯酰胺(AA)和晚期糖基化终末产物(AGEs)的形成，尤为适合于高温用油(如煎炸油、焙烤油、脱膜油)以及需经热加工处理的高脂食品(如油炸薯类制品和曲奇)。

背景技术

油脂氧化是导致食品品质劣化的一个重要因素。油脂氧化会降低营养品质、缩短货架期、甚至产生新的危害物，对消费者的健康与安全造成威胁。直接在油脂中添加抗氧化剂是阻止或延缓油脂氧化变质、延长食品货架寿命最为行之有效的方法。合成的食品抗氧化剂虽然抗氧化效果良好且价格低廉，曾在食品工业中应用广泛，但存在一定的安全隐患，其使用已逐渐受限。如美国国家卫生研究院的报告认为丁基羟基茴香醚(BHA)是一种人类可疑的致癌物，美国已将其从GRAS(公认安全)名单中删除，在日本BHA只准用于棕榈油和棕榈仁油。又如在日本、瑞典、澳洲等国，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)被明令禁止添加于食品中，在美国也只被允许添加于某些食品。尽管特丁基对苯二酚(TBHQ)是合成品中安全性最高、性能最好的一种，但由于缺少足够的长期安全性试验数据，其致突变性不能排除，故在EEC所属的国家(欧洲国家和日本等)还未批准TBHQ的使用。天然抗氧化剂如迷迭香提取物(Rosemaryextract,RE)在油脂抗氧化方面表现出良好的效果，但是其脂溶性有限、且价格较昂贵，并具有特殊的气味，在一定程度上限制了其在油脂工业中的大规模应用。

事实上，天然抗氧化剂主要来源于植物，大多为多羟基物质，亲水性良好，而亲脂性较弱，无法充分与油脂混合，进而影响其抗氧化作用的发挥。对天然抗氧化剂进行分子修饰是改善其脂溶性的重要途径，酯化的手段包括化学法和酶法。目前通过化学法修饰得到的油脂抗氧化剂有维生素C棕榈酸酯(AP)、脂溶性茶多酚(OTP)及油溶性竹叶抗氧化物(cAOB-o)，它们分别是维生素C、茶多酚、竹叶抗氧化物与脂肪酸的酯化产物，可作为脂溶性抗氧化剂和/或营养强化剂添加于油脂或食品中。

利用化学法对天然抗氧化剂进行结构修饰能在一定程度上满足脂溶性的需求，如发明人前期公开的一种利用氧酰化法制备脂溶性竹叶抗氧化物的方法(CN103005007A)。然而，化学酰化选择性较低，反应条件剧烈，过程不易控制，常伴随大量副产物的生成，给后续分离纯化工作带来困难，同时制造过程产生大量的废液，如处理不当会污染环境。而酶法酰化可实现对底物的定向修饰，且反应条件温和，副产物少。如CN102747117A公开了一种酶法合成脂溶性茶多酚的方法，有机溶剂为反应介质，利用脂肪酶催化茶多酚与脂肪酸乙烯酯合成脂溶性茶多酚，与其他化学合成法(CN101255151和CN101270108)相比具有一定优势。又如CN102787146A公布了一种微波辅助脂肪酶催化合成改性表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的方法，该方法在CN102747117A基础上，可显著加快反应速度，提高反应产率，缩短反应时间。然而，脂肪酸乙烯酯中目前仅有月桂酸乙烯酯被允许在胶基糖果作为基础剂物质及其配料使用(GB2760-2011)，其他食品领域均未被批准使用。同时，与脂肪酸相比，脂肪酸乙烯酯的沸点、闪点均大大降低，过程中往往需添加稳定剂，且价格较昂贵，具有显著的局限性。CN103131741A公开了一种活性植物多酚类物质的生物修饰法，以有机溶剂为介质，在固定化脂肪酶催化下，使植物多酚的单体化合物与C2-C18的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯反应得到植物多酚的脂肪酸酯。但是，天然来源的抗氧化剂往往是多组分的复杂体系，其分子修饰的难度较单体物质要复杂得多，酯化对产品性能的影响也更具不确定性。如何实现天然抗氧化剂的酯化修饰并确保其抗氧化活性是问题的关键所在。

就酰化反应的体系而言，有机溶剂是常用试剂，但其具有易挥发、易燃的特点，对过程管理及生产环境带来一定影响，且溶剂残留问题也尚未得到很好解决。离子型液体具有不可燃、热稳定性好、可溶解的物质范围广以及可设计性等特点，正逐渐成为食品工业中一种绿色、环保的新型溶剂，应用前景广阔。解决溶剂残留最彻底的方法是采用无溶剂催化反应体系，然而许多反应在无溶剂状态下则无法进行。

综上所述，本领域尚缺乏一种能够抑制和延缓煎炸油在高温下的氧化变质、控制食品中内源性化学污染物的产生的方法。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种脂溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)，所述脂溶性竹叶抗氧化物包括以下特征性成分：对香豆酸、和一种或多种5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物被酰基修饰的产物；其中，所述的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物为取代的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

所述的取代指苯并吡喃环被以下取代：苯并吡喃环的苯环部分上的任意一个氢原子被一个糖基所取代，且苯并吡喃环的2位被具有1-3个羟基取代基的苯基取代；

其中，所述的酰基修饰指所述糖基上的羟基被C8-C18的酰基修饰基所修饰；且所述5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物与酰基修饰基的摩尔比为1:0.5-2。

在另一优选例中，所述5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物与酰基修饰基的摩尔比为1:0.8-1.2。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物的对香豆酸含量为≥0.5％，较佳地为0.51％～0.80％。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物的总酚含量为≥20％，较佳地为20.1％～28.0％。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物的乙酸乙酯溶解度≥3g/100mL，较佳地为3.5g/100mL～6.3g/100mL(以脂溶性竹叶抗氧化物在100mL乙酸乙酯中的溶解质量计算)。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物是淡黄色至黄棕色的固体，较佳地，所述的脂溶性竹叶抗氧化物是淡黄色至黄棕色的粉末、颗粒或片状固体。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物具有以下性能：可抑制高温加工过程中丙烯酰胺(AA)和/或晚期糖基化终末产物(AGEs)的形成。

在另一优选例中，所述的晚期糖基化终末产物为羧甲基赖氨酸(CML)和/或羧乙基赖氨酸(CEL)。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物对丙烯酰胺形成的抑制率为≥20％，较佳地为≥25％，更佳地为≥27％。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物对丙烯醛途径形成丙烯酰胺的抑制率为≥50％，较佳地为≥70％，更佳地为≥80％。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物可以完全抑制丙烯醛途径形成的丙烯酰胺。

在另一优选例中，所述5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物被酰基修饰的产物选自下组：A.1、A.2、A.3、A.4、B.1、B.2、B.3、B.4、C.1、C.2、C.3、C.4；

其中，所示的R基团是C8-C18的酰基。

在另一优选例中，所述的C8-C18的酰基指C8-C18的脂肪酸脱去羟基后形成的基团，较佳地，所述的脂肪酸选自下组：辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸，或其组合。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物是通过以下方法制备的：

在酶催化下，使水溶性竹叶抗氧化物(AOB-w)与C8-C18的脂肪酸反应，进行单羟基酰化，得到脂溶性竹叶抗氧化物；

较佳地，所述的方法包括步骤：在酶催化下，用水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸在40℃～80℃下进行酰化反应，得到脂溶性竹叶抗氧化物。

本发明的第二方面，提供了一种脂溶性竹叶抗氧化物的制备方法，包括步骤：在酶催化下，使水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸反应，进行单羟基酰化，得到脂溶性竹叶抗氧化物；

较佳地，所述的方法包括步骤：在酶催化下，用水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸在40℃～80℃下进行酰化反应，得到脂溶性竹叶抗氧化物。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物是如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物。

在另一优选例中，所述步骤的反应时间为4h～48h；较佳地为6h～24h。

在另一优选例中，所述步骤中，水溶性竹叶抗氧化物与脂肪酸的质量比为1：1～30；较佳地为1:5～15。

在另一优选例中，所述方法的收率为40～100％，较佳地为50～100％，更佳地为60～100％。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：反应完成后，用乙腈-正庚烷溶液对反应液进行萃取，得到含有脂溶性竹叶抗氧化物的下相；较佳地，所述的乙腈-正庚烷溶液的体积比为乙腈:正庚烷＝2:5。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对所述萃取得到的下相用乙酸乙酯-水溶液进行二次萃取，得到含有脂溶性竹叶抗氧化物的上相；较佳地，所述的乙酸乙酯-水溶液的体积比为乙酸乙酯：水＝3:5。

在另一优选例中，所述方法还包括：在进行萃取前，对待萃取液进行浓缩。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：反应完成后，用乙腈-正庚烷溶液对反应液进行萃取，得到含有脂溶性竹叶抗氧化物的下相；较佳地，所述的乙腈-正庚烷溶液的体积比为乙腈:正庚烷＝2:5。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对上述萃取得到的下相用乙醇水溶液-石油醚进行二次萃取，得到含有脂溶性竹叶抗氧化物的下相；较佳地，所述的乙醇水溶液-石油醚的体积比为乙醇水溶液：石油醚＝2:5。

在另一优选例中，所述的步骤在无溶剂条件下进行，或所述的步骤在有机溶剂或离子型溶剂中进行；

较佳地，所述的有机溶剂选自下组：叔戊醇(优选为水饱和叔戊醇)、丙酮、乙酸乙酯、叔丁醇，或其组合；

所述的离子型溶剂为阳离子和阴离子组成的盐，其中，所述的阳离子为未取代或被C1-C8的烷基取代的咪唑，且所述的阴离子选自下组：BF₄ ^-、PF₆ ^-、TFSI^-，或其组合。

在另一优选例中，所述AOB-w与有机溶剂的用量比为1g：25～250mL。

在另一优选例中，所述的酶选自下组：南极假丝酵母脂肪酶、枯草杆菌蛋白酶、米黑根毛霉脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，或其组合；优选南极假丝酵母脂肪酶；和/或

所述的C8-C18的脂肪酸选自下组：辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸，或其组合。

在另一优选例中，当所述反应在有机溶剂或离子型溶剂中进行时，所述的脂肪酸为C8-C18的脂肪酸。

在另一优选例中，当所述反应在无溶剂条件下进行时，所述的脂肪酸为C8-C12的脂肪酸。

在另一优选例中，所述AOB-w与所述酶的用量重量比为1：0.5-5；较佳地为1：1-4。

本发明的第三方面，提供了一种食品添加剂，所述的食品添加剂含有如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物，和任选的食品上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的食品添加剂为如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物溶于中长链脂肪酸形成的食品添加剂。

在另一优选例中，所述的食品添加剂为质量分数1～20％的脂溶性竹叶抗氧化物的中长链脂肪酸酯溶液；其中，所述的中长链脂肪酸选自下组：辛葵酸甘油酯、月桂酸甘油酯、肉豆蔻酸甘油酯、棕榈酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、油酸甘油酯、亚油酸甘油酯，或其组合。

本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物的用途，用于选自下组的一种或多种用途：

(a)作为高温食品加工的抗氧化剂；

(b)作为高温食品加工的丙烯酰胺抑制剂；

(c)用于制备高温食品加工的抗氧化剂；

(d)用于制备高温食品加工的丙烯酰胺抑制剂；

(e)在高温食品加工工艺中用于抑制丙烯酰胺和/或晚期糖基化终末产物的生成；

(f)作为油脂抗氧化剂。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物用于抑制食品热加工过程中丙烯酰胺、羧甲基赖氨酸、和/或羧乙基赖氨酸的生成。

在另一优选例中，所述抗氧化指油脂或食品中选自下组的一个或多个指标降低：过氧化值、茴香胺值、硫代巴比妥酸值、酸价、极性化合物含量、游离脂肪酸含量、丙二醛含量。

本发明的第五方面，提供了一种食品加工方法，所述方法包括步骤：在加工过程之前、之中或之后，在食品原料中添加如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物，或添加如本发明第三方面所述的食品添加剂。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：将所述的脂溶性竹叶抗氧化物或食品添加剂溶于油脂中，用于加工食品；较佳地，所述的油脂选自下组：煎炸油、焙烤油、脱膜油，或其组合。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物或食品添加剂的添加量为油品质量分数的0.01～0.05wt％，以脂溶性竹叶抗氧化物的质量计。

在另一优选例中，所述的食品添加剂为如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物溶于中长链脂肪酸形成的食品添加剂。

在另一优选例中，所述的食品加工方法还包括：在加工过程之前、之中或之后，添加水溶性竹叶抗氧化物(AOB-w)。

在另一优选例中，所述的食品加工方法包括：在油脂中添加如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物，或添加如本发明第三方面所述的食品添加剂；并用水溶性竹叶抗氧化物处理食品原料。

本发明的第六方面，提供了一种食品，所述的食品在加工过程中添加如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物或含有如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物的食品组分。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物使得热加工食品中的丙烯酰胺生成被抑制。

在另一优选例中，所述的食品中，如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物在油脂中建议添加量为100～500ppm，优选100～300ppm。

在另一优选例中，所述的食品中，丙烯酰胺抑制率≥20％，较佳的为25％～30％；折合成对油脂氧化途径(即丙烯醛途径)形成的丙烯酰胺而言，其抑制率为60％以上，更佳地为85％～95％。

在另一优选例中，所述的食品选自下组：油炸食品、烘烤食品、膨化食品、食用油、食品加工用油。

在另一优选例中，所述食品中，丙烯酰胺的含量低于200μg/kg。

在另一优选例中，所述的油炸食品为薯条时，所述油炸食品的丙烯酰胺的含量低于200μg/kg。

在另一优选例中，所述的油炸食品为传统中式食品油条时，所述油炸食品的丙烯酰胺的含量低于30μg/kg。

在另一优选例中，所述的食品中，如本发明第一方面所述的脂溶性竹叶抗氧化物的含量为10～150ppm。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

附图1eAOB-o的UPLC指纹图谱；

附图2eAOB-o和OTP对曲奇中丙烯酰胺(AA)形成的抑制作用；

附图3eAOB-o和OTP对曲奇中羧甲基赖氨酸(CML)和羧乙基赖氨酸(CEL)的抑制作用；

附图4eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对棕榈油煎炸稳定性的影响；

附图5eAOB-o和cAOB-o对棕榈油煎炸稳定性的影响；

附图6eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对油炸薯条抗氧化的影响比较；

附图7eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对油条抗氧化作用的影响比较；

附图8eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对薯条丙烯酰胺的抑制作用比较；

附图9eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对油条丙烯酰胺的抑制作用比较；

附图10AOB-w与eAOB-o联合使用对油条和薯条中丙烯酰胺形成的抑制作用。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，通过酶法对水溶性竹叶抗氧化物进行修饰，居然可以选择性地酰化水溶性竹叶抗氧化物的糖羟基，而酚羟基则不发生酰化，从而使得产物在脂溶性改善的同时保持较好的抗氧化性能，且能够同时抑制食品加工过程中丙烯酰胺(特别是丙烯醛途径所产生的丙烯酰胺)的生产。基于上述发现，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“酶法修饰的脂溶性竹叶抗氧化物”和“eAOB-o”可互换使用，均指使用本发明方法(即酶催化酰化)制备得到的脂溶性竹叶抗氧化物。

如本文所用，术语“水溶性竹叶抗氧化物”和“AOB-w”可互换使用，均为使用本发明方法(即酶催化酰化)制备得到的脂溶性竹叶抗氧化物的反应底物。一种优选的水溶性竹叶抗氧化物具有以下特性：黄棕色粉末，含总酚46.53％、异荭草苷2.35％和水分5.87％。

如本文所用，术语“5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮”指具有如下式所示结构的化合物：

术语“C8-C18的脂肪酸”指具有8-18个碳原子的羧酸，如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸，或类似的酸。

术语“C8-C18的酰基”指具有8-18个碳原子的羧酸脱去-OH基团形成的基团，形如所示，其中，R为C7-C17的脂链。

术语“糖基”指葡萄糖的任意一个羟基(-OH)失去氢原子形成的基团。

酶法修饰的脂溶性竹叶抗氧化物

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酶法修饰的脂溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)。所述脂溶性竹叶抗氧化物包括以下特征性成分：对香豆酸、和一种或多种5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物被酰基修饰的产物；其中，所述的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物为取代的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，其中，所述的取代指苯并吡喃环被以下取代：苯并吡喃环的苯环部分上的任意一个氢原子被单糖基所取代，且苯并吡喃环的2位被具有1-3个羟基取代的苯基取代；

其中，所述的酰化修饰指所述黄酮碳苷的糖羟基被C8-C18的脂肪酸供体所修饰；且所述5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物与酰基供体的摩尔比为1:0.5～2，较佳地为1:0.8～1.2。

更佳地，所述的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物包括以下结构化合物中的两种或以上：

本发明提供的eAOB-o的总酚含量≥20％，较佳地为20.1％～28.0％。

本发明提供的eAOB-o的对香豆酸含量≥0.5％，较佳地为0.51％～0.8％。

在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物的外观为淡黄色至黄棕色的粉末、颗粒或片状，略带酯味。

所述的脂溶性竹叶抗氧化物能直接溶于食用油脂、中长链脂肪酸和非极性溶剂中。在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物的乙酸乙酯溶解度≥3g/100mL，较佳地为3.5g/100mL～6.3g/100mL。

本发明的脂溶性竹叶抗氧化物具有显著优于市售同类油脂抗氧化剂产品(迷迭香提取物RE、油溶性茶多酚OTP、羟基茴香醚BHA、2,6-二叔丁基对甲酚BHT等)的抗氧化性和热稳定性，可与合成抗氧化剂特丁基对苯二酚(TBHQ)媲美。具体地，本发明的脂溶性竹叶抗氧化物能够有效地改善油品的抗氧化稳定性和煎炸稳定性，添加本发明的脂溶性竹叶抗氧化物的油品在保护因子(PF)、过氧化值(PV)、硫代巴比妥酸值(TBARS)、酸价(AV)、茴香胺值(p-AnV)、游离脂肪酸(FFA)和极性化合物(PC)含量等参数的水平上均有较大的改善，且改善效果优于现有的油脂抗氧化剂。

本发明的脂溶性竹叶抗氧化物还可同步抑制高温加工过程中美拉德反应伴生危害物丙烯酰胺(AA)和晚期糖基化终末产物(AGEs)的形成，尤为适合于高温用油(如煎炸油、焙烤油、脱膜油等)以及需经热加工处理的高脂食品(如油炸薯类制品和曲奇等)。在另一优选例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物对丙烯酰胺形成的抑制率≥20％，较佳地为≥25％，更佳地为≥27％。

在另一优选例中，本发明所述的脂溶性竹叶抗氧化物可以特别有效地阻断经由油脂氧化过程产生的丙烯酰胺(即丙烯醛途径产生的丙烯酰胺)。

热加工食品中，丙烯酰胺的形成途径主要有以下两条：“天冬酰胺途径”和“丙烯醛途径”。在油炸薯类制品为例，天冬酰胺与还原糖在美拉德反应过程中形成丙烯酰胺(即天冬酰胺途径)是丙烯酰胺产生的主要途径(约贡献最终产品中丙烯酰胺总量的70％～80％)，主要发生在水相中；油脂在高温下氧化分解产生丙烯醛(即丙烯醛途径)，进而形成丙烯酰胺，约占制品丙烯酰胺总量的20～30％，主要发生在油相中。目前，一系列天然来源的酚类化合物，如茶多酚、苹果多酚、竹叶抗氧化物等对于水相中丙烯酰胺的产生均表现出良好的抑制活性(主要通过天冬酰胺途径实现)，但对于油脂中产生的丙烯酰胺却无法有效地抑制。而本发明的脂溶性竹叶抗氧化物eAOB-o对于油相中产生的丙烯酰胺具有很好的抑制效果，在本发明的一些优选实施例中，所述的脂溶性竹叶抗氧化物对丙烯醛途径形成丙烯酰胺的抑制率≥50％，较佳地为≥70％，更佳地为≥80％。在特别优选的实施例中，其抑制率(丙烯醛途径所产生的丙烯酰胺)可达到将近100％。

酶法制备脂溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)的方法

本发明还提供了一种酶法制备eAOB-o的方法。所述方法采用酶法催化，在有机溶剂、离子型溶剂为介质或无溶剂反应体系中，将AOB-w与脂肪酸直接酯化而成。该制备过程可少用或不用有机溶剂，绿色、环保、环境友好。所述方法包括步骤：

在酶的催化下，使水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸反应，进行单羟基酰化，得到脂溶性竹叶抗氧化物；

较佳地，所述的方法包括步骤：在酶催化下，用水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸在40℃～80℃下进行酰化反应，得到脂溶性竹叶抗氧化物。

在另一优选例中，所述步骤的反应时间为4h～48h。

在另一优选例中，所述步骤中，水溶性竹叶提取物与脂肪酸的质量比为1：1～30。

所述方法的收率较高，可以达到40-100％，较佳地为50-100％，更佳地为60-100％。

在一个优选例中，所述制备过程的具体步骤如下：

步骤1：在无溶剂体系、有机溶剂体系或离子型溶剂体系中，在酶的催化下，AOB-w与脂肪酸在40℃～80℃下酰化4h～48h(AOB-w与脂肪酸的质量比为1：1～30)。

步骤2：上述反应结束后，反应液经过滤、浓缩后得到浓缩液(粗品)。

步骤3：将以上获得的浓缩液用乙腈-正庚烷溶液(2:5，v/v)进行萃取，下相经浓缩后再用乙酸乙酯-水(3:5，v/v)萃取，取上相经浓缩、干燥后即得到eAOB-o；也可将步骤2)中获得的浓缩液先用乙酸乙酯-水(3:5，v/v)萃取，上相经浓缩后再用88％～92％的乙醇水溶液-石油醚(2:5，v/v)萃取，取下相浓缩、干燥后即得目标物eAOB-o。

当采用有机溶剂或离子型溶剂体系时，可选C8-C18脂肪酸中的任何一种，即辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸(亚油酸)或硬脂酸；而当采用无溶剂体系时，优选脂肪酸的链长为C8～C12。

反应体系采用的有机溶剂可以是叔戊醇(水饱和叔戊醇)、丙酮、乙酸乙酯、叔丁醇；离子型溶剂为疏水性离子型液体，阳离子为取代基链长不超过8个碳原子的咪唑类，阴离子为BF₄ ^-、PF₆ ^-或TFSI^-。

本发明中的催化用酶可选用南极假丝酵母脂肪酶、枯草杆菌蛋白酶、米黑根毛霉脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶或者为所述几种酶制剂的混合物；优选南极假丝酵母脂肪酶。

作为本发明的脂溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)的制备方法的进一步描述：

步骤1)中所述的有机溶剂为叔戊醇或水饱和叔戊醇、丙酮、乙酸乙酯、叔丁醇等，底物AOB-w与有机溶剂的用量比为1g：25～250mL；

步骤1)中所述的离子型溶剂为疏水性离子型液体，阳离子为取代基链长不超过8个碳原子的咪唑类，阴离子为BF₄ ^-、PF₆ ^-或TFSI^-。

本发明的工艺参数优选如下：

水溶性竹叶抗氧化物(AOB-w)：脂肪酸的质量比为1:5～15，反应时间为6h～24h。

酶法修饰的脂溶性竹叶抗氧化物在食品加工中的应用

本发明提供的eAOB-o能直接溶于食用油脂和/或中、长链脂肪酸，难溶或不溶于水。其中，所述的食用油脂包括(但并不限于)：棕榈油、花生油、玉米油、菜籽油、猪油、牛油、黄油、鱼油、山茶油、山核桃油、亚麻籽油、橄榄油、葵花籽油、紫苏油等。

建议添加量为油品质量分数的0.01-0.05％。也可将eAOB-o以一定比例(质量分数1％～20％)加到中、长链脂肪酸溶液(如辛葵酸甘油酯、月桂酸甘油酯、肉豆蔻酸甘油酯、棕榈酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、油酸甘油酯、亚油酸甘油酯等)中，作为液态制剂使用。

本发明与现有技术相比，其优点在于：本发明的eAOB-o能够直接溶于食用油脂、中长链脂肪酸和非极性溶剂中，表现出良好的抗脂质过氧化性能和热稳定性。采用油脂氧化稳定性测定仪(Rancimat)研究130℃下eAOB-o对棕榈油抗氧化稳定性的影响，结果表明添加0.03％eAOB-o能使棕榈油的使用寿命延长1.83倍，明显优于化学酰化制备的脂溶性竹叶抗氧化物(cAOB-o)。煎炸油稳定性试验证明，eAOB-o在180℃的高温下抗油脂氧化的性能及其热稳定性显著优于市售同类产品(RE、OTP、BHA和BHT)及cAOB-o，可与目前工业界应用最为广泛的合成抗氧化剂特丁基对苯二酚(TBHQ)媲美。将本发明的eAOB-o以一定比例添加于煎炸油中，能够显著降低薯片、薯条、油条中的过氧化物值和硫代巴比妥酸值，并显著降低制品中丙烯酰胺的含量；将本发明的eAOB-o以一定比例添加于曲奇的配方中，在延长产品货架寿命的同时，能显著降低产品中丙烯酰胺(AA)和AGEs(羧甲基赖氨酸CML和羧乙基赖氨酸CEL)的含量；表现出抗脂质氧化和抑制美拉德反应伴生危害物的双重效果。

与现有技术相比，本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的的eAOB-o具有良好的抗脂质过氧化性能和热稳定性，能够直接溶于食用油脂、中长链脂肪酸和非极性溶剂中，采用油脂氧化稳定性测定仪(Rancimat)研究130℃下eAOB-o对棕榈油抗氧化稳定性的影响，结果表明，添加0.03％eAOB-o能使棕榈油的使用寿命延长1.83倍，与化学酰化方法制备的脂溶性竹叶抗氧化物(cAOB-o)相比明显上升。煎炸油稳定性试验证明，eAOB-o在180℃的高温下抗油脂氧化的性能及其热稳定性显著优于市售同类产品(RE、OTP、BHA和BHT)及cAOB-o，可与目前工业界应用最为广泛的合成抗氧化剂特丁基对苯二酚(TBHQ)媲美。

(2)本发明提供的eAOB-o具有优良的亲脂性能，在油脂中具有很好的溶解度，使其能直接添加于油品中，作为油脂抗氧化剂使用。

(3)本发明的eAOB-o还能够在高温加工过程中抑制油脂氧化导致的丙烯酰胺形成，同时显著降低高油、高糖、高蛋白食品中的AGEs含量。

(4)本发明的酶法催化可实现AOB-w中抗氧化活性成分的定向酯化，以特征性成分竹叶碳苷黄酮(荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷)为例，脂肪酸连接的位置主要发生在糖羟基上，而对抗氧化活性具有较大影响的有效酚羟基的数目没有减少，从而在增加eAOB-o的脂溶性的同时不会显著降低其抗氧化活性。同时，糖基虽然发生了修饰，但并不影响糖基与黄酮母核之间的-C＝C-键合，依然保持了碳苷黄酮高的热稳定性和抗酸解、酶解的特性。

(5)本发明的酶法催化与化学酰化法相比，在制备过程、产品性能、环境友好等方面具有前者无可比拟的优势。

(6)本发明的eAOB-o同时拥有突出的抗氧化性、热稳定性和抑制美拉德反应伴生危害物形成的能力，其在食品工业(尤其是需要高温处理的如油炸食品、焙烤食品等)中具有极为广阔的用途。除了能生产出安全、优质、保质期长的放心食品以外，还能显著延长煎炸油的使用寿命，降底生产成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1酶法制备eAOB-o(无溶剂体系)

AOB-w购于杭州尤美特科技有限公司，黄棕色粉末，含总酚46.53％、异荭草苷2.35％和水分5.87％。称取AOB-w1g作为反应底物，加入月桂酸5g，60℃下搅拌均匀，使AOB-w完全溶解于月桂酸中；加入南极假丝酵母脂肪酶用量2.4g(Novozym435，购自诺维信公司，活力约为10000PLU/g)，65℃下催化反应12h。反应结束后，经过滤、减压浓缩，得eAOB-o粗品1.1g；将粗品用100mL乙腈-正庚烷(2:5，v/v)溶液萃取两次，收集下相，回收溶剂后再用100mL乙酸乙酯-水溶液(3:5，v/v)萃取两次，收集上相，减压浓缩至干后即得到0.9g目标物eAOB-o，呈淡黄色粉末，总酚含量21.89％，对香豆酸含量为0.58％，乙酸乙酯溶解度为5.68g/100g。

实施例2酶法制备eAOB-o(有机溶剂体系)

同上称取AOB-w(来源同实施例1，下同)1g作为反应底物，加入100mL叔戊醇(尽可能使原料浸没于叔戊醇中，可采用超声波助溶)，加入肉豆蔻酸8g搅拌均匀，加入米黑根毛霉脂肪酶(RMIM，购自诺维信，活力约为275IUN/g)2.5g，55℃下催化反应30h。反应结束后，经过滤、减压浓缩、得eAOB-o粗品1.1g；用100mL乙酸乙酯-水(3:5，v/v)萃取两次，收集上相，回收溶剂后再用100mL88％乙醇-石油醚(2:5，v/v)萃取两次，收集下相，减压浓缩至干后得到0.7g目标物eAOB-o，呈淡黄色粉末，总酚含量20.87％，对香豆酸含量为0.53％，乙酸乙酯溶解度为5.25g/100g。

实施例3酶法制备eAOB-o(有机溶剂体系)

同上称取AOB-w1g作为反应底物，加入100mL丙酮(尽可能使原料浸没于丙酮中，可采用超声波助溶)，加入棕榈酸15g，45℃下经疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶1.8g(TLIM，购自诺维信，活力约为250IUN/g)催化反应15h。反应结束后，经过滤、旋转、浓缩收集eAOB-o粗品1.0g。用125mL乙腈-正庚烷(2:5，v/v)萃取粗品两次，收集下相，浓缩至干后用125mL乙酸乙酯-水溶液(3:5，v/v)萃取两次，收集上相，浓缩至干后得到精制后的0.7g目标物eAOB-o,呈淡黄色粉末，总酚含量20.45％，对香豆酸含量为0.55％，乙酸乙酯溶解度为4.82g/100g。

实施例4酶法制备eAOB-o(离子型溶剂体系)

同上称取AOB-w1g作为反应底物，加入月桂酸25g，60℃下搅拌均匀，使AOB-w完全溶解于100mL1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[Bmim][PF₆]中；加入南极假丝酵母脂肪酶用量2.0g(Novozym435，购自诺维信公司，活力约为10000PLU/g)，65℃下催化反应6h。反应结束后，经过滤、减压浓缩，得eAOB-o粗品1.2g；将粗品用100mL乙腈-正庚烷溶液(2:5，v/v)萃取两次，收集下相，回收溶剂后再用100mL乙酸乙酯-水溶液(3:5，v/v)萃取两次，收集上相，减压浓缩至干后即得到0.8g目标物eAOB-o，呈黄色粉末，总酚含量20.13％，对香豆酸含量为0.56％，乙酸乙酯溶解度为4.97g/100g。

实施例5eAOB-o中对香豆酸含量测定及UPLC指纹图谱分析

(1)对香豆酸含量测定

eAOB-o试样经甲醇溶解，以乙腈-1％乙酸水溶液为流动相，用以C18为填料的液相色谱柱(LunaC18ODS柱，柱长250mm，内径4.6mm，内装C18填充物，粒径5μm或是相当者)和紫外检测器或二极管阵列检测器，对试样中的对香豆酸进行反相高效液相色谱分离和测定，与标准品保留时间比较定性，峰面积外标法定量。

标准储备液的配置：准确称取对香豆酸标准品10mg(精确至0.0001g)，用甲醇溶解并定容至10mL，混匀，置冰箱中保存。此溶液1mL含对香豆酸1.0mg。

准确吸取一定量的对香豆酸标准溶液，分别稀释8、10、16、32、64、128和256倍，分别进样10μL，在下述规定色谱条件下，进行色谱分析，根据对香豆酸标准溶液的不同进样量及相应谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标、对香豆酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

色谱柱：LunaC18ODS柱，柱长250mm，内径4.6mm，内装C18填充物，粒径5μm或是相当者。

参考色谱条件如下：

检测波长：330nm。柱温：40℃。流动相：A.乙腈；B.1％乙酸水溶液(v/v)。梯度洗脱条件：0～15min时，A15％，B85％；15～25min时，A15％～40％，B85％～0％；25～34min时，A40％，B60％；34～40min时，A40％～15％，B60％～85％。流量：1.0mL/min。进样量：10μL。

样品检测：准确称取eAOB-o试样100mg(精确至0.0001g)，用甲醇溶液溶解并定容至100mL，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，即得试样溶液。准确吸取试样溶液10μL，在规定色谱条件下，进行色谱分析，以保留时间定性，峰面积外标法定量。

对香豆酸含量以w₁表示，其数值以％表示，按下式计算：

$w_1=\frac{c_1{V}_1}{m_1}\×100\%$

式中：

w₁——试样中对香豆酸的含量，％；

c₁——依据标准曲线计算出的被测液中的对香豆酸浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

V₁——供试样定容体积，单位为毫升(mL)；

m₁——供试样取样量，单位为毫克(mg)。

测定结果表明实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备的eAOB-o中对香豆酸含量分别为0.58％、0.53％、0.55％和0.56％。

(2)UPLC指纹图谱分析

eAOB-o试样用甲醇(色谱纯)溶解，以乙腈(色谱纯)-1％乙酸(优级纯)水溶液为流动相，用以C18为填料的超高效液相色谱柱和紫外检测器或二级管阵列检测器分析eAOB-o试样的指纹图谱。

色谱柱：ACQUITYUPLCHSST3柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.8μm或是相当者。

参考色谱条件如下：

检测波长：260nm。柱温：40℃。流动相：A.乙腈；B.1％乙酸水溶液(v/v)。梯度洗脱条件如下：0～13min，12％A；13min～16min，12％A～40％A；16min～19min，40％A；19min～21min，40％A～12％A。流速：0.28mL/min。进样量：2μL。

称取实施例1制备的eAOB-o样品2.55mg，用甲醇(色谱纯)溶解并定容至5mL，经微孔滤膜(0.22μm)过滤，即得试样溶液。准确吸取试样溶液1μL，在上述色谱条件下，进行色谱分析。

分析结果见附图1。

实施例2、实施例3和实施例4所得的eAOB-o试样经分析测试，所得UPLC的指纹图谱与实施例1所得的eAOB-o一致。

实施例6食品试样中丙烯酰胺(AA)和AGEs(CML和CEL)含量测定

(1)丙烯酰胺的测定

样品预处理：称取(1.00±0.01)g曲奇粉末或面团于50mL离心管中，加入20μL¹³C₃-AA内标(30ng/μL)，混合均匀。向样品中加入10mL甲酸水溶液(10mmol/L)，振荡3min后，在0℃下，于13,000rpm离心5min。取出离心管，弃去浮在样品表面的油脂层，收集澄清液。再向样品中加入5mL甲酸水溶液(10mmol/L)，按以上提取步骤重复操作2次。将三次得到的上清液(约20mL)合并，漩涡振荡2min。充分混匀后，准确量取2mL上清液，利用事先平衡好的OasisMCX固相萃取柱净化。前8滴提取液弃去，收集剩余提取液，将收集到的提取液用超纯水，定容至2mL，充分混匀后通过0.22μm微孔滤膜，滤液供UPLC-MS/MS测定。

色谱条件：色谱柱采用PhenomenexSynergiMAX-RP柱(150×2.0mm,4μm)。流动相A为10mmol/L甲酸水溶液，流动相B为乙腈，V(A):V(B)＝90:10，等梯度洗脱。流速：0.3mL/min；进样量：2.0μL；柱温：40℃；样品室温度：10℃。

质谱条件：电喷雾正离子(electrosprayionizationpositive，ESI⁺)模式。毛细管电压：3.5kV；干燥气温度：200℃；干燥气流速：16L/min；雾化气压力：45psi；鞘气温度：380℃；鞘气流速：12L/min。监测方式：MRM模式。AA：72>55(碰撞能量8eV)；d₄-AA：75>58(碰撞能量9eV)。

定量分析：以标样浓度/内标浓度为横坐标，标样峰面积/内标峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求曲线线性回归方程，线性范围为2～200ng/mL(2、5、10、20、50、100和200ng/mL)，相关系数在0.9994～0.9999之间。

(2)CML和CEL的同步测定

样品预处理：称取(1.00±0.01)g曲奇粉末样品或面团，于50mL离心管中，加入5mL正己烷，剧烈振荡3min后，于13,000rpm离心5min，弃去溶剂，重复以上步骤2次。经15mL正己烷脱脂3次(5+5+5mL)后，将样品用氮气吹干至粉末状。向样品中加入10mLNa₂B₄O₇缓冲液(0.2mol/L，pH9.2)和5mLNaBH₄(1mol/L，以0.1mol/LNaOH配制)，于4℃还原过夜(约8h)。接着，加入10mL氯仿/甲醇(2:1，v/v)，于13,000rpm离心10min后，弃去上清液；向得到的沉淀物中加入20mLHCl(6mol/L)，置于110℃烘箱中，水解24h。水解完成后，将水解样品取出并冷却至室温(25℃)，用超纯水定容至50mL，然后用定性滤纸过滤并收集滤液。准确量取1mL滤液，加入0.8μg/mLd₄-CML和0.8μg/mLd₄-CEL内标各200μL，充分混匀后利用事先平衡好的C18固相萃取柱净化，供UPLC-MS/MS测定。

色谱条件：色谱柱采用WatersAcquityUPLCTMBEHC18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)。流动相A为5mmol/L九氟戊酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度见附表1。流速：0.2mL/min；进样量：7.5μL，柱温：50℃。

表1流动相梯度

质谱条件：ESI⁺模式。毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：20eV；离子源温度：130℃；脱溶剂温度：400℃。监测方式：MRM模式。CML：205>84(碰撞能量16eV)；d₄-CML：209>88(碰撞能量18eV)；CEL：219>84(碰撞能量16eV)；d₄-CEL：223>88(碰撞能量18eV)。

定量分析：以标样浓度/内标浓度为横坐标，标样峰面积/内标峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求曲线线性回归方程，线性范围为3～300ng/mL(3、10、50、100、150、200和300ng/mL)，相关系数在0.9997～0.9998之间。

实施例7eAOB-o对曲奇中AA和CML、CEL的同步抑制作用

曲奇的制作参照美国谷物化学法协会AACC10-54的推荐方法，基础配方如附表2所示。按照0.1g/kg、0.2g/kg、0.3g/kg、0.4g/kg和0.5g/kg(以面团为基数)的添加剂量将eAOB-o(实施例1制备的试样，下同)和OTP(购自杭州普丽美地生物科技有限公司，儿茶素含量≥20％)溶解后加入配方面团中。空白对照组为不添加抗氧化剂组。面团用模具制成直径5cm、厚度3mm的曲奇坯后，在205℃下焙烤11min。焙烤后的曲奇在室温(25℃)下冷却30min后备用，采用UPLC-MS/MS测定丙烯酰胺(AA)，并同步测定AGEs化合物羧甲基赖氨酸(CML)和羧乙基赖氨酸(CEL)。

表2曲奇的基础配方

结果表明，在上述五个不同添加剂量下，eAOB-o对AA的抑制率分别为15.98％、36.32％、53.87％、48.01％和35.65％，OTP对AA的抑制率分别为37.67％、42.86％、52.23％、45.56％和45.31％(见附图2)。

eAOB-o和OTP对曲奇焙烤过程中CML和CEL形成的抑制作用如附图3所示。无抗氧化剂的空白对照组中测得CML和CEL含量分别为79.58±1.93mg/kg和11.97±0.26mg/kg。在上述五个不同添加剂量下，eAOB-o对CML的抑制率分别为36.83％、53.72％、65.42％、43.13％和25.96％，对CEL的抑制率分别为34.71％、56.74％、69.00％、31.61％和13.83％；相比较而言，OTP对CML的抑制率分别为17.69％、21.77％、31.03％、27.73％和23.70％，对CEL的抑制率分别为11.70％、16.24％、29.32％、14.95％和7.29。以上结果显示，在相同添加水平下，eAOB-o对焙烤曲奇中CML和CEL的抑制作用均显著优于OTP(p<0.05)。

实施例8不同制备方法获得的AOB-o对棕榈油氧化稳定性的影响

称取20g不含外加抗氧化剂的棕榈油，分别按质量分数0、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％添加量加入eAOB-o试样，同时与化学法制备得到的脂溶性竹叶抗氧化物(cAOB-o，自制，总酚含量≥20％，专利公开号CN103005007A)进行比较，超声波处理10min助溶。称取3g左右添加抗氧化剂后的油品，用油脂氧化酸败仪(Rancimat)比较在130℃下eAOB-o和cAOB-o对棕榈油抗氧化性能的影响，空气流速设定为20L/h，测试按照GB/T21121-2007规定的方法进行，通过保护因子(PF)的大小比较eAOB-o和cAOB-o抗氧化性能的差异。PF的计算公式如下：

试验结果如附表3所示，eAOB-o在0.01％～0.05％的添加剂量范围内，均能显著增强棕榈油的抗氧化稳定性。在同等添加浓度下(0.01％～0.05％五个剂量水平)，eAOB-o对棕榈油抗氧化稳定性增强的效果均极显著优于cAOB-o(p<0.01)。

附表3eAOB-o及cAOB-o对棕榈油抗氧化稳定性的影响

实施例9eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对棕榈油煎炸稳定性的影响比较

分别配置1kg分别含0.02％添加量的eAOB-o、RE(购自广州方道食品添加剂有限公司，鼠尾草酸≥20％，下同)、OTP(购自杭州普丽美地生物科技有限公司，儿茶素含量≥20％，下同)、BHT(食品级，购自上海津颂食品有限公司，有效含量≥99％，下同)、BHA(食品级，购自上海驰为食品配料实业有限公司，有效含量≥99％，下同)和TBHQ(食品级，购自东莞广益食品添加剂实业有限公司，有效含量≥99％，下同)的棕榈油试样，于180℃下持续加热36h，每隔6h取样一次，分别测定油品的过氧化值(PV)、硫代巴比妥酸值(TBARS)、酸价(AV)、茴香胺值(p-AnV)、游离脂肪酸(FFA)和极性化合物(PC)含量，并以不加任何抗氧化剂的纯棕榈油做空白对照。结果表明(见附图4)，0.02％的eAOB-o对棕榈油煎炸稳定性的改善明显优于同等剂量的BHT、BHA和OTP；180℃下持续加热36h后，0.02％eAOB-o与0.02％RE对油品过氧化值和茴香胺值的影响虽无明显差异，但eAOB-o表现出能显著降低油品的硫代巴比妥酸值(TBARS)、酸价(AV)和游离脂肪酸(FFA)含量。

实施例10eAOB-o与cAOB-o对棕榈油煎炸稳定性影响的比较

分别配置1kg含0.02％eAOB-o和0.02％cAOB-o的棕榈油(自制，总酚含量≥20％，专利公开号CN103005007A)，于180℃下持续加热36h，每隔6h取样一次，分别测定油品的过氧化值(PV)、硫代巴比妥酸值(TBARS)、酸价(AV)、茴香胺值(p-AnV)、游离脂肪酸(FFA)和极性化合物(PC)含量，同时以不加任何抗氧化剂的纯棕榈油做空白对照。结果如附图5所示，eAOB-o的各项指标均优于cAOB-o。

实施例11eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对油炸马铃薯制品中油脂抗氧化性能的影响

分别取3kg纯棕榈油(不含外加抗氧化剂)，添加质量分数为0.02％的eAOB-o和OTP、RE和TBHQ，分别于(180±2)℃下用来煎炸薯条(市售冷冻薯条)。每批薯条用量为200g，煎炸时间为45s。待薯条冷却后粉碎，用一定量的石油醚(沸程30-60℃)浸没12h提取薯条中的脂质，测定其过氧化值(PV)和硫代巴比妥酸(TBARS)值。从附图6可以看出，较目前常用的油脂抗氧化剂而言，eAOB-o能更为有效地控制油炸薯条的PV值；从TBARS测定结果可以看出，与空白对照和OTP组相比，eAOB-o降低薯条中脂质氧化产物丙二醛(MDA)含量的作用也更为显著。

实施例12eAOB-o与常用油脂抗氧化剂对油条油脂抗氧化的影响

分别称取3kg纯棕榈油，添加质量分数0.01％的eAOB-o、OTP、RE和TBHQ，于180℃下炸制油条，每批加入油条胚为400g、煎炸110s。待油条冷却后粉碎，用一定量的石油醚(30-60℃)浸没12h提取油条中的脂质，测定PV值和TBARS值。从附图7可见，较目前常用的天然油脂抗氧化剂(OTP和RE)而言，eAOB-o的抗氧化作用更为显著，TBARS值低于TBHQ。

实施例13eAOB-o对油炸马铃薯制品中丙烯酰胺含量的影响

分别取3kg纯棕榈油，添加质量分数为0.02％的eAOB-o、OTP、RE和TBHQ试样，于180℃下炸制薯条；每批薯条用量为100g，煎炸45s。待薯条冷却后处理，测定样品中的丙烯酰胺含量，并与空白对照相比计算抑制率。从附图8可见，添加0.02％eAOB-o后对油炸薯条丙烯酰胺形成的抑制率可达29.8％，显著高于其他常用抗氧化剂(OTP为12.2％，TBHQ9.7％和RE8.4％),几乎完全阻断了丙烯醛途径导致的丙烯酰胺形成。

实施例14eAOB-o对油条丙烯酰胺形成的抑制

分别称取3kg纯棕榈油，添加质量分数0.01％的eAOB-o、OTP、RE和TBHQ，于180℃下炸制油条，每批加入油条胚为200g、煎炸110s。待油条冷却后，测定油条样品中的丙烯酰胺值，计算丙烯酰胺生成抑制率。从附图9可以看出，添加0.01％eAOB-o后对油炸薯条中丙烯酰胺生成的抑制率可以达到23.1％，亦显著高于其他常用油脂抗氧化剂(OTP14.5％，TBHQ8.3％和RE9.2％)。

实施例15eAOB-o和AOB-w组合抑制油炸薯条和油条中丙烯酰胺形成

AOB-w处理(在水相中添加)：采用0.1％AOB-w溶液浸泡薯条；用含0.05％AOB-w(以干基计)的面团制作油条，醒发后待用。

eAOB-o处理(在油相中添加)：薯条样品处理同实施例12；油条样品处理同实施例13。

待薯条和油条样品冷却后，测定样品中的丙烯酰胺值，计算丙烯酰胺生成抑制率。从附图10可以看出，水溶性竹叶抗氧化物(AOB-w)和油溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)的协同作用，最大程度地阻断了油炸薯条和油条中丙烯酰胺的形成，抑制率均在90％以上。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种脂溶性竹叶抗氧化物(eAOB-o)，其特征在于，所述脂溶性竹叶抗氧化物包括以下特征性成分：对香豆酸、和一种或多种5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物被酰基修饰的产物；其中，所述的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物为取代的5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮；

所述的取代指苯并吡喃环被以下取代：苯并吡喃环的苯环部分上的任意一个氢原子被一个糖基所取代，且苯并吡喃环的2位被具有1-3个羟基取代基的苯基取代；

其中，所述的酰基修饰指所述糖基上的羟基被C8-C18的酰基修饰基所修饰；且所述5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物与酰基修饰基的摩尔比为1:0.5-2。

2.如权利要求1所述的脂溶性竹叶抗氧化物，其特征在于，所述5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物被酰基修饰的产物选自下组：A.1、A.2、A.3、A.4、B.1、B.2、B.3、B.4、C.1、C.2、C.3、C.4；

其中，所示的R基团是C8-C18的酰基。

3.如权利要求1所述的脂溶性竹叶抗氧化物，其特征在于，所述的脂溶性竹叶抗氧化物是通过以下方法制备的：

在酶催化下，使水溶性竹叶抗氧化物(AOB-w)与C8-C18的脂肪酸反应，进行单羟基酰化，得到脂溶性竹叶抗氧化物；

较佳地，所述的方法包括步骤：在酶催化下，用水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸在40℃～80℃下进行酰化反应，得到脂溶性竹叶抗氧化物。

4.一种脂溶性竹叶抗氧化物的制备方法，其特征在于，包括步骤：在酶催化下，使水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸反应，进行单羟基酰化，得到脂溶性竹叶抗氧化物；

较佳地，所述的方法包括步骤：在酶催化下，用水溶性竹叶抗氧化物与C8-C18的脂肪酸在40℃～80℃下进行酰化反应，得到脂溶性竹叶抗氧化物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤在无溶剂条件下进行，或所述的步骤在有机溶剂或离子型溶剂中进行；

较佳地，所述的有机溶剂选自下组：叔戊醇(优选为水饱和叔戊醇)、丙酮、乙酸乙酯、叔丁醇，或其组合；

所述的离子型溶剂为阳离子和阴离子组成的盐，其中，所述的阳离子为未取代或被C1-C8的烷基取代的咪唑，且所述的阴离子选自下组：BF₄ ^-、PF₆ ^-、TFSI^-，或其组合。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的酶选自下组：南极假丝酵母脂肪酶、枯草杆菌蛋白酶、米黑根毛霉脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，或其组合；优选南极假丝酵母脂肪酶；和/或

所述的C8-C18的脂肪酸选自下组：辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸，或其组合。

7.一种食品添加剂，其特征在于，所述的食品添加剂含有如权利要求1-3任一所述的脂溶性竹叶抗氧化物，和任选的食品上可接受的载体。

8.一种如权利要求1-3任一所述的脂溶性竹叶抗氧化物的用途，其特征在于，用于选自下组的一种或多种用途：

(a)作为高温食品加工的抗氧化剂；

(b)作为高温食品加工的丙烯酰胺抑制剂；

(c)用于制备高温食品加工的抗氧化剂；

(d)用于制备高温食品加工的丙烯酰胺抑制剂；

(e)在高温食品加工工艺中用于抑制丙烯酰胺和/或晚期糖基化终末产物的生成；

(f)作为油脂抗氧化剂。

9.一种食品加工方法，其特征在于，包括步骤：在加工过程之前、之中或之后，在食品原料中添加如权利要求1-3任一所述的脂溶性竹叶抗氧化物，或添加如权利要求7所述的食品添加剂。

10.一种食品，其特征在于，所述的食品在加工过程中添加如权利要求1-3任一所述的脂溶性竹叶抗氧化物或含有如权利要求1-3任一所述的脂溶性竹叶抗氧化物的食品组分。