CN105073774A

CN105073774A - 一种棉花亮氨酸拉链蛋白bZIP-2及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105073774A
Application number: CN201380074528.7A
Authority: CN
Inventors: 陈文华; 孙超; 崔洪志
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2033-04-19
Also published as: CN105073774B; WO2014169471A1

Abstract

本发明提供了一种来源于棉花的亮氨酸拉链蛋白bZIP-2及其编码基因，以及所述基因在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

种棉花亮氨酸拉链蛋白 bZIP-2及其编码基因与应用技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的亮氨酸拉链蛋白 bZIP-2及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。背景技术温度、盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害，导致作物产量降低，品质下降，严重威胁农业生产和自然环境。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计, 世界干旱、半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、半干旱地区约占国土面积的 52%, 年受旱面积达 200— 270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米，因缺水而少收粮食 350— 400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状，利用常规育种方法改良作物的抗旱性受到周期长、优质种质资源缺乏的限制。近年来的转录组学、蛋白组学和基因表达调控的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。目前，利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力,已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。

植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应，以降低或消除逆境胁迫给植物带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径及多基因产物的复杂过程。但就目前的研究状况 ^言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境的生物化学和生理学响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将为植物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE (cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆了棉花的一个亮氨酸拉链蛋白（本文命名为 bZIP-2)的编码基因，并测定了其 DNA 序列。并且发现将其导入受体植物并超量表达后，可显著改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个亮氨酸拉链蛋 bZIP-2 的编码基因（本文命名为 GhbZIP-2) ，其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，优选地，所述表达载体是 PCAMBIA2300;并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-G )Z/P-2-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐早性以及用于植物育种的用途; 优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。附图说明图 1是 G )Z/P-2基因的植物表达载体 C35S-G )Z/P-2-2300;>的构建流程（图 la-lb )。图 2是 GhbZIP-2基因的植物表达载体 (35S-GMZ/P-2-2300)的质粒图。

图 3是 GhbZIP-2基因的 T2代转基因拟南芥植株（图中， T2E3 ; T2E5 )和作为对照的非转基因拟南芥植株（图中， CK1、 CK2 ) 的耐旱模拟实验结果。（图 3a为正常生长 20天的拟南芥植株；图 3b为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。

图 4是利用反转录 PCR对 T2代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中

GhbZIP-2基因在转录水平上的分子检测验证结果。 M为 DNA Ladder Marker

( DL2000,TakaRa) ， 1-4为非转基因的对照拟南芥植株， 5-8为耐旱效果不显著的转基因拟南芥 T2代植株， 9-16为耐旱效果显著的转基因拟南芥 Τ2代植株（依次为株系： Τ2ΕΚ Τ2Ε2 Τ2Ε3 Τ2Ε4 Τ2Ε5 Τ2Ε6 、 Τ2Ε7 Τ2Ε8) 具体实施方式下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。实施例 1、干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

按照 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建 SSH文库（差减文库）。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为样本（Tester mRNA), 以未处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA作为对照（Driver mRNA)。具体歩骤如下：

(1) 供试材料：

冀棉 14 (国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-30270) 播种到灭过菌的蛭石上，在 25°C、光周期 16h光照 /8 h黑暗（光强 2000— 3000 Lx) 条件下培养，每周浇 1/2MS液体培养基（含 9.39mMKN0₃， 0.625 mM KH₂P0₄， 10.3 mMNH₄N0₃, 0.75 mMMgSO₄， 1.5 mMCaCl₂， 50 μΜΚΙ, 100 μΜΗ₃ΒΟ₃， 100 μΜ MnS0₄， 30 μΜ ZnS0₄, 1 μΜΝα₂Μο0₄, 0.1 μΜ CoCl₂, 100 μΜ Na₂EDTA, 100 μΜ FeS0₄) 一次。当苗株高达 25-30 cm时用于实验。

(2) 材料处理：

将上述供试幼苗分为 2组，每组 4盆，每盆 1株。第一组为对照组，在 25°C、光周期 16h光照 /8h黑暗条件下培养，止常浇灌。第二组为干旱处理组， 25°C、光周期 16h光照 /8h黑暗条件下培养，停止浇灌，处理 10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。

(3) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片各 0.5 g，用植物 RNA提取试剂盒（购自 Invitrogen)提取棉花叶片的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为 1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高；用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18 S条带的 2倍，表明 RN A的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA 纯化试剂盒 (purification of poly A+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR- select™ cDN A Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA, 再以 2 Tester cDNA和 2 g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1.5 h，然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次差减杂交的产物混合，再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，然后通过两次抑制性 PCR 扩增差异表达的片段，使其得到富集。

为了增加获得表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST) (Unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区，除 Rsal酶以外，本实验同时用内切酶 Haelll 按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次抑制性 PCR扩增，最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物。

( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的产品说明书所示方法，将上述合并的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接，其具体步骤如下：向 200 μΐ PCR管中依次加入下列成分：纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物 3 μ1, 2χΤ4 DNA连接酶缓冲液 5 μ1， pGEM-T Easy载体 1 μ1， T4 DNA连接酶 1 μΐ ，于 4°C连接过夜。取 10 μ 连接反应产物，加入到 100 μ 感受态大肠杆菌 JM109 (购自 TAKARA) 中并混匀，冰浴 30 min、42°C热休克 60 s、冰浴 2 min,另加 250 μL L 培养液（含 1% Tryptone 购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药）后置于 37°C摇床中，以 225 r/min振荡培养 30 min,所得菌液即为差减文库菌液。加甘油至终浓度 20% (V/V) , 于 -80°C保存备用。

取 200 所述差减文库菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素（购自北京拜尔迪）、 40 g/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷）、 24 g/mL IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）（X-gal和 IPTG均购自 TAKARA) 的 LB (同上）固体培养平板上， 37°C培育 18 h。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 198个白色菌落 (编号： Gh-B001至 Gh-B198)。将所有白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 -80°C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增验证，得到 190个阳性克隆，然后将所有阳性克隆在送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

( 6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后，共得到 135 条 EST(Unigene；)。经分析有 21个重叠群，有 114个单一的序列。经 BlastN发现其中 48条 EST(Unigene)在 GenBank 中有同源序列， 32条 EST功能未知或者为假定蛋白，另有 34 条未获得同源匹配，推测可能是处于 3'或 5'末端非翻译区的较短序列。实施例 2 棉花亮氨酸拉链蛋白编码基因 GhbZIP-2的克隆

将编号为 Gh-B33的阳性克隆的测序结果去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No: 3，序列分析表明该序列编码的蛋白质属于亮氨酸拉链蛋白，本文将 SEQ ID No: 3对应的全长编码基因命名为 GhbZIP-2，其对应的蛋白命名为 bZIP-2。

SEQ ID No: 3

1 CAATTTGGGT TGTCACCTAC CCCATCTATT GGTACGTTAT CGGATACACC TATGACGGGA

61 CGGAAAAGAG ATGCTCAAGA TGCATTTGAG AAGAG A CG AGAGGAGGTT AAGGAGAAAG

12 1 A CAAGAACA GGGAATCTGC TGCACGATCA CGAGCTAGGA AGCAGGCTTA CCACAATGAG

18 1 CTGGTTAACA AGGTTTCACG A AGAAGAG GATAATCTAA AGCTCAAAAG AGAGAAGGAA

24 1 TTTGATACAA AATCTCAGTG TGAAACA CT GAAACAAGGT ATCAGCTTAG AAGAACAAGT

3 0 1 TCCGCCTCTT TTTAACTCGT GTTTTCCGCT GTTTTAAGCT CTCTAGTTGG CTTGTTGACA

36 1 GAGCTTCGTT GTGAATTCGT TCCAAGGGTT TGGCATTCTG TACATTTATG ATTATCATGT

42 1 GTTGGTTTTT ACCTTCCTCT GCAAAACTGC CATGTTTATA TGTGTTAGGT TTATATTTAT

4 8 1 TCGGCTGAAC GACAAGTAAA TCGGTGTTGA TTAGGCTATA ATCCTACCTT TAAAGTAGAA

54 1 AAAGCTTGGG GAAAAAGAAA TGTTGTGCAA ACATTGACTG TGGGAATGCA ATAATATTTG

60 1 CTTTAAACCC TGCATAATGA

GhbZIP-2全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列分析发现 SEQ ID No: 3 为编码基因 GhbZIP-2 的 3端序列。根据已经获得的 SEQ ID NO: 3序列，设计如下三条特异性引物，作为反转录引物及 5 'RACE的 3 '端特异性引物。

GhB33 GSP1 : SEQ ID NO: 4：

ATCGTGAAACCTTGTTAACCAG

GhB33 GSP2 : SEQ ID NO: 5：

CTCATTGTGGTAAGCCTGCTTC

GhB33GSP3 : SEQ ID NO:6:

CAATTTGGGTTGTCACCTACC

试剂盒自带通用引物：

AAP: SEQ ID NO: 7：

GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG AUAP : SEQ ID NO: 8：

GGCCACGCGTCGACTAGTAC 实验步骤按试剂盒说明书操作（5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

以 GhB33 GSP1(SEQ ID NO: 4)为反转录引物，以棉花 mRNA为模板进行反转录，获得 cDNA模板，然后按照上述 5' RACE试剂盒说明书中的步骤加 Poly C尾，以加尾后的产物为模板进行第一轮 PCR扩增，所用引物为 SEQ ID NO: 4与通用引物 SEQ ID NO: 7 (试剂盒自带， I 为次黄嘌吟修饰的 a、 c、 g或 t)，具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ mRNA反转录并加 Poly C尾后的 cDNA、 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4 禾口 SEQ ID NO: 7各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33 个循环（ 94 变性 30 s， 57°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin)， 72 °C 延伸 10 min。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 5与通用引物 SEQ ID NO: 8进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ稀释的第一轮

PCR产物、 1.0 l Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（ 94 变性 45 s， 57 °C 退火 45 s， 72V 延伸 1 min)， 72 °C 延伸 10 min。回收第二轮 PCR产物中约为 800 bp 大小的条带（ Gel Extraction Kit购自 OMEGA)，并将其连接到 pGEM-T Easy载体，然后转化到大肠杆菌 JM109 感受态细胞中（具体方法同上)，并将转化后的菌液涂布于含 50 μ_§/ηΛ氨苄青霉素的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 5与 3'端引物 SEQ ID NO: 6进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆（Gh27-2、 Gh27-3和 Gh27-5 ) ，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，获得该基因的 cDNA的一段 5'端序列。

将所得的 5'RACE产物中阳性克隆 Gh27-3测序获得序列为 SEQ ID NO: 9：

1 GGGGGGGGGG ATGGGGATTC AAACTATGGG ATCCCAAAGC AATGGACAAC AGTCTCTTTT

61 ACAGCCATCT CCATTGGTGA GGCAGAATTC ATGGTATAGT CTTACTCTTA A GAAGTTGA

12 1 AAACCAATTA GGGAACTTGG GGAAGCCTTT AGGTAGTATG AACCTTGATG AGCTTCTTGA

18 1 TAATGTATGG AGTACCGAGT TGAATCCGCC GTTAGGGATG AATAATTCCG AAAGCATTTC

24 1 GTCATCTTCT TCATCTCTTC AACGTCAAGC TAGCTTAACC TTGGCTAGAG CTTTGAGTGG

3 0 1 TAAGACGGTA GATCAAGTGT GGAGTGAGAT ACAACAAGGT CAAAAGAGGA GGAACGGTGA

36 1 GGGGATGAAG GA CAAGAAA GAGAAGCAAA GCTTGGCGAA ACCACATTGG AGGATTTTTT

42 1 GGTACAAGCA GGGCTTTTTG TTGCTGAAAC ATCGTTGGAT CCTACAATGG AATTTGATAA

4 8 1 TACCCGTCAG CAAAGTTTGC CACACCAATT CAGATTGTCA CCTACACCAT CTATTGGTAC

54 1 ATTATCGGAT ACACCTATGA CGGGGCAGAA ACGAGATGTA TTTGAGAAGA GTATTGAGAG

60 1 TTTGCCACAG CAATTTGGGT TGTCACCTAC CCCATCTATT GGTACGTTAT CGGATACACC

66 1 TATGACGGGA CGGAAAAGAG ATGCTCAAGA TGCATTTGAG AAGAGTATCG AGAGGAGGTT

72 1 AAGGAGAAAG A CAAGAACA GGGAATCTGC TGCACGATCA CGAGCTAGGA AGCAGGCTTA

78 1 CCACAATGAG

将 5 'RACE获得的序列 SEQ ID NO: 9，与上述获得的序列 SEQ ID NO: 3拼接，获得

SEQ ID NO: 10：

1 GGGGGGGGGG ATGGGGATTC AAACTATGGG ATCCCAAAGC AATGGACAAC AGTCTCTTTT

61 ACAGCCATCT CCATTGGTGA GGCAGAATTC ATGGTATAGT CTTACTCTTA ATGAAGTTGA

12 1 AAACCAATTA GGGAACTTGG GGAAGCCTTT AGGTAGTATG AACCTTGATG AGCTTCTTGA

18 1 TAATGTATGG AGTACCGAGT TGAATCCGCC GTTAGGGATG AATAATTCCG AAAGCATTTC

24 1 GTCATCTTCT TCATCTCTTC AACGTCAAGC TAGCTTAACC TTGGCTAGAG CTTTGAGTGG

3 0 1 TAAGACGGTA GATCAAGTGT GGAGTGAGAT ACAACAAGGT CAAAAGAGGA GGAACGGTGA

36 1 GGGGATGAAG GATCAAGAAA GAGAAGCAAA GCTTGGCGAA ACCACATTGG AGGATTTTTT

42 1 GGTACAAGCA GGGCTTTTTG TTGCTGAAAC ATCGTTGGAT CCTACAATGG AATTTGATAA

4 8 1 TACCCGTCAG CAAAGTTTGC CACACCAATT CAGATTGTCA CCTACACCAT CTATTGGTAC

54 1 ATTATCGGAT ACACCTATGA CGGGGCAGAA ACGAGATGTA TTTGAGAAGA GTATTGAGAG

60 1 TTTGCCACAG CAATTTGGGT TGTCACCTAC CCCATCTATT GGTACGTTAT CGGATACACC

66 1 TATGACGGGA CGGAAAAGAG ATGCTCAAGA TGCATTTGAG AAGAGTATCG AGAGGAGGTT

72 1 AAGGAGAAAG A CAAGAACA GGGAATCTGC TGCACGATCA CGAGCTAGGA AGCAGGCTTA

78 1 CCACAATGAG CTGGTTAACA AGGTTTCACG ATTAGAAGAG GATAATCTAA AGC CAAAAG

84 1 AGAGAAGGAA TTTGATACAA AATCTCAGTG TGAAACA CT GAAACAAGGT ATCAGCTTAG 90 1 AAGAACAAG TCCGCCTCTT TTTAACTCGT GTTTTCCGCT GTTTTAAGCT CTCTAGTTGG

96 1 CTTGTTGACA GAGCTTCGTT GTGAATTCGT TCCAAGGGTT TGGCATTCTG TACATTTATG

1021 ATTATCATGT GTTGGTTTTT ACCTTCCTCT GCAAAACTGC CATGTTTATA TGTGTTAGGT

10 81 TTATATTTAT TCGGCTGAAC GACAAGTAAA TCGGTGTTGA TTAGGCTATA ATCCTACCTT

1141 TAAAGTAGAA AAAGCTTGGG GAAAAAGAAA TGTTGTGCAA ACATTGACTG TGGGAATGCA

12 01 ATAATATTTG CTTTAAACCC TGCATAATGA 根据 SEQ ID NO: 10序列设计一对引物如下：

GhbZIP-2F： SEQ ID NO: 11：

ATGGGGATTCAAACTATGGG

GhbZIP-2R_: SEQ ID NO: 12：

TTAAAAAGAGGCGGAACTTGTTC AP: SEQ ID NO: 13：

GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 通过 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12来克隆 GhbZIP-2全长编码序列。

提取棉花 RNA,以引物 SEQ ID NO: 13 为反转录引物，获取棉花 cDNA。采用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase, 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lO PfuUltra II reaction Buffer. 0.5 μΐ 25 mM的 dNTP、 2.0 μΐ cDNA、 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ1，以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预变性 2 min， 35个循环（95 °C 变性 25 s， 57°C退火 30 s， 72 °C 延伸 40 s)， 72 °C 延伸 5 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10 min, 离心，去上清，晾干，用 21 μΐ双蒸水溶解。加入 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 0.5 μΐ 5 mM的 dATP ， 1.0 μΐ Ex Taq。反应条件： 70°C反应 30 min。将得到的约 850bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒），并将其连接至 pGEM T-easy载体上（得到 GMZ/P-2-pGEM 质粒），然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中并在含 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 固体培养基上进行筛选（方法同上）。随机挑取 8个白色菌落分别接种于含有 50 ^lmL 氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。用引物 SEQ ID NO: 11与 SEQ ID NO: 12进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列为 SEQ ID NO: 2，其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1 bZIP-2蛋白的氨基酸序列： SEQIDNO: l

1 GIQT GSQS NGQQSLLQPS PLVRQNSWYS LTLNEVENQL GNLGKPLGS NLDELLDNVW

61 STELNPPLG NNSESISSSS SSLQRQASLT LARALSGKTV DQVWSEIQQG QKRRNGEG K

121 DQEREAKLGE TTLEDFLVQA GLFVAETSLD PT EFDNTRQ QSLPHQFRLS PTPSIGTLSD

181 TP TGQKRDV FEKSIESLPQ QFGLSPTPSI GTLSDTP TG RKRDAQDAFE KSIERRLRRK

241 IKNRESAARS RARKQAYHNE LVNKVSRLEE DNLKLKREKE FDTKSQCETS ETRYQLRRTS

301 SASF 编码基因（? Ζ/Ρ-2的核苷酸序列： SEQIDNO: 2

1 ATGGGGATTC AAACTATGGG ATCCCAAAGC AATGGACAAC AGTCTCTTTT ACAGCCATCT

61 CCATTGGTGA GGCAGAATTC ATGGTATAGT CTTACTCTTA A GAAGTTGA AAACCAAT A

121 GGGAACTTGG GGAAGCCTTT AGGTAGTATG AACCTTGATG AGCTTCTTGA TAATGTATGG

181 AGTACCGAGT TGAATCCGCC GTTAGGGATG AATAATTCCG AAAGCATTTC GTCATCTTCT

241 TCATCTCTTC AACGTCAAGC TAGCTTAACC TTGGCTAGAG CTTTGAGTGG TAAGACGGTA

301 GATCAAGTGT GGAGTGAGAT ACAACAAGGT CAAAAGAGGA GGAACGGTGA GGGGATGAAG

361 GA CAAGAAA GAGAAGCAAA GCTTGGCGAA ACCACATTGG AGGATTTTTT GGTACAAGCA

421 GGGCTTTTTG TTGCTGAAAC ATCGTTGGATCCTACAATGG AATTTGATAA TACCCGTCAG

481 CAAAGTTTGC CACACCAATT CAGATTGTCA CCTACACCAT CTATTGGTAC ATTATCGGAT

541 ACACCTATGA CGGGGCAGAA ACGAGATGTA TTTGAGAAGA GTATTGAGAG TTTGCCACAG

601 CAATTTGGGT TGTCACCTAC CCCATCTATT GGTACGTTAT CGGATACACC TATGACGGGA

661 CGGAAAAGAG ATGCTCAAGA TGCATTTGAG AAGAG A CG AGAGGAGGTT AAGGAGAAAG

721 ATCAAGAACA GGGAATCTGC TGCACGATCA CGAGCTAGGA AGCAGGCTTA CCACAATGAG

781 CTGGTTAACA AGGTTTCACG A AGAAGAG GATAATCTAA AGCTCAAAAG AGAGAAGGAA

841 TTTGATACAA AATCTCAGTG TGAAACATCT GAAACAAGGT ATCAGCTTAG AAGAACAAGT

901 TCCGCCTCTT ΤΤΤΑΑ

实施例 3 GhbZIP-2基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择含双增强子的 35S启动子及 Tnos终止子分别作为 G )Z/P-2基因的启动子和终止子，构建流程如图 1所示。

使用引物 SEQIDNO: 14和 SEQIDNO: 15以植物表达载体 ρΒΙ121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer3 μΐ 2.5 mM 的 dNTPl.O μΐ ρΒΙ1211.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 EcoRI、 Bglll酶切后将所得 PCR产物连接至 lj pCAMBIA2300 (Promega, T4连接酶盒)获得 pCAMBIA2300-l。 SEQ ID NO : 14 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO : 15：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

使用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pBI121为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ pBI121 , 1.0 μΐ Prime STAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 Sacl、 EcoRI酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300-1 (Promega T4 连接酶盒;）获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO : 16：

AAGdCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO : 17：

CAGAA rmXAGTGAATTCCCGATCTAGTA

使用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 35S 启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΙ ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ稀释 50倍的 pCAMBIA2300质粒， 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 18禾 P SEQ ID NO: 19各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环 (94°C 变性 30 s， 50°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s), 72 °C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Pstl酶切后将所得 PCR产物连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO : 18：

ACT^UrATGGTGGAGCACGACACTCT

SEQ ID NO : 19：以 SEQ ID NO: 20和 SEQ ID NO: 21为引物、以实施例 2中含有全长 GhbZIP-2基因的阳性质粒为模板扩增两端带有所设计酶切位点的基因。采用 Stratagene的 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase。 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ lO PfuUltra II reaction Buffer 0.5μ1 25 mM的 dNTP、 2.0 μΐ GhbZIP-2-pGEM质粒、 1.0 μΐ PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase 10 μΜ的引物 SEQ ID NO:20和 SEQ ID NO: 21各 2.0 μ1，以及 37.5 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 95 °C预变性 2 min， 35个循环（95 °C 变性 25 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 45 s)， 72 °C 延伸 5 min。通过 Pstl、 Sacl酶切后将所得 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体 35S-GhbZIP-2-2300 (图 2 ) 。 SEQ ID NO : 20：

kk CTGCAG ATGGGGATTCAAACTATGGG

SEQ ID NO : 21：

AAGdCTCTTAAAAAGAGGCGGAACTTGTTC 实施例 4 35S-GhbZIP-2-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc) 感受态细胞的制备：将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28 °C 培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ_§/ιη1利福平和 50 μ_§/ιη1链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16 h)至 OD_6(K)值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml 活化后的种子菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5 h至 OD_6QQ=0.8。冰浴菌液 10 min，每隔 3 min摇匀一次，使细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min，弃上清液；加入一定量冰预冷的 10%甘油重悬浮菌体, 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀；用冰预冷的 10% 甘油重复洗 3-4次；加入适量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得 LBA4404 感受态细胞，以 40 μΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化 LBA4404感受态细胞，向 40 μΐ的所述感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3中所得的阳性 35S-G )Zff-2-2300质粒，混匀后冰浴约 10 min。将冰浴后的所述感受态细胞和所述阳性 3 -GhbZIP-2- 质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯（购自 Bio-Rad) 放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0.1 cm规格的电击杯， MicroPuMUer (购自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr"，电击一次。立即取出电击杯，加入 lml 28°C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用移液枪将混合物打匀。将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。取 100— 200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ_§/ιη1利福平、 50 μ_§/ιη1链霉素、 50 g/ml卡那霉素）， 28°C培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70°C保存备用。实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因拟南芥

待转化植株培养：将拟南芥种子（哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心）播种在泥炭土中，经 4°C低温处理 3天后，置于 23 °C、 16h光照 /8h黑暗的培养箱中发芽。 7— 10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3 : 1 ) 的口径为 7.5 cm的塑料钵中，每钵栽种 6株，置于 23 °C， 16h光照 /8h黑暗的培养箱中生长。移栽前每钵浇 1/2MS液体培养基 40 ml，移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长期间适当浇灌 1/2MS 液体培养基。按需要每 3-4周一次（或者时间更长）。为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，以解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。当大多数花序约 1一 10 cm高（剪去第一个花序后 4一 8 d) 时准备浸染。

农杆菌的培养：取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转化克隆的菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中（含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素和 100 mg/ L卡那霉素）， 28 °C恒温下 250 r/min振摇过夜培养。再将所得到的菌液按 1%— 2%的比例接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB 液体培养基中， 28 °C恒温振摇使农杆菌的浓度达到 OD_6QQ=1.8，然后 3000 r/min室温离心 15 min, 弃去上清液后用浸染培养基（含有 5.0%的蔗糖和 0.05% ( 500 μΙΤί) 的 Silwet L-77) 重新悬浮农杆菌，悬浮至 OD₆₀₀约 0.80。

花序的浸染：将上述含农杆菌的浸染培养基加入大 U容器中，每个 U径 9 cm的容器中加入 200— 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。将植株倒置，使地上组织全部浸没在农杆菌悬浮液中 3— 5 s, 并要轻轻搅动。浸润后植株上应该有一层液体膜。浸染过的植株放在塑料盘中，用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿，然后放置在弱光或暗处过夜，注意小心防止阳光直射植株。处理后约 12— 24 h去掉覆盖。正常培养植株，植株进一步生长 3— 5周，直至角果变褐变干。收获 T1代转基因种子，并将所述种子用离心管在 4 °C下干燥贮存。转基因种子筛选:配制 1/2MS液体培养基，加入 0.8 % ( W/V) 琼脂粉，用微波炉加热至琼脂完全溶化，待冷却到 50 °C 左右，加入卡那霉素至终浓度为 50 mg-L"¹,摇匀后每培养皿中倒入 25 mL，置实验台冷却凝固后所得固体培养基即可用于播种。将称量好的种子倒在一张普通复印纸上，用手指轻敲复印纸，将种子均匀地播种在所述固体培养基上，盖上培养皿盖，置 4 V 冰箱冷处理 72 h 后，移至 23 °C、 16h 光照 /8h黑暗的培养箱中发芽,定期统计种子发芽和幼苗生长情况，将抗性幼苗及时移栽到营养土中。移栽后视土壤湿度及时补充水分。在生长期间适当浇灌 1/2MS液体培养基。取生长 20天的卡那霉素抗性拟南芥叶片 0.1 g，提取 DNA，用 SEQ ID NO: 1 1和 SEQ ID NO: 12扩增 GhbZIP-2 ( 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 1 1禾 P SEQ ID NO: 12 各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94°C 变性 30 s， 57°C退火 30 s， 72 °C 延伸 1 min) ， 72 °C 延伸 7 min) ，将 PCR鉴定为阳性的植株进行编号，正常培养植株，植株进一步生长 3— 5周，直至角果变褐变干。收获 T2代转基因种子（编号为： T2E1-T2E16 ) ，并将种子用离心管在 4 °C下干燥贮存。实施例 6 过表达 GhbZIP-2的转基因拟南芥 T2代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定将灭过菌的蛭石用 1/2MS液体培养基浸透。将实施例 5所得的编号为 T2E1-T2E8的转基因种子及对照拟南芥（非转基因）种子分别播种在所述蛭石上，每盆播种 10颗种子， 25 °C、 10 h光培养 /14 h暗培养循环，每 7天浇一次 1/2MS液体培养基，培养 20天之后，使用 2000 PPM卡那霉素涂叶片筛选阳性植株,每盆保留大小较一致的 4棵卡那霉素抗性苗，用于干旱实验。转基因拟南芥和对照拟南芥干旱 14天 (不浇水)， 25 °C、 10 h光培养 /14 h小时暗培养循环。 T2代转基因植株的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 T2E1、 T2E2、 T2E3、 T2E4、 T2E5、 T2E6、 T2E7、 T2E8 八个株系共 32棵（每株系各 4 棵)拟南芥中 28棵能够存活并继续生长显现出显著的耐旱性（参见图 3a和 3b，以 T2E3、 T2E5为例， T2E1、 T2E2、 T2E4、 T2E6、 T2E7、 T2E8 的结果与 T2E3、 T2E5类似，在此未示出）。实施例 7 在转录水平上验证 GhbZIP-2基因的表达

分别取萌发后生长 20天然后干旱 10天的对照拟南芥（非转基因）植株、显著耐旱转基因拟南芥 T2代植株（分别属于 T2E1、 T2E2、 T2E3、 T2E4、 T2E5、 T2E6、 T2E7、 T2E8八个株系）、和不显著耐皁转基因拟南芥 T2代植株的叶片各 0.05 g，用植物 RNA 提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（2 μg总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO: 13 )。通过 SEQ ID NO: l l和 SEQ ID NO: U扩增 GhbZIP-2，检测基因 GhbZIP-2转录水平相对表达情况。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上述反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 1 1禾 P SEQ ID NO: 12各 2.0 μ1，以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94 °C预变性 5 min， 29个循环（ 94°C 变性 30 s, 57°C退火 30 s， 72 °C 延伸 45 s) ， 72 °C 延伸 10 min。

产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL2000,TakaRa) ， 1-4 为非转基因拟南芥对照， 5-8为不显著耐旱转基因拟南芥 T2代植株， 9-16为显著耐旱转基因拟南芥 T2代植株（依次为株系： T2E1、 T2E2、 T2E3、 T2E4、 T2E5、 T2E6 、 T2E7、T2E8 )。图中所示 PCR产物电泳条带大小与 GhbZIP-2的大小一致（约 850bp)。结果表明，对照拟南芥没有转录，耐旱转基因拟南芥 T2代植株中 GhbZIP-2 的转录较强，而不耐旱转基因拟南芥 T2代植株没有转录或转录很弱。

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个亮氨酸拉链蛋白，其序列为 SEQ ID N0: 1。

2. 编码权利要求 1的亮氨酸拉链蛋白的基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。

3. 一种重组表达载体，其是通过将权利要求 2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300。

4. 权利要求 3所述的载体，其为附图 2所示的 35S-GMZ/P-2-2300载体。

5. 一种重组细胞，其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

6. 一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。

7. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。

8. 权利要求 7所述的方法，其中所述植物是拟南芥。

9. 权利要求 2所述的基因、权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。

10. 权利要求 9所述的用途，其中所述植物是拟南芥。