CN105051194A - 抑制性寡核苷酸及其在治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

公开了具有通式(I)的抑制性寡核苷酸，其可用于药物组合物，其中：在式(I)中，C是胞苷或其衍生物，其中所述胞苷衍生物选自5-甲基胞苷，具有涉及胞嘧啶碱基、胞苷核苷的糖或胞嘧啶碱基和胞苷核苷的糖两者的化学修饰的胞苷样核苷酸，2’-O-甲基胞苷，5-溴胞苷，5-羟基胞苷，核糖胞苷和胞嘧啶-P-D-阿拉伯呋喃糖苷；G是鸟苷或其衍生物，其中所述鸟苷衍生物选自7-脱氮鸟苷，具有涉及鸟嘌呤碱基、鸟苷核苷的糖或鸟嘌呤碱基和鸟苷核苷的糖两者的化学修饰的鸟苷样核苷酸；X1和X3是具有0至12个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核苷酸；X2是具有0至3个核苷酸的任意核苷酸序列；N2和N3各自独立地是任意核苷酸；N4和N7是嘧啶或经修饰嘧啶；N5是嘌呤或经修饰嘌呤；N6是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，其中核苷酸N4、N5、N6或N7中的至少两个是经修饰嘌呤或经修饰嘧啶。X1CCN1N2N3X2N4N5GGGN6X3N7？？？？？(I)。

Description

抑制性寡核苷酸及其在治疗中的用途
I.技术领域
本发明总体上涉及免疫学和免疫治疗领域，并且更具体地涉及免疫调节性寡核苷酸(IRO)组合物及其用于抑制和/或阻抑Toll样受体介导的免疫应答的用途。
II.背景技术
Toll样受体(TLR)存在于免疫系统的某些细胞上，并且已表明其参与先天性免疫应答。在脊椎动物中，该家族由称为TLR1至TLR10的蛋白质组成，已知这些蛋白质识别来自细菌、真菌、寄生虫和病毒的病原体相关分子模式。TLR是哺乳动物识别外来分子并产生针对外来分子的免疫应答的关键手段，并且其还提供了将先天性免疫应答和适应性免疫应答联系在一起的手段。还已表明，TLR在很多疾病的发病机制和TLR介导的活化的调节中发挥作用，所述疾病包括自身免疫、感染性疾病和炎症。通过使用合适的试剂，这可提供用于干扰疾病的手段。
一些TLR位于细胞表面上以检测胞外病原体并引发针对胞外病原体的应答。另一些TLR位于细胞内以检测胞内病原体并引发针对胞内病原体的应答。
已表明，细菌和合成DNA中存在的某些未甲基化CpG基序激活免疫系统并诱导抗肿瘤活性。使用包含未甲基化CpG二核苷酸的反义寡核苷酸的另一些研究已表现出刺激免疫应答。后续研究证明TLR9识别细菌和合成DNA中存在的未甲基化CpG基序。包含CpG之硫代磷酸寡核苷酸的另一些修饰还可影响其用作通过TLR9之免疫应答的调节物的能力。此外，结构活性关系研究已允许鉴定这样的合成基序和新型基于DNA的化合物，它们诱导不同于由未甲基化CpG二核苷酸引起的那些的特异性免疫应答模式。
TLR的选择性定位以及由其产生的信号传导对它们在免疫应答中的作用提供一些了解。基于参与应答的细胞子集，免疫应答包括先天性应答和适应性应答两者。例如，参与经典的细胞介导功能(例如迟发型超敏反应和激活细胞毒T淋巴细胞(CTL))的T辅助(Th)细胞是Th1细胞。这种应答是分别针对病原体或其抗原(例如病毒感染、胞内病原体和肿瘤细胞)的机体先天性应答，并且导致分泌IFN-γ和同时激活CTL。或者，作为用于激活B细胞的辅助细胞参与的Th细胞是Th2细胞。已表明，Th2细胞响应于细菌和寄生虫而被激活并且可通过分泌IL-4、IL-5和IL-10来介导机体的适应性免疫应答(例如IgE产生和嗜酸粒细胞活化)。免疫应答的类型受响应于抗原暴露而产生的细胞因子的影响，并且Th1和Th2细胞分泌之细胞因子的差异可能是这两个子集的不同生物功能的结果。在某些疾病(例如哮喘和变态反应)中，机体Th1/Th2平衡向Th2环境移动。
尽管TLR的活化涉及发生免疫应答，但是TLR使免疫系统的刺激不受控制可恶化免疫受损对象中的某些疾病。若干组已显示出合成寡脱氧寡核苷酸(ODN)作为炎性细胞因子抑制剂的用途。这些抑制性ODN需要2个三联体序列，即1个近端“CCT”三联体和1个远端“GGG”三联体。除包含这些三联体的抑制性ODN之外，若干组已报道了可通过包含CpG之ODN来抑制TLR-9介导的活化的另一些特异性DNA序列。这些“抑制性”或“阻抑性”基序富含poly“G”序列(例如“GGGG”)或“GC”序列，易于被甲基化并且存在于哺乳动物和某些病毒的DNA中。
另一些研究已对包含polyG之ODN用作TLR的拮抗剂的观点提出质疑。已证明，施用包含GGGG串的CpG寡核苷酸具有有效的抗病毒和抗癌活性，并且还证明这些化合物的施用将引起血清IL-12浓度升高。此外，已知包含polyG序列的CpG寡核苷酸通过激活TLR9来诱导免疫应答。
此外，已表明包含鸟苷串的寡核苷酸形成四链结构(四联体)、用作适配体并抑制凝血酶活性。因此，不清楚单链或多链结构在后期形成不同质的高分子聚集体时是否在抑制TLR9活化方面有效。然而，G-四联体的存在使得其免疫学和药理学特性不可预测。寡核苷酸中polyG序列的存在还可改变其胞内浓度和定位。
对细菌DNA中的某些基序发生反应是脊椎动物的天然免疫的一项重要功能。长久以来，已知细菌DNA对哺乳动物B淋巴细胞(B细胞)具有促有丝分裂作用，而哺乳动物DNA则一般无此作用。以下发现开启了分子免疫学方法领域：这种免疫识别针对以包含未甲基化CpG二核苷酸的基序为中心的特异性DNA序列。
CpG位点或CG位点是其中在碱基的线性序列中沿其长度一个胞嘧啶核苷酸紧邻一个鸟嘌呤核苷酸存在的DNA区域。“CpG”是“-C-磷酸-G-”的简写，即，胞嘧啶和鸟嘌呤仅被一个磷酸隔开；磷酸将DNA中的任意两个核苷连接在一起。“CpG”标记用于使该线性序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的CG碱基配对区分开来。
可使CpG二核苷酸中的胞嘧啶甲基化以形成例如5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中，使基因内的胞嘧啶甲基化可关闭该基因。在哺乳动物中，70％至80％的CpG胞嘧啶是甲基化的。
在某些优选的侧翼序列(CpG基序)的背景下，所谓的CpGDNA的免疫刺激作用可通过使用包含CpG二核苷酸的合成寡脱氧核苷酸(ODN)来重现。已发现，最佳的序列背景分别是针对人TLR9的六核苷酸GTCpGTT和针对鼠TLR9的GACpGTT。已报道，包含CpG的ODN(CpG-ODN)可对免疫系统中的多种细胞类型产生很多作用，包括保护原代B细胞免受凋亡、促进进入细胞周期和使免疫应答向Th1型免疫应答转移，例如白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、γ干扰素(IFN-γ)的诱导、抗原特异性细胞裂解性T淋巴细胞(CTL)的活化和小鼠中IgG2a的诱导。
已报道，CpGDNA的免疫调节作用涉及通过Toll样受体9(TLR9)的信号传导。认为CpGDNA经由序列非特异性途径被内化到细胞中并运输至内体隔室，在此其以序列特异性方式与TLR9相互作用。TLR9信号传导途径导致多个免疫功能相关基因的诱导，特别包括细胞因子和趋化因子分泌的NF-KB介导的诱导等。
TLR是一个大的受体家族，其识别病原体中存在的特定分子结构(病原体相关分子模式或PAMP)，并也被称为模式识别受体(PRR)。表达PRR的免疫细胞在识别PAMP时被激活并触发最佳适应性免疫应答的产生。已经描述了由10个不同的TLR亚型(TLR1至TLR10)组成的PRR。已经描述，这样的TLR参与识别双链RNA(TLR3)、脂多糖(LPS)(TLR4)、细菌鞭毛蛋白(TLR5)、小抗病毒化合物以及单链RNA(TLR7和TLR8)和细菌DNA或CpGODN(TLR9)。综述于Uhlmann等(2003)CurrOpinDrugDiscovDevel6：204-17中。
US2005/0239733描述了具有免疫抑制活性的寡核苷酸，其包含序列XaCCN1N2N3YbN4GGGZc。这些序列包含基序5’CC-Li-GGG，其中接头(Li)具有含义N1N2N3YbN4，其中N1、N2、N3和N4各自独立地是任意核苷酸并且Yb可以是任意核苷酸序列，其中b是8至21的整数。
WO2011/005942公开了包含经修饰免疫刺激性基序的基于寡核苷酸的TLR拮抗剂，其具有结构5-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3′，其中CG是所述经修饰的免疫刺激性基序，C是胞嘧啶或嘧啶核苷酸衍生物并且G是鸟苷或嘌呤核苷酸衍生物。
WO2011/005942公开了以亲本寡核苷酸形式具有免疫刺激性但以衍生的寡核苷酸形式无免疫刺激性的寡核苷酸基序，其中所述衍生的寡核苷酸以亲本寡核苷酸为基础，但对该寡核苷酸基序具有一个或更多个降低或消除免疫刺激性的修饰。
III.发明概述
已发现，某些核酸分子选择性地抑制由Toll样受体TLR9、TLR8和TLR7介导的信号传导。这些核酸分子是长度为2至约50，优选4至30，更优选5至20并且尤其优选6至15个核苷酸的抑制性寡脱氧核苷酸(INHODN)。尽管某些抑制性ODN仅对TLR9、TLR8、TLR7或TLR3中的一个选择性抑制，而某些抑制性ODN对TLR9、TLR8、TLR7和TLR3中的两个或更多个选择性抑制。抑制性ODN可单独使用、彼此组合使用或与另一试剂(例如，小分子TLR抑制剂；免疫抑制分子(例如糖皮质激素、细胞抑制剂或抗体))组合使用，或者甚至与免疫刺激性CpG核酸分子或TLR激动剂组合使用，以在体内或体外形成免疫应答。
需要具有优良且优选较高生物活性的替代抑制性寡核苷酸。
本发明公开了具有以下通式的抑制性寡核苷酸：
X1CCN1N2N3X2N4N5GGGN6X3N7(I)
其中
C是胞苷或其衍生物，其中所述胞苷衍生物选自5-甲基胞苷，具有涉及胞嘧啶碱基、胞苷核苷的糖或胞嘧啶碱基和胞苷核苷的糖两者的化学修饰的胞苷样核苷酸，2’-O-甲基胞苷，5-取代胞苷，5-溴胞苷，5-羟基胞苷，核糖胞苷以及β-D-阿拉伯呋喃糖苷-胞苷和2’-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖苷-胞苷。
G是鸟苷或其衍生物，其中所述鸟苷衍生物选自7-脱氮鸟苷，2’-脱氧-7-脱氮鸟苷，2’-O-甲基-7-脱氮鸟苷，肌苷，2’-脱氧肌苷，7-脱氮-2’-脱氧肌苷，具有涉及鸟嘌呤碱基、鸟苷核苷的糖或鸟嘌呤碱基和鸟苷核苷的糖两者的化学修饰的鸟苷样核苷酸，
X1和X3是具有0至12个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核苷酸，X2是具有0至3个核苷酸的任意核苷酸序列，
N1、N2和N3各自独立地是任意核苷酸，
N4和N7是嘧啶或经修饰嘧啶，
N5是嘌呤或经修饰嘌呤，
N6是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，前提是
核苷酸N4、N5、N6或N7中的至少两个是经修饰嘌呤和/或经修饰嘧啶。
在一个优选实施方案中，具有通式(I)的抑制性寡核苷酸具有上述含义，其中
X1和X3是具有0至6个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核苷酸，X2是0或1个核苷酸，
N1、N2和N3各自独立地是任意核苷酸，
N4和N7是嘧啶或经修饰嘧啶，
N5是嘌呤或经修饰嘌呤，
N6是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，
其中核苷酸N4、N5、N6或N7中的至少两个是经修饰嘌呤或经修饰嘧啶，并且其中所述寡核苷酸包含不超过或少于20个核苷酸。
在一个特别优选的实施方案中，所述抑制性寡核苷酸具有通式(II)：
X1CCTGGpypuGGGpxAGpy(II)
其中
C是如上文所限定的胞苷或其衍生物，
G是如上文所限定的鸟苷或其衍生物，
X1是任意核苷酸或无核苷酸，
py是嘧啶或经修饰嘧啶核苷酸，
pu是嘌呤或经修饰嘌呤核苷酸，
px是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，
其中核苷酸py、pu和px中的至少两个是选自以下的经修饰嘌呤或经修饰嘧啶：7-脱氮-脱氧鸟苷、7-脱氮-2’-O-甲基鸟苷、肌苷、二氨基嘌呤、6-硫代-脱氧鸟苷、6-O-甲基-脱氧鸟苷、7-脱氮-肌苷、7-脱氮-7-碘脱氧鸟苷、7-氨基炔丙基脱氧鸟苷、2-氟-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶。
特别优选的是具有式(II)的抑制性寡核苷酸，其中
Py是选自5-甲基-dC、5-溴-dC和5-辛二烯基-dC的5-取代胞苷，
Pu是选自7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G、肌苷和7-脱氮-肌苷的7-脱氮嘌呤衍生物，并且Px是dA或5-碘-dU。
Px是dA、5-取代脱氧尿苷和5-碘-尿苷。
在一个特别优选的实施方案中，具有通式(II)的抑制性寡核苷酸中，Py的含义为5-甲基-dC和/或Pu的含义为7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G或7-脱氮-肌苷和/或Px的含义为5-取代-2’-脱氧尿苷。
在另一个优选实施方案中，具有通式(II)的抑制性寡核苷酸中，无X1。
在一个特别优选的实施方案中，具有通式(II)的抑制性寡核苷酸中，Px的含义为5-取代-2’-脱氧尿苷。
在一个特别优选的实施方案中，具有通式(II)的抑制性寡核苷酸中，Py的含义为5-甲基-dC和/或Pu的含义为7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G或7-脱氮-肌苷，Px的含义为5-取代-2’-脱氧尿苷，并且X1是零。
在另一个优选实施方案中，抑制性寡核苷酸具有SEQID25064、25070、25071、25077、25078、25079、25080、106918、106919、106920、106921、106924、106927、106929、106930、106931或106937之一。
在一个尤其优选的实施方案中，抑制性寡核苷酸具有SEQID25078。
在一个尤其优选的实施方案中，抑制性寡核苷酸具有SEQID106918。
在一个尤其优选的实施方案中，抑制性寡核苷酸具有SEQID106919。
在另一个优选实施方案中，抑制性寡核苷酸具有SEQID106930。
尤其优选的抑制性寡核苷酸具有通式(III)：
X1CCTGGpypuGGG(III)
其中C、G、N1、py和pu具有如上文所限定的含义。
特别优选的是具有式(III)的抑制性寡核苷酸，其中
Py是选自5-甲基-dC、5-溴-dC和5-辛二烯基-dC的5-取代胞苷，
Pu是选自7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G、肌苷和7-脱氮-肌苷的7-脱氮嘌呤衍生物，并且Px是dA或5-碘-dU。
在一个特别优选的实施方案中，具有通式(III)的抑制性寡核苷酸中，Py的含义为5-甲基-dC和/或Pu的含义为7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G或7-脱氮-肌苷和/或X1的含义为无核苷酸。
在另一个优选实施方案中，所述抑制性寡核苷酸具有通式IV：
X1AATGGpypuGGGpxAGpy(IV)
其中
Py是选自5-甲基-dC、5-溴-dC和5-辛二烯基-dC的5-取代胞苷，
Pu是选自7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G、肌苷和7-脱氮-肌苷的7-脱氮嘌呤衍生物，并且Px是dA或5-碘-dU。
Px是dA、5-取代脱氧尿苷和5-碘-尿苷并且X1是任意核苷酸或无核苷酸。
在一个特别优选的实施方案中，式II的抑制性寡核苷酸是TLR7/TLR9拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式III的抑制性寡核苷酸是TLR9拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式IV的抑制性寡核苷酸是TLR7拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式II的抑制性寡核苷酸是TLR7/TLR9/TLR3拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式II的抑制性寡核苷酸是TLR3拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式II的抑制性寡核苷酸是TLR7拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式II的抑制性寡核苷酸是TLR9拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式II的抑制性寡核苷酸是TLR3/TLR7/TLR8/TLR9拮抗剂。
在一个特别优选的实施方案中，式II的抑制性寡核苷酸是TLR7/TLR8/TLR9拮抗剂。
本发明之具有如上文更详细描述的式的抑制性寡核苷酸优选用作效力强烈增强的TLR拮抗剂。本发明的抑制性寡核苷酸可用于治疗涉及先天性免疫应答或Th1样免疫应答的多种病症，包括自身免疫病、炎症、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病、癌症、感染和败血症。所述抑制性寡核苷酸可用于预防自身免疫病、气道炎症、炎性病症、感染性疾病、皮肤病症(例如银屑病)、变态反应、哮喘或由病原体(例如细菌或病毒)引起的疾病。自身免疫病包括例如全身性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、多发性硬化和糖尿病。TLR信号传导已与神经发生相关联，并且发现其与神经变性疾病的发病机理有关。因此，也可利用干扰神经胶质细胞中的TLR信号传导来预防或治疗神经变性疾病，例如阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)、普利朊病(priondisease)、肌萎缩性侧索硬化和帕金森病(Parkinson’sdisease)。
所述抑制性寡核苷酸可用于药物组合物中。这样的组合物可仅包含所述寡核苷酸或者作为替代地可包含适当药物施用所需的生理上可接受的添加剂和/或载体，例如填料、膨胀剂。所述药物组合物可以是片剂、胶囊剂、糖衣丸剂的形式，或者是适用于注射或输注的溶液剂的形式。优选的施用途径是皮下、皮内、腹膜内或鞘内注射。在肺病症以及其他病症的情况下，可优选通过吸入施用拮抗剂。
药物组合物可用于预防或治疗自身免疫病、气道炎症、炎性病症、感染性疾病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体(例如细菌或病毒)引起的疾病。
在本发明的公开内容中，如果没有另外声明，则使用具有如下含义的术语和定义：
术语“寡核苷酸”一般指包含多个相连的核苷单元的多聚核苷酸。这样的寡核苷酸可从现有的核酸来源(包括基因组或cDNA)获得，但优选通过合成方法产生。在一些优选实施方案中，与野生型寡核苷酸相比，每个核苷单元可涵盖多个化学修饰和取代，包括但不限于经修饰核苷碱基和/或经修饰糖单元。化学修饰的实例是本领域技术人员所已知的并且在例如UhlmannE等(1990)Chem.Rev.90：543；“ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs”中有所描述。核苷酸及其衍生物和其合成在Habermehl等，Naturstoffchemie，第3版，Springer，2008中有所描述。
核苷残基可通过众多已知的任意核苷间键接彼此偶联。这样的核苷间键接包括，但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、膦酰基乙酸盐、磷酰基乙酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、乙酰胺酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、吗啉代、硼烷代(borano)、硫醚、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、桥接硫代磷酸酯和砜核苷间键接。术语“寡核苷酸”还涵盖具有一种或更多种立体特异性核苷间键接(例如，(Rp)-或(Sp)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯键接)的多聚核苷。本文中使用的术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明确地旨在包括具有任意这样的核苷间键接的多聚核苷和二核苷，不管所述键接是否包含磷酸基团。在某些优选实施方案中，这些核苷间键接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键接，或其组合。
术语“2’-取代的核糖核苷”或“2’-取代的阿拉伯糖苷”一般包括其中戊糖部分2’位的羟基被取代以产生2’-取代的或2’-取代的核糖核苷的核糖核苷和阿拉伯糖核苷。在某些实施方案中，这样的取代物包括被包含1至6个饱和或不饱和碳原子的低级烃基或被卤素原子或被具有6至10个碳原子的芳基取代的核糖核苷，其中这样的烃基或芳基可以是未取代的或者可以是被例如以下基团取代的：卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基。2’-O-取代的核糖核苷或2’-O-取代的阿拉伯糖苷的实例包括，但不限于，2’-氨基、2’-氟、2’-烯丙基、2’-O-烷基和2’-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷；2’-氟阿拉伯糖核苷(FANA)；2’-O-甲基核糖核苷或2’-O-甲基阿拉伯糖苷和2’-O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2’-O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。
术语“3’”当定向使用时一般指多核苷酸或寡核苷酸中在同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的3’(下游)的区域或位置。
术语“5’”当定向使用时一般指多核苷酸或寡核苷酸中在同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的5’(上游)的区域或位置。
术语“约”一般意指精确的数字并不重要。因此，寡核苷酸中核苷残基的数目并不重要，并且具有1或2个较少核苷残基或1至数个另外核苷残基的寡核苷酸也被考虑作为上述各个实施方案的等同物。
术语“激动剂”一般指结合细胞受体并诱导应答的物质。激动剂通常仿效天然存在物质(例如配体)的作用。
术语“拮抗剂”一般指使激动剂的作用减弱的物质。
术语“佐剂”一般指这样的物质，其在被添加至免疫原性物质(例如疫苗或抗原)时增强或强化受者宿主中在暴露于混合物后的针对该免疫原性物质的免疫应答。
术语“气道炎症”一般包括但不限于哮喘。
术语“变应原”一般指抗原或分子的抗原性部分(通常是蛋白质)，其在被暴露于对象时引发变态反应应答。通常，所述对象对变应原具有变应性，如例如通过合适的测试或本领域中已知的任何方法所示。即使一小部分的对象在暴露于分子时表现出变应性免疫应答，也认为该分子是变应原。
术语“变态反应”一般指以炎症为特征的不适当免疫应答，并且包括但不限于食物变态反应和呼吸道变态反应。
术语“抗原”一般指被抗体或被T细胞抗原受体识别并选择性结合，从而导致诱导免疫应答的物质。抗原可包括但不限于肽、蛋白质、核苷、核苷酸及其组合。抗原可以是天然的或合成的，并且一般诱导对所述抗原具有特异性的免疫应答。
术语“自身免疫病”一般指其中“自身”成分经历免疫系统攻击的病症。
术语“TLR介导的疾病”或“TLR介导的病症”一般指一种或更多种TLR的活化是贡献因素的任何病理学病症。这样的病症包括但不限于，自身免疫病(例如银屑病)、气道炎症、炎性病症、感染性疾病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体(例如细菌或病毒)引起的疾病。
术语“生理上可接受的”一般指不干扰IRO化合物的有效性并且与生物系统(例如细胞、细胞培养物、组织或生物体)可相容的物质。优选地，所述生物系统是活生物体，例如脊椎动物。
术语“载体”一般涵盖任何的赋形剂、稀释剂、填料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、包含脂质的囊泡、微球体、脂质体包封剂或本领域中公知的用于药物制剂中的其他物质。应理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于针对特定应用的施用途径。包含这些物质的可药用制剂的制备在例如Reminfton′sPharmaceuticalSciences，第18版，编辑A.Gennaro，MackPublishingCo.，Easton，Pa.，1990中有所描述。
术语“共施用”一般指至少两种不同物质的施用时间足够接近以调节免疫应答。共施用指至少两种不同物质以单一剂量或单独剂量以任何顺序的同时施用以及相隔最多几天的时间间隔顺序施用。
术语“互补”一般指具有与核酸杂交的能力。这样的杂交通常是互补链间的氢键键合优选以形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基对的结果，但是其他的氢键键合模式以及碱基堆积也可导致杂交。
术语“有效量”或“足够量”一般是指足以产生期望的生物效应(例如有益结果)的量。因此，“有效量”或“足够量”将取决于其正被施用的背景。与在单独施用抗原时获得的免疫应答相比，在施用调节针对共施用之抗原的免疫应答的组合物的背景下，IRO化合物和抗原的有效量是足以获得期望调节的量。有效量可以经一次或更多次施用而被施用。
术语“与......组合”一般指在治疗患者中疾病或病症的过程中，施用IRO化合物和可用于治疗疾病或病症而并不减弱IRO化合物的免疫调节作用的药剂。这样的组合治疗还可包括一次以上单施用IRO化合物和/或独立地施用药剂。IRO化合物和/或所述药剂的施用可通过相同途径或不同途径。
术语“个体”或“对象”或“脊椎动物”一般指哺乳动物，例如人。哺乳动物一般包括但不限于人。
术语“核苷”一般指由糖(通常是核糖或脱氧核糖)和嘌呤或嘧啶碱基组成的化合物。
术语“核苷酸”一般指包含与糖连接之磷酸基团的核苷。
本文中使用的术语“嘧啶核苷”或“py”指其中核苷的碱基组分是嘧啶碱基(例如，胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))的核苷。类似地，术语“嘌呤核苷”或“pu”指其中核苷的碱基组分是嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))的核苷。
术语“类似物”或“衍生物”可互换使用，其一般指具有经修饰碱基和/或糖的任何嘌呤和/或嘧啶核苷酸或核苷。经修饰碱基为不是鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的碱基。经修饰糖为不是核糖或2’脱氧核糖并可用于寡核苷酸的骨架中的任意糖。
术语“抑制”或“阻抑”一般指应答降低或应答的质量差异，其可另外通过引发和/或刺激应答产生。
术语“非核苷酸接头”一般指不同于通过包含核苷酸的连接键之可将寡核苷酸连接或可与寡核苷酸连接的任何键接或部分。优选地，这样的接头的长度是约2埃至约200埃。
术语“核苷酸键接”一般指将两个核苷的3’和5’羟基通过含磷键接直接连接的直接3’-5’键接。
术语“寡核苷酸基序”指寡核苷酸序列，包括二核苷酸。“如果没有一个或更多个修饰，寡核苷酸基序将具有免疫刺激性”是指以亲本寡核苷酸形式具有免疫刺激性但以衍生的寡核苷酸形式无免疫刺激性的寡核苷酸基序，其中所述衍生的寡核苷酸以亲本寡核苷酸为基础但具有一个或更多个修饰。
术语CpG指在某些序列背景(例如GT-CpG-TT或GA-CpG-TT)下可具有免疫刺激性并且包含胞嘧啶或胞嘧啶类似物以及鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物的二核苷酸基序。
在本申请中，使用具有以下含义的序列协议缩略语：
BC5-溴-dC
E7-脱氮-dG(与dE相同)
dE7-脱氮-dG
DdSpacer，无碱基
DI7-脱氮-2-脱氧肌苷
dZ5-甲基-dC
faC2’-FANA-C(FANA指2’-氟阿拉伯糖核酸)
frA2’-氟-A
frC2’-氟-C
frG2’-氟-G
I2’-脱氧-肌苷
JC3间隔区
JC5-碘-dC
JG7-脱氮-7-碘-dG
JU5-碘脱氧尿苷
mA2’-O-甲基-A
mC2’-O-甲基-C
mE7-脱氮-2’-O-甲基-G
mG2’-O-甲基-G
O8-氧代-dG
ODC5-辛二烯基-dC
PC5-丙炔基-dC
PG7-氨基炔丙基-dG
Q8-氧代-dA
V2，6-二氨基嘌呤核苷
βALNA-A
βGLNA-G
βZLNA-5-甲基-C
6MG6-O-甲基-dG
6TG6-硫代-dG
8G7-脱氮-8-氮杂-dG
术语“治疗”一般指意图获得有益或期望结果的方法，其可包括减轻症状或者延迟或改善疾病进程。
在第一方面，本发明提供了一种免疫抑制性寡核苷酸(INHODN)化合物。术语“INHODN”指为针对一种或更多种TLR之拮抗剂的免疫调节性寡核苷酸化合物，其中所述化合物包含寡核苷酸基序CC-Li-GGG和至少两个修饰，其中如果所述化合物包含少于4个连续的未经修饰鸟苷核苷酸，则所述寡核苷酸基序将不具有免疫刺激性(例如，即使其包含未甲基化的CpG)。这样的修饰可在寡核苷酸的5’端、在位于寡核苷酸基序侧翼的序列中和/或在寡核苷酸基序内。这些修饰产生抑制TLR调节的免疫刺激的IRO化合物。这样的修饰可针对碱基、糖残基和/或位于寡核苷酸基序侧翼或在寡核苷酸基序内的核苷酸/核苷的磷酸骨架。
尽管本发明涵盖具有对CG二核苷酸进行修饰的寡核苷酸序列，但是这样的序列对TLR9无免疫刺激作用。与WO201I/005942中公开的化合物相反，本发明的分子抑制TRL9调节的免疫刺激。本文中公开的化合物是免疫抑制性寡核苷酸(INHODN)。
在一些优选实施方案中，所述INHODN化合物不是反义寡核苷酸。本发明的一些重要方面示于实施例和附图中。
实施例
在三轮筛选中，已鉴定出具有经修饰核苷酸类似物的新型TLR拮抗剂，与US2005/0239733中所述之如具有序列5’dT＊dC＊dC＊dT＊dG＊dG＊dC＊dG＊dG＊dG＊dG＊dA＊dA＊dG＊dT的SEQIDNO：4的原型TLR拮抗剂相比，这些新型TLR拮抗剂表现出强烈增强的抑制活性。
在体外测试中测试本申请中所公开的寡核苷酸的生物学活性，如下进行所述体外测试：
表达人TLR9或鼠TLR9或人TLR7以及6xNF-κB-萤光素酶报道基因构建体的稳定转染的HEK293细胞及其用途在文献(Bauer等(2001)PNAS98(16)，9237-42)，Heil等(2004)Science303(5663)，1529-9，Jurk等(2006)EurJ.Immunol.36(7)，1815-26)中进行了广泛描述。
将稳定转染子(2.5x104细胞/孔)铺板过夜并先与逐渐增加量的抑制性ODN在湿润孵育箱(5％CO2)中在37℃下孵育16h，随后添加各种激动剂：针对人TLR9，0.5μMODN10103(Luganini等(2008)Antimicrob.AgentsChemother.52，1111-1120中公开的序列)；针对鼠TLR9，0.5μMODN1826(如Bauer等(2001)PNAS98(16)，9237-42中所述)；和针对人TLR7，2μMR848(如Jurk等(2006)Eur.J.Immunol36(7)，1815-26中公开的)。每个数据点以一式两份方式进行。将细胞用OneGloTM，Promega，Madison，WI，USA裂解并在于室温下孵育10分钟后分析萤光素酶基因活性。
通过参照未添加ODN的培养基中的报道基因活性来计算刺激指数。将单独TLR激动剂的活性设定为100％并由此计算在存在抑制性ODN的情况下的抑制活性。
实施例1
在具有两个至三个化学修饰的ODN中获得抑制活性的最大增加。在第一轮筛选中，dG被7-脱氮-dG(＊dE＊)、7-脱氮-2’-O-甲基-G(mE＊)、肌苷(I＊)、二氨基嘌呤(V＊)、8-氧代-dG(O＊)和多种其它核苷酸类似物取代。合成并测试的ODN示于图1A至图1E中。
所述ODN主要在dC＊dC＊和dG＊dG＊dG＊dG＊之间包含单取代，其中所述取代还可位于dG＊dG＊dG＊dG＊内。
具有一个突变(＊dG＊dG＊dG＊dG＊中不同位置上的一个dG＊被dE＊替换)的ODN之已按照上文所述测量的生物学活性示于图2和图3中。由图3可知，当GGG基序中的第一个G被经修饰核苷酸取代时获得最佳生物学活性。图2和图3示出了E和mE取代的活性。
图4示出当dG＊被无碱基残基D替换时，则抑制活性强烈下降。
图5示出了当dT核苷酸被5-碘脱氧尿苷(JU)取代时的效果。意外地，(ODN23655)3’端的dT核苷酸被5-碘脱氧尿苷替换使衍生物的抑制活性增强。
第一轮筛选步骤的结果总结于图6中。此图6中示出了经修饰碱基。在左栏中对所使用的经修饰核苷酸进行了更详细的描述。
实施例2
已使用上述方法进行了第二轮筛选。寡核苷酸具有两个取代并且序列提供于图7中。
第二轮筛选的结果总结于图8中。已发现，5-甲基-C(dZ)与7-脱氮dG(dE)或与2’-OMe-G(mE)组合的取代提高了抑制活性的效力。这可通过寡核苷酸25077观察到。此外，序列中5’dT的缺失提高了抑制活性的效力(25077与25064的对比)。
图9显示7-脱氮肌苷取代使抑制效力提高(特别参见25080)。
图10示出了5-甲基-dC(dZ)与7-脱氮-dG(dE)的组合在无5’dT的情况下的作用。具有名称25069的化合物产生了最有效的抑制性ODN。
图11示出了短ODN的抑制作用。5-Me-C和脱氮-dG/dI使对TLR9的效力提高。脱氮-dG/dI的插入导致ODN对TLR9的效力提高。短的抑制性ODN仅抑制TLR9，而不抑制TLR7。当与DI取代组合时，化合物25088中所示的5’延伸也使效力提高。
由实施例2的结论，相关区域中的修饰的作用可总结如下：
·包含紧邻G延展段5’的5-甲基-C的所有ODN都对hLTR9和mTLR9细胞系表现出提高的活性
·G延展段中G1位置处的最有效碱基变换是：
·7-脱氮-dG(dE)
·7-脱氮-2’OMe-G(mE)
·脱氮-dI(DI)
·5’dT的缺失使效力进一步提高。
来自第二轮实验的最佳候选物总结于图12中。
图13示出了意外的作用：紧邻GGG延展段3’的JU取代使抑制效力强烈提高。这可从化合物106219的生物活性看出。
图14示出了在JU取代位于序列中其他位置的情况下获得的意外结果。该结果不在预期之内。
实施例3
已在第三轮筛选中对另一些突变进行了测试。寡核苷酸主要包含如图15中所示的三元取代。
如图16中所示，当组合三个替换时观察到抑制活性的意外增强，所述三个替换包括G延展段3’的dA被5-碘-U替换。
图17示出用5-溴dC替代5-medC被良好耐受。
图18示出用5-辛二烯基-dC(ODC)替换5-medC在抑制活性方面被良好耐受。
图19示出了当用5-甲基-LNA-C取代5-甲基-dC时的作用。
图20示出了针对经5-溴-dC和5-甲基-dC修饰的类似物的数据。
实施例4
在如上文所述的测试中获得结果。为了确定INH-ODN的免疫刺激活性，不添加激动剂(10103)。然而，在单独的小瓶中使用激动剂10103作为阳性对照。
显示经修饰之强拮抗剂的未经修饰亲本ODN不刺激TLR9的数据总结于图21A、图21B和图21C中。
图 未经修饰亲本 经修饰拮抗剂 激动剂阳性对照
21A 2088 25064 10103
21B 106941 106919 10103
21C 21158 25069 10103
图21D显示未经修饰亲本ODN2088和ODN2114的TLR9抑制活性与ODN2088中的CG二核苷酸基序无关，因为产生AG二核苷酸基序之C至A的替换对抑制活性无显著影响。
图21E显示ODN2114无TLR9免疫刺激活性。
实施例5
B细胞或浆细胞样树突细胞(pDC)中的细胞因子分泌抑制测定
将B细胞或pDC在10倍滴定量的INH-ODN(0.001μM至10μM)的存在下用激动剂CpG-ODN1826(TLR9)或咪喹莫特(TLR7)刺激。使用补充有10％FCS和50μM2-巯基乙醇的RPMI或DMEM作为培养基。24小时至72小时后，使用标准方法(ELISA，多重珠阵列)在96孔微量滴定板中测定培养物上清液中的细胞因子水平。
实施例6
体内抑制活性的测定(细胞因子/趋化因子分泌的抑制)
用INH-ODN经皮下、肌内、粘膜、腹膜内或鼻内处理小鼠，并随后用刺激性ODN1826(TLR9)、poly-IC(TLR3)或咪喹莫特(TLR7)皮下攻击。在用TLR激动剂攻击后3小时，将小鼠处死并制备血清。通过标准方法(ELISA，多重珠阵列)测定细胞因子(如IL-12p40或IP-10)水平。
实施例7
胶原蛋白抗体诱导的类风湿性关节炎模型和胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎模型(例如Makino等J.NipponMoedSch2012，79，129-138所述)。
对小鼠腹膜内注射抗小鼠II型胶原蛋白的抗体。3天后，小鼠腹膜内接受50μgLPS。每天或每隔一天，以0.1mg/kg至25mg/kg的剂量经皮下、腹膜内或鼻内注射TLR拮抗剂，持续5至7天。在处理后，将小鼠处死并评价关节肿胀。制备受影响关节的总RNA并通过RT-PCR参照看家基因来测定炎性mRNA(如NLPR3、AIM2、IL-1β、TNF-a)的水平。此外，炎性细胞因子和趋化因子的血清水平可使用标准方法进行测定。用拮抗剂处理小鼠将使炎性细胞因子和蛋白质的水平显著降低。
TLR拮抗剂在类似的模型中也起作用，其中在完全弗氏佐剂(CFA)的存在下，通过用牛或鸡II型胶原蛋白(经尾注射，200μg)免疫小鼠来诱导类风湿性关节炎。用TLR拮抗剂处理小鼠将使导致疾病发作之对TLR3/7和9诱导的细胞因子产生的抑制降低。
实施例8
使用如文献(Roller等JImmunol.2012，189，4612-4620)中所述的咪喹莫特诱导的银屑病。
将小鼠剃毛并施加艾特乐乳膏剂(包含5％咪喹莫特，70-75mg)，持续至少连续5天。在第一天的处理之后，每日给予TLR拮抗剂(或每隔一天，以0.1mg/kg至25mg/kg的剂量经皮下、腹膜内或鼻内给予)。每日对小鼠的皮肤红斑、起鳞和硬度进行评价。在另一些实验中，将背部皮肤样品用H&E染色并进行组织学评价。
实施例9
采用使用(NZBxNZW)F1小鼠的小鼠狼疮模型。
在疾病发作时(4月龄)开始处理(NZBxNZW)F1小鼠，此时约25％的小鼠开始表现出蛋白尿。每周两次经皮下注射INH-ODN(剂量为0.1mg/kg至25mg/kg)来处理小鼠，持续5个月。在5个月的处理后(9月龄)，测量蛋白尿和自身抗体水平。1个月后，确定抗-dsDNA抗体并用组织学评价肾的IgG沉积。INH-ODN处理使狼疮小鼠的抗-dsDNA抗体和肾中的IgG沉积减少。在经INH-ODN处理的狼疮模型小鼠中，蛋白尿和肾小球性肾炎减轻，从而使经INH-ODN处理的小鼠的存活增加。
实施例10
MRL-Fas(lpr)小鼠狼疮模型
用INH-ODN每周两次经皮下或腹膜内注射或经鼻内处理MRL-Fas(lpr)小鼠超过10周，并在最后的剂量后约3天处死小鼠。每两周采血清样品并检查抗-dsDNA抗体、测试品血清浓度。在研究结束时(第10周)，将肾冷冻在OCT培养基中并通过免疫组织化学检查肾切片的IgG沉积。每两周收集尿并测试蛋白质。INH-ODN处理使狼疮小鼠的抗-dsDNA抗体和肾中的IgG沉积减少。
实施例11
通过INH-ODN延迟8.3-NOD小鼠中糖尿病的发作进程
以0.1mg至25mg/kg的剂量每周3次对8.3-NOD小鼠(3至4周龄)注射INH-ODN或对照(PBS或非刺激性且非抑制性ODN)。跟踪观察小鼠6周以确定糖尿病的自发性发作速率。与经PBS或非刺激性ODN注射的小鼠相比，经INH-ODN处理的雌性小鼠表现出延迟的糖尿病发生。类似地，经氯奎处理(例如，每日10mg/kg，腹膜内)的小鼠也表现出延迟的糖尿病发作。因此，内源性TLR7/TLR9活化导致8.3-NOD小鼠中的糖尿病发作。

Claims (13)

1.具有以下通式的抑制性寡核苷酸：
X1CCN1N2N3X2N4N5GGGN6X3N7(I)
其中
C是胞苷或其衍生物，其中所述胞苷衍生物选自5-甲基胞苷，具有涉及胞嘧啶碱基、胞苷核苷的糖或胞嘧啶碱基和胞苷核苷的糖两者的化学修饰的胞苷样核苷酸，2’-O-甲基胞苷，5-溴胞苷，5-羟基胞苷，核糖胞苷和胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷，
G是鸟苷或其衍生物，其中所述鸟苷衍生物选自7-脱氮鸟苷，具有涉及鸟嘌呤碱基、鸟苷核苷的糖或鸟嘌呤碱基和鸟苷核苷的糖两者的化学修饰的鸟苷样核苷酸，
X1和X3是具有0至12个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核苷酸，X2是具有0至3个核苷酸的任意核苷酸序列，
N1、N2和N3各自独立地是任意核苷酸，
N4和N7是嘧啶或经修饰嘧啶，
N5是嘌呤或经修饰嘌呤，
N6是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，
其中核苷酸N4、N5、N6或N7中的至少两个是经修饰嘌呤或经修饰嘧啶。
2.根据权利要求1所述的抑制性寡核苷酸，其具有以下通式：
X1CCN1N2N3X2N4N5GGGN6X3N7(I)
其中
C是如权利要求1中所限定的胞苷或其衍生物，
G是如权利要求1中所限定的鸟苷或其衍生物，
X1和X3是具有0至6个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他的核苷酸，X2是0或1个核苷酸，
N1、N2和N3各自独立地是任意核苷酸，
N4和N7是嘧啶或经修饰嘧啶，
N5是嘌呤或经修饰嘌呤，
N6是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，
其中核苷酸N4、N5、N6或N7中的至少两个是经修饰嘌呤或经修饰嘧啶，并且其中所述寡核苷酸包含至多或少于20个核苷。
3.根据权利要求1或2所述的抑制性寡核苷酸，其具有以下通式：
N1CCTGGpypuGGGpxAGpy(II)
其中
C是如权利要求1中所限定的胞苷或其衍生物，
G是如权利要求1中所限定的鸟苷或其衍生物，
N1是任意核苷酸或无核苷酸，
py是嘧啶或经修饰嘧啶核苷酸，
pu是嘌呤或经修饰嘌呤核苷酸，
px是经修饰嘧啶、A或经修饰嘌呤，
其中核苷酸py、pu和px中的至少两个是选自以下的经修饰嘌呤或经修饰嘧啶：7-脱氮-脱氧鸟苷、7-脱氮-2’-O-甲基鸟苷、肌苷、二氨基嘌呤、6-硫代-脱氧鸟苷、6-O-甲基-脱氧鸟苷、7-脱氮-肌苷、7-脱氮-7-碘脱氧鸟苷、7-氨基炔丙基脱氧鸟苷、2-氟-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶。
4.根据权利要求3所述的抑制性寡核苷酸，其具有以下通式：
N1CCTGGpypuGGG(III)
其中C、G、N1、py和pu具有如前述权利要求中任一项所限定的含义。
5.根据权利要求3所述的抑制性寡核苷酸，其中
Py是选自5-甲基-dC、5-溴-dC和5-辛二烯基-dC的5-取代胞苷，
Pu是选自7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G、肌苷和7-脱氮-肌苷的7-脱氮嘌呤衍生物，并且Px是dA或5-碘-dU。
6.根据权利要求1所述的抑制性寡核苷酸，特征在于其具有序列dC＊dC＊dT＊dG＊dG＊dZ＊mE＊dG＊dG＊dG＊dA＊dA＊dG＊dT。
7.根据权利要求1所述的抑制性寡核苷酸，特征在于其具有序列dC＊dC＊dT＊dG＊dG＊BC＊dE＊dG＊dG＊dG＊JU＊dA＊dG＊dT。
8.具有通式IV的抑制性寡核苷酸：
X1AATGGpypuGGGpxAGpy(IV)
其中
Py是选自5-甲基-dC、5-溴-dC和5-辛二烯基-dC的5-取代胞苷，
Pu是选自7-脱氮-dG、7-脱氮-2’-O-甲基-G、肌苷和7-脱氮-肌苷的7-脱氮嘌呤衍生物，并且Px是dA或5-碘-dU，
Px是dA、5-取代脱氧尿苷和5-碘-尿苷，并且X1是任意核苷酸或无核苷酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抑制性寡核苷酸，其用作效力强烈增强的TLR拮抗剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抑制性寡核苷酸，其用于预防和/或治疗癌症、自身免疫病、气道炎症、炎性病症、感染性疾病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病。
11.药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至9中任一项所述的抑制性寡核苷酸。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其还包含至少一种添加剂和/或载体。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其用于治疗癌症、自身免疫病、气道炎症、炎性病症、感染性疾病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病。
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