CN105044246A

CN105044246A - 一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法

Info

Publication number: CN105044246A
Application number: CN201510551542.2A
Authority: CN
Inventors: 刘健; 龙敏南; 甘礼惠; 黎海龙
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2015-11-11

Abstract

一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，涉及木聚糖。1)取配制好的糖标准品溶液或生物质水解液加到NaOH溶液中，加入PMP甲醇溶液，反应后取出冷却，用HCl中和，用氯仿萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，离心，取上清液稀释检测；2)采用C18反相色谱柱进行HPLC检测，当衍生物通过检测器时获得峰面积响应值，即可实现定性分析；3)若需定量分析，将糖标准品溶液逐级稀释，依次进样，根据步骤2)测定的峰面积响应值对相应标准糖的进样浓度进行线性回归，建立回归方程，表征峰面积响应值与糖的进样浓度之间的关系，根据峰面积响应值判断未知样品中的糖浓度，再计算当信噪比为2～5时对应的标准溶液浓度以确定最低检测限。

Description

一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法

技术领域

本发明涉及木聚糖，尤其是涉及用于多糖水解液中单糖和寡糖的快速分析的一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法。

背景技术

木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素是由D-葡萄糖基以β-1,4糖苷键连接而成的均一聚糖，其主要水解产物为纤维二糖和葡萄糖。半纤维素结构较为复杂，一般主要成分为以D-木糖为主链、多种糖基为侧链的木聚糖，组成木聚糖的主要糖基有：D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、4-O-甲基葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。木质纤维素生物质中木聚糖可以通过酸催化或者酶水解选择性转化为木糖或者低聚木糖。低聚木糖由于其独特的生理功能，已于2008年被中国卫生部批准为新资源食品(卫生部，2008)。利用富含木聚糖的木质纤维素生物质生产木糖或者低聚木糖具有巨大市场前景。目前，对于复杂的木质纤维素生物质水解产物，特别是低聚木糖尚缺乏快速、灵敏和高效的分析方法。常用的糖类化合物分析检测方法有：高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和离子色谱法(HPAEC)。糖类物质缺少紫外吸收，利用高效液相色谱法检测糖类物质通常要配备示差检测器(RID)。HPLC-RID对糖的检测灵敏度较低并且对低聚木糖分离效果不佳。由于糖类化合物较难挥发，利用GC检测糖类只能采用间接的方法，一般是通过将糖进行糖醇衍生化变成易挥发性化合物，再进行检测。利用GC检测时，糖的衍生化步骤繁琐，并且大多数情况下只用于单糖的检测，少有检测寡糖的报道。HPAEC-PAD已经广泛应用于各种单糖和寡糖的分析，但由于其洗脱液中含有高浓度的盐，限制了其与质谱的联用。仅用HPLC-RID或者HPAEC-PAD分析，无法对复杂的木聚糖水解液中缺乏商业化标准品的糖类进行定性分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)能显著提高糖的离子化程度和检测的灵敏度。PMP柱前衍生化HPLC分析方法由于其具有较高的灵敏度和分离效率，已经被广泛应用于单糖的分析，在已有的报道中，一般采用中性或偏酸性的流动相来进行分析，其流动相一般pH≤8.0。该方法在流动相pH≥8.1用于同时分析木质纤维素生物质中的单糖和寡糖尚无报道。研究结果表明，流动相pH显著影响PMP衍生化糖类化合物的分离，调整流动相的pH≥8.1，各类单糖和寡糖的PMP衍生物的分离度可以有效提高。

发明内容

本发明的目的在于提供以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生化试剂，采用碱性流动相(pH≥8.1)、紫外检测器和C-18色谱柱，建立PMP柱前衍生化的一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法。

本发明包括以下步骤：

1)取配制好的糖标准品溶液或生物质水解液加到NaOH溶液中，再加入PMP甲醇溶液，反应后取出冷却至室温，用HCl中和，然后用氯仿萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，离心，取上清液稀释检测；

2)采用C18反相色谱柱进行HPLC检测，当衍生物通过检测器时获得峰面积响应值，即可实现定性分析；

3)若需定量分析，将糖标准品溶液逐级稀释1～30倍，依次进样，根据步骤2)测定的峰面积响应值对相应标准糖的进样浓度进行线性回归，建立回归方程y＝ax+b，表征峰面积响应值y与糖的进样浓度x之间的关系，从而根据峰面积响应值可以判断未知样品中的糖浓度。再计算当信噪比为2～5时所对应的标准溶液的浓度以确定最低检测限。

在步骤1)中，所述配制好的糖标准品溶液或生物质水解液、NaOH溶液、PMP甲醇溶液、HCl、氯仿的体积比可为(1～1000)μL∶(1～1000)μL∶(1～1000)μL∶(1～1000)μL∶0.1～5.0mL，所述NaOH溶液的摩尔浓度可为0.1～10mol/L，所述PMP甲醇溶液的摩尔浓度可为0.1～10mol/L，所述HCl的摩尔浓度可为0.1～10mol/L；所述反应的温度可为30～100℃，反应的时间可为5～150min；所述离心可在2000～20000rpm下离心0.5～15min；所述稀释可稀释1～100倍。

在步骤2)中，所述C18反相色谱柱内涂有18烷基碳链的反相固定相，含碳量5％～11％，直径1.0～4.0mm，粒度1～8μm；所述HPLC检测的流速可为0.1～2.0mL/min；流动相A可为磷酸缓冲液，pH≥8.1，磷酸缓冲液的摩尔浓度可为0.01～1.00mol/L；流动相B为乙腈，采用等度洗脱，流动相A∶流动相B＝(4～0.5)∶1；紫外检测波长，230～270nm。

本发明的检测对象包括但不限于木聚糖水解液、商品功能性保健糖等。

本发明利用PMP对木聚糖水解液中的单糖和寡糖进行衍生化，通过优化高效液相色谱分离条件，首次在碱性流动相(pH≥8.1)条件下实现了多种单糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)和寡糖(纤维二糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖)的分析。本发明具有如下的有益效果：

(1)采用的设备相对便宜(相对于离子色谱)。

(2)采用的设备配件相对便宜(相对于糖分析柱和示差检测器)，降低了分析成本。

(3)操作简单、反应条件温和，既可定性分析，也可定量分析，可以与质谱联用，具有良好的市场应用前景，为木质纤维素生物质转化为燃料和化学品过程的研究奠定基础。

此外，基于PMP衍生化的HPLC方法能高效分析多种生物质水解液实际样品中的单糖和寡糖。该方法在利用木质纤维素生物质生产燃料和高附加值化学品中具有广阔的应用前景。

本发明建立了PMP柱前衍生化的HPLC分析木质纤维素生物质中单糖和寡糖方法，为木质纤维素生物质转化为燃料和化学品过程的研究奠定基础。

附图说明

图1为定性分析含有甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的木聚糖硫酸水解液。在图1中，图a为标准品，图b为木聚糖硫酸水解液。

图2为定性分析低聚木糖标准品和芒草的木聚糖酶水解产物。在图2中，图a为低聚木糖标准品，图b为芒草的木聚糖酶水解产物。

具体实施方式

以下通过实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本实施例定性分析含有甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的木聚糖硫酸水解液混合物(已中和至中性)，具体过程如下所示：

步骤1.取上述糖的标准品和混合有上述糖的木聚糖硫酸水解液100μL，分别加到100μL0.3mol/LNaOH溶液中，再加入100μL的PMP甲醇溶液(0.5mol/L)，混合均匀后，在70℃下反应30min后取出冷却至室温，用100μL0.3mol/LHCl进行中和。然后用1mL氯仿进行萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，重复三次，离心(12000rpm，5min)，取上清液稀释到一定倍数进行检测。

步骤2.HPLC检测条件：色谱柱(CAPCELLPAKC₁₈MG，3.0mmi.d.×250mm，5μm)；流速0.4mL/min；流动相A为磷酸缓冲液(0.04mol/L，pH8.5)，流动相B为乙腈，采用等度洗脱(A∶B＝4∶1)；紫外检测波长，245nm。

如图1所示，上述分离条件下，PMP试剂比所有的PMP衍生物保留时间都短，不会对PMP衍生物的分离和分析产生任何干扰。a为标准品，b为木聚糖酸水解液，可以看到，水解液的主要成分为木糖和阿拉伯糖，同时存在少量的甘露糖和鼠李糖。本发明相对于以往报道的方法，新建立的方法不仅能实现甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖6种糖的快速分离，同时简化了操作步骤，提高了分析效率。

实施例2

本实施例对HPLC分析方法线性、最低检测限和精密度分析，并实现对木聚糖水解液的定量分析。具体过程如下所示：

步骤1.取甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖标准品混合溶液100μL分别加到100μL0.4mol/LNaOH溶液中，再加入100μL的PMP甲醇溶液(0.5mol/L)，混合均匀后，在65℃下反应30min后取出冷却至室温，用100μL0.4mol/LHCl进行中和。然后用1mL氯仿进行萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，重复三次，离心(12000rpm，5min)，取上清液稀释到一定倍数进行检测。

步骤2.HPLC检测条件：色谱柱(CAPCELLPAKC₁₈MG，3.0mmi.d.×250mm，5μm)；流速0.5mL/min；流动相A为磷酸缓冲液(0.04mol/L，pH8.1)，流动相B为乙腈，采用等度洗脱(A∶B＝4∶1)；紫外检测波长，245nm。

步骤3.将6种标准糖溶液梯度稀释进行衍生化后进样分析，根据测定的响应值对相应标准糖的进样浓度进行线性回归，再将标准溶液逐级稀释，依次进样，计算当信噪比为3时所对应的标准溶液的浓度以确定最低检测限。此外，为了考察所建立方法在相同操作条件下短时间内的精密度，进行连续7次重复进样分析，计算平均相对标准偏差(RSD)。PMP衍生化6种标准糖的回归方程，相关系数(r²)，最低检测限(LOD)和平均相对标准偏差(RSD)结果如表1所示。结果显示，6种标准糖在5～100μM具有良好的线性(r²，0.9981～0.9997)、灵敏度(LOD，1.21～2.01μM)和精密度(7次连续进样，6种标准糖的RSD<1.22％)。

表1HPLC分析方法回归方程，相关系数，最低检测限和相对标准偏差

步骤4.取可能含有甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的未知浓度木聚糖水解液，重复步骤1和步骤2的方法，获得特定保留时间下的响应值，代入表1中的回归方程，即可定量分析未知样品中的各种糖浓度。

实施例3

本实施例定性分析芒草木聚糖酶水解液中的低聚糖，具体过程如下所示：

步骤1.取低聚糖的标准品和酶催化作用过的木聚糖水解液各80μL分别加到50μL0.5mol/LNaOH溶液中，再加入80μL的PMP甲醇溶液(0.5mol/L)，混合均匀后，在70℃下反应30min后取出冷却至室温，用50μL0.5mol/LHCl进行中和。然后用1mL氯仿进行萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，重复三次，离心(12000rpm，5min)，取上清液稀释到一定倍数进行检测。

如图2a所示，在上述优化的分离条件下，木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖标准品能实现基线分离。如图2b所示，在酶催化下，芒草木聚糖的主要水解产物为木二糖、木三糖和木四糖，此外还检测到少量的木五糖、木六糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。结果表明，本分析方法能同时分析木聚糖水解液中的单糖和低聚糖。

本发明可用于木聚糖水解液中单糖和寡糖的快速分析。该方法以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生化试剂，采用碱性流动相(pH≥8.1)、紫外检测器和C-18色谱柱，建立PMP柱前衍生化的HPLC有效分析木聚糖水解液中的各类单糖和寡糖。该方法耗材便宜规避了昂贵的离子色谱、糖分析柱和示差检测器，且灵敏度高、操作简单、反应条件温和、可以与质谱联用，降低了分析成本，具有良好的市场应用前景，为木质纤维素生物质转化为燃料和化学品过程的研究奠定基础。

Claims

1.一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于包括以下步骤：

2)采用C18反相色谱柱进行HPLC检测，当衍生物通过检测器时获得峰面积响应值，即实现定性分析；

3)若需定量分析，将糖标准品溶液逐级稀释1～30倍，依次进样，根据步骤2)测定的峰面积响应值对相应标准糖的进样浓度进行线性回归，建立回归方程y＝ax+b，表征峰面积响应值y与糖的进样浓度x之间的关系，从而根据峰面积响应值可以判断未知样品中的糖浓度，再计算当信噪比为2～5时所对应的标准溶液的浓度以确定最低检测限。

2.如权利要求1所述一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于在步骤1)中，所述配制好的糖标准品溶液或生物质水解液、NaOH溶液、PMP甲醇溶液、HCl、氯仿的体积比为(1～1000)μL∶(1～1000)μL∶(1～1000)μL∶(1～1000)μL∶0.1～5.0mL，所述NaOH溶液的摩尔浓度为0.1～10mol/L，所述PMP甲醇溶液的摩尔浓度为0.1～10mol/L，所述HCl的摩尔浓度为0.1～10mol/L。

3.如权利要求1所述一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于在步骤1)中，所述反应的温度为30～100℃，反应的时间为5～150min。

4.如权利要求1所述一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于在步骤1)中，所述离心是在2000～20000rpm下离心0.5～15min。

5.如权利要求1所述一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于在步骤1)中，所述稀释是稀释1～100倍。

6.如权利要求1所述一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于在步骤2)中，所述C18反相色谱柱内涂有18烷基碳链的反相固定相，含碳量5％～11％，直径1.0～4.0mm，粒度1～8μm。

7.如权利要求1所述一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于在步骤2)中，所述HPLC检测的流速为0.1～2.0mL/min；流动相A为磷酸缓冲液，pH≥8.1，磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.01～1.00mol/L；流动相B为乙腈，采用等度洗脱，流动相A∶流动相B＝(4～0.5)∶1；紫外检测波长，230～270nm。