CN105044186A - 一种孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极的制备方法。该方法首次采用银纳米粒子刻蚀石墨烯制得孔状石墨烯，并将其作为基质负载辣根过氧化酶来修饰玻碳电极。首先，用“一锅法”制得银纳米粒子-石墨烯复合材料，然后用硝酸除去银纳米粒子，即得到孔状石墨烯。再将辣根过氧化酶固定在孔状石墨烯上制成修饰电极，用循环伏安法对H2O2进行检测。本发明提供的制备孔状石墨烯的方法简单、易操作，且孔状石墨烯具有良好的化学惰性和生物相容性。此方法制得的孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰电极对H2O2的还原具有很好的电催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极的制备方法。
背景技术
石墨烯（GN）是一种新型的二维碳基纳米材料，它独特的电学、光学和力学性能，使其迅速成为当前物理、化学和材料学等领域的研究热点。据报道，通过修饰石墨烯的结构（基底或边缘）可以改进石墨烯性能，产生新型的石墨烯基材料。近年来，越来越多的研究人员开始关注石墨烯中缺陷的潜在应用，并发现石墨烯上的许多催化反应、电子转移和化学反应活性都发生在缺陷位点处。
孔状石墨烯（PGN）是一种改性的石墨烯，在其片层上有许多纳米级的孔，这种新型的材料与纯石墨烯相比有更好的性质。孔状石墨烯是一种非常有用的支持材料，它不仅可以提供大的比表面积而且可以促进反应物的扩散和传质。此外，孔状石墨烯还具有良好的吸附性能。由于其独特的多孔性，它在气体分离、海水淡化、燃料电池、电化学电容器和电化学传感器中有潜在的应用价值。然而，制备孔状石墨烯的方法通常都需要基底且过程复杂，需要配备高成本的电子仪器才能完成。然而用银纳米粒子刻蚀石墨烯是一种简单可行的方法，将氧化石墨烯与银离子在“一锅法”中同时还原，再用酸将嵌入在石墨烯片层上的银纳米粒子除去，即得到孔状石墨烯。孔状石墨烯具有良好的吸附性和生物相容性，在生物传感器中有很好的应用。
过氧化氢（H2O2）是一种活性氧物种（ROS），它是人体一些新陈代谢反应的氧化产物。H2O2的浓度与人类的健康有着密不可分的关系。因此，快速、精确的检测H2O2有着重大的意义。辣根过氧化酶（HRP）可以促进电子的传递、催化反应的进行，将其固定在孔状石墨烯上既可以保持其催化活性又可以缩短传质路径、提高传质速率，从而构建成具有制备简单、响应快、催化活性高的酶传感器。
发明内容
基于上述，本发明的目的在于提供一种孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极的制备方法，并用这种修饰电极对H2O2进行检测。
本发明的目的是这样实现的：
a.制备氧化石墨烯
用修正的Hummers法制备氧化石墨烯：首先量取浓硫酸，冰水浴冷却至-4℃，搅拌条件下，依序缓慢加入石墨粉、硝酸钠和高锰酸钾，控制反应温度在8℃～12℃，搅拌反应2h；然后将混合液移入三口烧瓶，在30℃下继续搅拌30min，得到糊状物；保持搅拌不变，在糊状物中连续加入去离子水，升温至98℃，反应30min后，在搅拌下滴加30%H2O2直至无气泡冒出，产物由棕褐色变为亮黄色；离心分离产物，分别用5%盐酸和蒸馏水离心洗涤产物，得氧化石墨；将制得的氧化石墨超声剥离，离心除去下层未剥离的氧化石墨，得到上层混合液即为氧化石墨烯；最后用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，将干燥后的氧化石墨烯配成1.0mg·mL-1的分散液，待用；
b.制备银纳米粒子-石墨烯复合材料
用“一锅法”制备银纳米粒子-石墨烯复合材料：称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶解在水中，将十六烷基三甲基溴化铵水溶液与氧化石墨烯分散液混合超声1h，得到十六烷基三甲基溴化铵功能化的氧化石墨烯（CTAB-GO），备用；再将3%氨水滴入硝酸银水溶液中，直到产生的白色沉淀消失，制得银氨溶液，接着将银氨溶液滴入十六烷基三甲基溴化铵功能化的氧化石墨烯（CTAB-GO）中，在N2保护下充分搅拌2h，最后在搅拌下加入硼氢化钠水溶液，在80℃下反应12h，使银离子与氧化石墨烯一起还原，制得银纳米粒子-石墨烯复合材料。产物用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，备用；
c.制备孔状石墨烯
将制得的银纳米粒子-石墨烯复合材料超声分散在水中，加入硝酸溶液，在室温下搅拌4天，除去银纳米粒子，最终产物用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，制得孔状石墨烯，备用；
d.玻碳电极预处理
玻碳电极依次用0.30μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95%的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入含有1.0mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用；
e.制备孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰电极
将c步骤得到的孔状石墨烯（PGN）滴涂在上述处理好的玻碳电极（GCE）上，室温下干燥制得孔状石墨烯修饰玻碳电极（PGN/GCE）；再将辣根过氧化酶（HRP）滴涂在孔状石墨烯修饰玻碳电极（PGN/GCE）上，室温下干燥制得孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极（HRP/PGN/GCE）；
f.采用步骤e所得到的孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，并将其共同浸入含有1.0mMH2O2的N2饱和的0.2MpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中进行循环伏安扫描，得到HRP/PGN/GCE修饰电极对H2O2的循环伏安曲线；
g.采用origin软件作图，绘制不同修饰电极在含有1.0mMH2O2的N2饱和的0.2MpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中对H2O2的循环伏安图。
本发明优点和产生的有益效果是：
1、在石墨烯片层上刻蚀许多纳米级的孔，使其具有更多的优良性质，这种改性在电化学上有潜在应用。由于孔状石墨烯的多孔性，其具有更大的比表面积，良好的吸附性能，可以负载大量的酶；此外，孔状石墨烯还可以促进生物分子的扩散与传质。
2、与传统的制备孔状石墨烯的方法相比，本发明提供的用银纳米粒子刻蚀石墨烯的方法简单可行，且孔状石墨烯是一种非常有用的支持材料，具有良好的吸附性和生物相容性，在生物传感器中有很好的应用。
3、本发明研制的基于孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰电极对H2O2的还原具有很好的电催化活性。这主要是由于孔状石墨烯不仅可以缩短传质路径，提高传质速率，而且其大的比表面积和良好的吸附性能可以有效提高酶的负载量，促进电子传递，从而提高了传感器的响应信号。此外，孔状石墨烯良好的生物相容性能够保持负载酶的生物活性，有利于传感器的稳定。将孔状石墨烯与酶结合，充分发挥其优势，在生物传感器中有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明不同材料的透射电镜图（TEM）。其中，A：银纳米粒子-石墨烯复合材料；B：孔状石墨烯材料。
图2为氧化石墨烯（GO）与孔状石墨烯（PGN）的拉曼光谱图。
图3为不同修饰（玻碳）电极在0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。其中，a:裸电极；b:银纳米粒子-石墨烯修饰电极；c:孔状石墨烯修饰电极。扫速：50mV/s
图4为不同修饰（玻碳）电极在含有1.0mM的H2O2的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。其中，a:裸电极；b:孔状石墨烯修饰电极；c:辣根过氧化酶-孔状石墨烯修饰电极。扫速：50mV/s
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明的内容，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
本发明实施过程中所使用的仪器和药品：
CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）用于进行循环伏安的实验，石英管加热式自动双重纯水蒸馏器（1810B，上海亚太技术玻璃公司）用于蒸二次蒸馏水。电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司），用于称量药品。超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。三氧化二铝打磨粉（0.30μm，0.05μm，上海辰华仪器试剂公司）用于处理玻碳电极。饱和甘汞参比电极，铂对电极，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硝酸银、硝酸钠、高锰酸钾、硼氢化钠、辣根过氧化酶（西安化学试剂厂）；石墨粉（深圳纳米港有限公司）。实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用的试剂均为分析纯。
孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极的制备步骤如下：
a.制备氧化石墨烯
用修正的Hummers法制备氧化石墨烯：首先量取70mL浓硫酸，冰水浴冷却至-4℃，搅拌条件下，依序缓慢加入1g1600目石墨粉、1g硝酸钠和7g高锰酸钾，反应温度控制在10℃，搅拌反应2h；然后将混合液移入三口烧瓶，在30℃下继续搅拌30min，得到糊状物。保持搅拌不变，在糊状物中连续加入150mL去离子水，升温至98℃，反应30min后在搅拌下滴加30%H2O2直至无气泡冒出，产物由棕褐色变为亮黄色。离心分离产物，用5%盐酸反复离心洗涤产物以除去剩余的金属离子，再用蒸馏水反复离心洗涤产物使其呈中性，得氧化石墨。将制得的氧化石墨超声剥离，4000rpm下离心除去下层未剥离的氧化石墨，得到上层混合液即为氧化石墨烯。最后用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥。将干燥后的氧化石墨烯配成1.0mg·mL-1的分散液，待用。
b.制备银纳米粒子-石墨烯复合材料
用“一锅法”制备银纳米粒子-石墨烯复合材料：称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）0.06g溶解在12mL水中。将CTAB水溶液与50mL1.0mg·mL-1氧化石墨烯分散液混合超声1h，得到CTAB功能化的氧化石墨烯（CTAB-GO），备用。再将3%氨水滴入硝酸银水溶液中，直到产生的白色沉淀消失，制得银氨溶液。接着将银氨溶液滴入CTAB-GO中，在N2保护下充分搅拌2h。最后在600rpm搅拌下加入硼氢化钠水溶液，在80℃下反应12h，使银离子与氧化石墨烯一起还原，制得银纳米粒子-石墨烯复合材料。产物用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，备用。
c.制备孔状石墨烯
将制得的银纳米粒子-石墨烯复合材料超声分散在水中，加入硝酸溶液，在室温下搅拌4天，除去银纳米粒子。最终产物用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，备用。
d.玻碳电极预处理
玻碳电极依次用0.30μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95%的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入含有1.0mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用。
e.制备孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰电极
将c步骤的孔状石墨烯（PGN）滴涂在上述处理好的玻碳电极（GCE）上，室温下干燥制得PGN/GCE修饰电极；再将辣根过氧化酶（HRP）滴涂在PGN/GCE上，室温下干燥制得HRP/PGN/GCE修饰电极。
为了说明孔状石墨烯（PGN）的特性，下面通过图1-图3进行描述：
图1为本发明不同材料的透射电镜图（TEM）。其中，A：银纳米粒子-石墨烯复合材料；B：孔状石墨烯材料。从图A中可以看出通过“一锅法”合成银纳米粒子-石墨烯复合材料后，尺寸约在10-30nm的球形银纳米粒子嵌入在石墨烯的片层上。当银纳米粒子被酸除去后，从图B中可以看出在石墨烯片层上出现了10-30nm的孔，表明孔状石墨烯由银纳米粒子刻蚀制得。
图2为氧化石墨烯（GO）与孔状石墨烯（PGN）的拉曼光谱图。其中1348cm-1处的D峰和1598cm-1处的G峰是碳材料标志性的峰。D峰对应于石墨烯上缺陷处的sp3杂化碳原子，而G峰对应于石墨烯上sp2杂化的平面碳原子。在石墨烯片层上引入孔的另一个证据就是拉曼光谱中D峰与G峰的强度比（ID/IG）。从图中可以看出孔状石墨烯的ID/IG明显大于氧化石墨烯的。说明由于孔的引入，孔状石墨烯上的缺陷比氧化石墨烯上的多，从另一方面反映了孔状石墨烯已成功制备。
图3为不同修饰（玻碳）电极在0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。其中，a:裸电极；b:银纳米粒子-石墨烯修饰电极；c:孔状石墨烯修饰电极。从图3.b中可以看到银纳米粒子-石墨烯复合材料修饰电极在0.43V处出现了一个尖的氧化峰，在0.14V处出现了一个还原峰，它们对应于银纳米粒子的氧化和银离子的还原，说明银纳米粒子-石墨烯复合材料成功制备。当用孔状石墨烯修饰电极在同样的溶液中扫描时，发现银的氧化还原峰消失（图3.c），说明银纳米粒子已被酸除去。此外，孔状石墨烯修饰电极（图3.c）与裸电极（图3.a）相比，其背景电流增大，表明孔状石墨烯已成功修饰在电极上。
孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极对H2O2的检测：
在电化学工作站的技术选项中选择循环伏安技术，将电位窗设置为-0.8V-0.2V。采用步骤e所得到的孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，并将其共同浸入含有1.0mMH2O2的N2饱和的0.2MpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中进行循环伏安扫描，得到HRP/PGN/GCE修饰电极对H2O2的循环伏安曲线。
图4为不同修饰（玻碳）电极在含有1.0mM的H2O2的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。其中，a:裸电极；b:孔状石墨烯修饰电极；c:辣根过氧化酶-孔状石墨烯修饰电极。由图可得：H2O2在裸电极上的还原峰出现在-0.64V处（图4.a），这个峰对应于H2O2还原为H2O。当孔状石墨烯修饰在电极上后（图4.b），峰电位发生了明显的正移，这是由于石墨烯上的孔状结构缩短了传质路径，提高了传质速率。当辣根过氧化酶负载到孔状石墨烯上后（图4.c），与裸电极（图4.a）相比，峰电位也发生了正移，说明辣根过氧化酶催化了H2O2的还原反应。再者，将其与裸的玻碳电极（图4.a）、孔状石墨烯修饰电极（图4.b）相比，H2O2在辣根过氧化酶-孔状石墨烯修饰电极上的还原峰电流有明显的增大，这表明辣根过氧化酶-孔状石墨烯修饰电极对H2O2的还原有明显的电催化作用，这主要是由于孔状石墨烯大的比表面积和良好的吸附性能提高了酶的负载量，促进了电子的传递，从而提高了传感器的响应信号。
Claims (1)
1.一种孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极的制备方法，其步骤为：
a.制备氧化石墨烯
用修正的Hummers法制备氧化石墨烯：首先量取浓硫酸，冰水浴冷却至-4℃，搅拌条件下，依序缓慢加入石墨粉、硝酸钠和高锰酸钾，控制反应温度在8℃～12℃，搅拌反应2h；然后将混合液移入三口烧瓶，在30℃下继续搅拌30min，得到糊状物；保持搅拌不变，在糊状物中连续加入去离子水，升温至98℃，反应30min后，在搅拌下滴加30%H2O2直至无气泡冒出，产物由棕褐色变为亮黄色；离心分离产物，分别用5%盐酸和蒸馏水离心洗涤产物，得氧化石墨；将制得的氧化石墨超声剥离，离心除去下层未剥离的氧化石墨，得到上层混合液即为氧化石墨烯；最后用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，将干燥后的氧化石墨烯配成1.0mg·mL-1的分散液，待用；
b.制备银纳米粒子-石墨烯复合材料
用“一锅法”制备银纳米粒子-石墨烯复合材料：称取十六烷基三甲基溴化铵溶解在水中，将十六烷基三甲基溴化铵水溶液与氧化石墨烯分散液混合超声1h，得到十六烷基三甲基溴化铵功能化的氧化石墨烯，备用；再将3%氨水滴入硝酸银水溶液中，直到产生的白色沉淀消失，制得银氨溶液；接着将银氨溶液滴入十六烷基三甲基溴化铵功能化的氧化石墨烯中，在N2保护下充分搅拌2h，最后在搅拌下加入硼氢化钠水溶液，在80℃下反应12h，使银离子与氧化石墨烯一起还原，制得银纳米粒子-石墨烯复合材料；
产物用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，备用；
c.制备孔状石墨烯
将制得的银纳米粒子-石墨烯复合材料超声分散在水中，加入硝酸溶液，在室温下搅拌4天，除去银纳米粒子；
最终产物用0.22μm微孔滤膜过滤，水洗4次，低压冷冻干燥，制得孔状石墨烯，备用；
d.玻碳电极预处理
玻碳电极依次用0.30μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95%的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；插入含有1.0mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用；
e.制备孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰电极
将c步骤得到的孔状石墨烯滴涂在上述处理好的玻碳电极上，室温下干燥制得孔状石墨烯修饰玻碳电极；再将辣根过氧化酶滴涂在孔状石墨烯修饰玻碳电极上，室温下干燥制得孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极；
f.采用步骤e所得到的孔状石墨烯-辣根过氧化酶修饰玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，并将其共同浸入含有1.0mMH2O2的N2饱和的0.2MpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，得到HRP/PGN/GCE修饰电极对H2O2的循环伏安曲线；
g.采用origin软件作图，绘制不同修饰电极在含有1.0mMH2O2的N2饱和的0.2MpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中对H2O2的循环伏安图。
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