CN105039235A - 一种应用于高温好氧堆肥的排硫硫杆菌的驯化培养方法 - Google Patents

一种应用于高温好氧堆肥的排硫硫杆菌的驯化培养方法 Download PDF

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CN105039235A CN201510551998.9A CN201510551998A CN105039235A CN 105039235 A CN105039235 A CN 105039235A CN 201510551998 A CN201510551998 A CN 201510551998A CN 105039235 A CN105039235 A CN 105039235A
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Abstract

本发明公开了一种应用于高温好氧堆肥的排硫硫杆菌驯化培养方法，本发明培养方法包括排硫硫杆菌富集培养，温度驯化，环境驯化几个步骤实现了排硫硫杆菌的高密度培养，并适应堆肥的升温过程，可以耐受高温，并在堆肥的复杂环境中大量生长。本发明在驯化过程中使用特定的富集培养基，可加快排硫硫杆菌的代谢、养分利用，有利于排硫硫杆菌的高温驯化，并且有利排硫硫杆菌的生长，快速富集。本发明解决了排硫硫杆菌在好氧堆肥不耐受高温，生长速度慢的问题。

Description

一种应用于高温好氧堆肥的排硫硫杆菌的驯化培养方法
技术领域
本发明涉及微生物菌种培养技术领域，尤其涉及一种应用于高温好氧堆肥的排硫硫杆菌驯化培养方法。
背景技术
高温好氧堆肥技术是实现固体有机废弃物无害化、减量化和资源化利用的主要途径。然而，在堆肥中始终存在着氮素损失和臭气释放的问题。
氮的损失主要是堆肥工程中的高温、高pH使铵态氮转化为氨气挥发。氨气是堆肥工程中所排臭气的主要成分，而且氨气溶于水后对堆肥设备具有一定的腐蚀性。此外，堆肥工程中臭气物质还主要包括硫化氢、含硫有机物等物质。这些气体物质不但对大气环境造成二次污染，而且影响周围居民的生活质量，危害工作人员的身体健康。因此，臭气问题解决的好坏，是整个堆肥工艺成败的关键之一。控制堆肥工程中臭气释放对于畜禽养殖业废弃物处理，提高堆肥品质，减少大气污染都具有重要的社会经济意义。
排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus）作为一种硫氧化细菌可将硫化物、单质硫和硫代硫酸盐等氧化为硫酸盐等，减少了硫化物的挥发。同时，硫酸根可以和铵离子结合，减少氨气释放。专利CN200910091091.3，一种堆肥过程中减少氮素损失的方法中有用到硫磺、硫酸亚铁、排硫硫杆菌来减少氨气和硫化氢的挥发。发明人在实现本发明的过程中发现，现有技术提供的方案存在一定的局限性。排硫硫杆菌是一种化能自养菌，最适培养温度为30℃。堆肥的环境复杂，还有持续的高温期，不利于排硫硫杆菌的生长。因此，影响其作用的发挥。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于高温好氧堆肥的排硫硫杆菌的驯化培养方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种排硫硫杆菌的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）富集培养
将排硫硫杆菌接种到基础培养基进行活化培养，获得活化后的初始排硫硫杆菌菌液；
将活化后的初始排硫硫杆菌菌液接种于富集培养基进行富集培养；
2）温度驯化
中温驯化：将富集培养后的排硫硫杆菌菌液接种到新的富集培养基，在28～31℃、150～200r/min条件下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；将驯化温度调高4～6℃继续培养1～2天，然后将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化温度调高4～6℃继续培养1～2天，然后再将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化培养温度上调4～6℃进行培养，如此重复，当驯化培养温度升高至44～46℃，且菌液浓度达1×108CFU/mL以上，完成中温驯化；
高温驯化：将上述44～46℃培养的菌液在47～49℃、150～200r/min条件下驯化培养2～3天，然后将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化温度调高2.5～3.5℃继续培养1～2天，然后再将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化培养温度上调2.5～3.5℃进行培养，如此重复，当驯化培养温度达到59.5～60.5℃，且菌液浓度达1×107CFU/mL以上，完成高温驯化；
3）环境驯化
将经温度驯化后的排硫硫杆菌菌液接种到堆肥原液培养基І，于28～31℃、120～180r/min条件下，培养至菌液浓度达到1×109CFU/mL以上；然后将菌液接种到堆肥原液培养基II中，于39～41℃、150～200r/min条件下，培养至菌液浓度达到1×108CFU/mL以上；将菌液接种到堆肥原液培养基Ш中，于49～51℃、180～220r/min条件下培养至菌液浓度达到1×108CFU/mL以上，结束驯化；
所述基础培养基配方为：每升基础培养基配中含有Na2HPO4 1.0-1.5 g，KH2PO4 1.5-2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1-0.3 g，(NH4)2SO4 0.1-0.3 g，CaCl2 0.03-0.05 g，FeCl3 0.01-0.03 g，MnSO4 0.01-0.03 g，Na2S2O3 10.0-15.0 g，余量为水；
所述富集培养基配方为：每升富集培养基配中含有Na2HPO4 1.0-1.5 g，KH2PO4 1.5-2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1-0.3 g，(NH4)2SO4 0.1-0.3 g，CaCl2 0.03-0.05 g，FeCl3 0.01-0.03 g，MnSO4 0.01-0.03 g，Na2S2O3 10.0-15.0 g，盐酸吡哆醇0.01-0.03 mg，核黄素0.01-0.03 mg，余量为水；
所述堆肥原液培养基І为：将每180～220g好氧堆肥初始物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基І；
所述的堆肥原液培养基II：将每180～220g好氧堆肥升温至30℃-45℃的物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基II；
所述堆肥原液培养基Ш：将每180～220g 50℃以上高温阶段的好氧堆肥的物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基Ш。
进一步的，上述排硫硫杆菌为Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904，保藏于Leibniz Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Curators of the DSMZ; 编号DSM 5368。
进一步的，步骤1）中所述的活化培养具体操作为：将排硫硫杆菌接种到基础培养基中，在28℃～30℃、120～150r/min条件下活化培养3～5天。
进一步的，步骤1）中所述的富集培养具体操作为：将初始排硫硫杆菌菌液以4～6%v/v的接种量接种于富集培养基，在29～31℃、150-200r/min条件下培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上。
进一步的，步骤2）和3）中所有所述接种时的菌液量为8～12%v/v。
上述所述方法驯化所得的排硫硫杆菌在高温好氧堆肥中的应用。
本发明的有益效果是：
1）本发明采用温度梯度驯化，符合堆肥升温规律，增强了排硫硫杆菌对高温的耐受能力，有利于其在堆肥中定殖。解决了排硫硫杆菌在好氧堆肥不耐受高温，生长速度慢的问题。
2）本发明在驯化过程中使用特定的富集培养基，可加快排硫硫杆菌的代谢、养分利用，在有利于排硫硫杆菌的高温驯化的同时，实现了排硫硫杆菌的高密度培养，快速富集，并适应堆肥的升温过程。
3）本发明培养方法包括排硫硫杆菌富集培养，温度驯化，环境循环几个步骤实现了排硫硫杆菌的高密度培养，并适应堆肥的升温过程，可以耐受高温，并在堆肥的复杂环境中大量生长。
4）本发明根据堆肥环境变化，分别采用不同时期的堆肥原料浸提液作为培养基进行排硫硫杆菌的培养，这样更有利于排硫硫杆菌适应堆肥的复杂环境，在堆肥的复杂环境中大量生长，缩短排硫硫杆菌在堆肥环境的适应期，有利于他的定殖和增殖，从而有利于其作用的发挥。
附图说明
图1为排硫硫杆菌在基础培养基中的生长曲线；
图2 为排硫硫杆菌在富集培养基中的生长曲线；
图 3为排硫硫杆菌在堆肥原液培养基中的生长曲线。
具体实施方式
一种排硫硫杆菌的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）富集培养
将排硫硫杆菌接种到基础培养基进行活化培养，获得活化后的初始排硫硫杆菌菌液；
将活化后的初始排硫硫杆菌菌液接种于富集培养基进行富集培养；
2）温度驯化
中温驯化：将富集培养后的排硫硫杆菌菌液接种到新的富集培养基，在28～31℃、150～200r/min条件下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；将驯化温度调高4～6℃继续培养1～2天，然后将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化温度调高4～6℃继续培养1～2天，然后再将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化培养温度上调4～6℃进行培养，如此重复，当驯化培养温度升高至44～46℃，且菌液浓度达1×108CFU/mL以上，完成中温驯化；
高温驯化：将上述44～46℃培养的菌液在47～49℃、150～200r/min条件下驯化培养2～3天，然后将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化温度调高2.5～3.5℃继续培养1～2天，然后再将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化培养温度上调2.5～3.5℃进行培养，如此重复，当驯化培养温度达到59.5～60.5℃，且菌液浓度达1×107CFU/mL以上，完成高温驯化；
3）环境驯化
将经温度驯化后的排硫硫杆菌菌液接种到堆肥原液培养基І，于28～31℃、120～180r/min条件下，培养至菌液浓度达到1×109CFU/mL以上；然后将菌液接种到堆肥原液培养基II中，于39～41℃、150～200r/min条件下，培养至菌液浓度达到1×108CFU/mL以上；将菌液接种到堆肥原液培养基Ш中，于49～51℃、180～220r/min条件下培养至菌液浓度达到1×108CFU/mL以上，结束驯化；
所述基础培养基配方为：每升基础培养基配中含有Na2HPO4 1.0-1.5 g，KH2PO4 1.5-2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1-0.3 g，(NH4)2SO4 0.1-0.3 g，CaCl2 0.03-0.05 g，FeCl3 0.01-0.03 g，MnSO4 0.01-0.03 g，Na2S2O3 10.0-15.0 g，余量为水；
所述富集培养基配方为：每升富集培养基配中含有Na2HPO4 1.0-1.5 g，KH2PO4 1.5-2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1-0.3 g，(NH4)2SO4 0.1-0.3 g，CaCl2 0.03-0.05 g，FeCl3 0.01-0.03 g，MnSO4 0.01-0.03 g，Na2S2O3 10.0-15.0 g，盐酸吡哆醇0.01-0.03 mg，核黄素0.01-0.03 mg，余量为水；
所述堆肥原液培养基І为：将每180～220g好氧堆肥初始物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基І；
所述的堆肥原液培养基II：将每180～220g好氧堆肥升温至30℃-45℃的物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基II；
所述堆肥原液培养基Ш：将每180～220g 50℃以上高温阶段的好氧堆肥的物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基Ш。
优选的，上述排硫硫杆菌为Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904，保藏于Leibniz Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Curators of the DSMZ; 编号DSM 5368。
优选的，步骤1）中所述的活化培养具体操作为：将排硫硫杆菌接种到基础培养基中，在28℃～30℃、120～150r/min条件下活化培养3～5天。
优选的，步骤1）中所述的富集培养具体操作为：将初始排硫硫杆菌菌液以4～6%v/v的接种量接种于富集培养基，在29～31℃、150-200r/min条件下培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上。
优选的，步骤2）和3）中所有所述接种时的菌液量为8～12%v/v。
上述所述方法驯化所得的排硫硫杆菌在高温好氧堆肥中的应用。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但并不局限于此。
实施例 1
一、富集培养
1）将斜面保存的排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904）接种到基础培养基进行活化，500mL三角瓶，装液量为250mL，28℃，转速120r/min培养3 d，获得活化后的初始排硫硫杆菌菌液。排硫硫杆菌在基础培养基中的生长曲线如图1所示。
所述排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904）购于Leibniz Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Curators of the DSMZ; 编号DSM 5368。
所述基础培养基成分为：每升基础培养基中含有Na2HPO4 1.2 g，KH2PO4 1.8 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 0.2 g，CaCl2 0.04 g，FeCl3 0.02 g，MnSO4 0.02 g，Na2S2O3 12.0 g，余量为水，121℃灭菌20 min，冷却后储存备用。
2）将活化后的初始排硫硫杆菌菌液以5%v/v的接种量接种于富集培养基进行富集培养。500mL三角瓶，装液量250mL，富集培养温度为30℃，转速为150-200r/min，当菌数达到1×108 CFU/mL以上结束培养，然后进行温度驯化。排硫硫杆菌在富集培养基中的生长曲线如图2所示。
所述富集培养基成分为：每升富集培养基中含有Na2HPO4 1.2 g，KH2PO4 1.8 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 0.2 g，CaCl2 0.04 g，FeCl3 0.02 g，MnSO4 0.02 g，Na2S2O3 12.0 g，烟酸0.02 mg，盐酸吡哆醇0.02 mg，核黄素0.02 mg，余量为水，121℃灭菌20 min，冷却后储存备用。
二、温度驯化
温度驯化分为两个阶段，中温驯化，30℃-45℃，温度每次调整5℃；高温驯化，45℃-60℃，温度每次调整3℃。
具体步骤如下：
1）中温驯化
将富集培养的排硫硫杆菌菌液以10%v/v接种量接种到新鲜的富集培养基，30℃，转速180r/min，培养至菌数达到9.9×109CFU/mL，将培养温度调至35℃继续培养2天；
将上步所得排硫硫杆菌菌液以10%v/v接种量接种至另一新鲜的富集培养基，35℃，转速180r/min，培养至菌数达到8.1×109CFU/mL，将培养温度调至40℃继续继续培养2天；
将上步所得排硫硫杆菌菌液以10%v/v接种量接种至另一新的富集培养基，40℃，转速150r/min，培养至菌数达到9.3×108CFU/mL。根据上述方法，每次温度提高5℃，当培养温度达到45℃，菌数达到9.8×108CFU/mL完成中温驯化；
2）高温驯化阶段：
将上述45℃培养的菌液在48℃，180r/min，培养3天；然后以10%v/v接种量接种至另一新鲜的富集培养基，48℃，转速180r/min，培养至菌数达到2.5×108CFU/mL；将培养温度调整至51℃，培养3天，然后以10%v/v接种量接种至另一新鲜的富集培养基，54℃，转速180r/min，培养至菌数达到1.9×108CFU/mL。按上述方法进行高温驯化培养，每次菌液浓度达到1.0×108CFU/mL以上时，将温度提高3℃适应3天后，再将菌液接种到新的富集培养基，直至培养温度达到60℃，菌数达到2.4×108CFU/mL完成温度驯化。
三、环境驯化
将经温度驯化后的排硫硫杆菌菌液按10%v/v接种量接种到堆肥原液培养基І，30℃，转速120r/min，培养至菌数达到9.8×109CFU/mL；
将上步所得菌液按10%v/v接种量接种到堆肥原液培养基II，40℃，转速150r/min，培养至菌数达到8.9×108CFU/mL；
将上步所得菌液按10%v/v接种量接种到堆肥原液培养基Ш，50℃，转速180r/min，培养至菌数达到7.7×108CFU/mL，结束驯化。
所述的堆肥原液培养基І为：取好氧堆肥初始的物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基І。
所述的堆肥原液培养基II：取好氧堆肥升温阶段（30℃-45℃）的物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基II。
所述的堆肥原液培养基Ш：取好氧堆肥高温阶段（50℃以上）的物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基Ш。
实施例 2
一、富集培养
将斜面保存的排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904）接种到基础培养基进行活化，500mL三角瓶，装液量为250mL，30℃，转速150r/min,培养5d,获得活化后的初始排硫硫杆菌菌液。
本发明中的排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904），保藏于Leibniz Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Curators of the DSMZ; 编号DSM 5368
所述的基础培养基其成分包括，Na2HPO4 . 1.0 g，KH2PO4 . 1.5 g，MgSO4 . 7H2O .0.1 g，(NH4)2SO4.0.1 g，CaCl2 .0.03 g，FeCl3 .0.01 g，MnSO4 .0.01 g，Na2S2O3.10.0 g，水1L，121℃灭菌20 min。
将活化后的初始排硫硫杆菌菌液以5%的接种量接种于富集培养基进行富集培养。500mL三角瓶，装液量为250mL，富集培养温度为30℃，转速150-200r/min，当菌数达到1×108CFU/mL以上结束培养，然后进行温度驯化。
所述的富集培养基其成分包括，Na2HPO4 . 1.0 g，KH2PO4 .. 1.5 g，MgSO4 . 7H2O .0.1 g，(NH4)2SO4.0.1 g，CaCl2.0.03 g，FeCl3.0.01 g，MnSO4.0.01 g，Na2S2O3.10.0 g，盐酸吡哆醇0.01 mg、核黄素0.01 mg，水1L，121℃灭菌20 min。
二、温度驯化
温度驯化分为两个阶段，中温驯化，30℃-45℃，温度每次调整5℃；高温驯化，45℃-60℃，温度每次调整3℃。
具体步骤：
1）中温驯化
将富集培养的排硫硫杆菌菌液以8%v/v接种量接种到新鲜的富集培养基，30℃，转速180r/min，培养至菌数达到1.9×109CFU/mL，将培养温度调整至35℃，继续培养2 d。
将上步所得排硫硫杆菌菌液以8%v/v接种量接种至另一新鲜的富集培养基，35℃，转速180r/min，培养至菌数达到2.1×109CFU/mL将培养温度调整至40℃，继续培养2 d。
将上步所得排硫硫杆菌菌液以8%v/v接种量接种至另一新的富集培养基，40℃，转速180r/min，培养至菌数达到5.3×108CFU/mL。根据上述方法，每次温度提高5℃，当培养温度达到45℃，菌数达到4.2×108CFU/mL完成中温驯化。
2）高温驯化阶段：
将上述45℃培养的菌液在48℃，200r/min，培养3d，然后以8%v/v接种量接种至另一新鲜的富集培养基，48℃，转速150r/min，培养至菌数达到2.5×108CFU/mL；将培养温度调整至51℃，培养3d。然后以8%v/v接种量接种至另一新鲜的富集培养基，51℃，转速200r/min，培养至菌数达到8.9×107CFU/mL。按上述方法进行高温驯化培养，每次菌液浓度达到1.0×108CFU/mL以上时，将温度提高3℃适应3天后，再将菌液接种到新的富集培养基，直至培养温度达到60℃，菌数达到9.4×107CFU/mL完成温度驯化。
三、环境驯化
将经温度驯化后的排硫硫杆菌菌液按8%v/v接种量接种到堆肥原液培养基І，30℃，转速150r/min，培养至菌数达到1.8×109CFU/mL；
将上步所得菌液按8%v/v接种量接种到堆肥原液培养基II，40℃，转速200r/min，培养至菌数达到3.9×108CFU/mL；
将上步所得菌液按8%v/v接种量接种到堆肥原液培养基Ш，50℃，转速220r/min，培养至菌数达到3.7×108CFU/mL，结束驯化。
所述的堆肥原液培养基І：取堆肥初始物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基І。
所述的堆肥原液培养基II：取堆肥升温阶段（30℃-45℃）物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基II。
所述的堆肥原液培养基Ш：取堆肥高温阶段（50℃以上）物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基Ш。
实施例 3
一、富集培养
将斜面保存的排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904）接种到基础培养基进行活化，500mL三角瓶，装液量为250mL，30℃，转速150r/min,培养4d,获得活化后的初始排硫硫杆菌菌液。
本发明中的排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904），保藏于Leibniz Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Curators of the DSMZ; 编号DSM 5368
所述的基础培养基其成分包括，Na2HPO4 . 1.5 g，KH2PO4 . 2.0 g，MgSO4 . 7H2O .0.3 g，(NH4)2SO4.0.3 g，CaCl2 .0.05 g，FeCl3 .0.03 g，MnSO4 .0.03 g，Na2S2O3.15.0 g，水1L，121℃灭菌20 min。
将活化后的初始排硫硫杆菌菌液以5%的接种量接种于富集培养基进行富集培养。500mL三角瓶，装液量为250mL，富集培养温度为30℃，转速150-200r/min，当菌数达到1×108CFU/mL以上结束培养，然后进行温度驯化。
所述的富集培养基其成分包括，Na2HPO4 . 1.5 g，KH2PO4 . 2.0 g，MgSO4 . 7H2O .0.3 g，(NH4)2SO4.0.3 g，CaCl2 .0.05 g，FeCl3 .0.03 g，MnSO4 .0.03 g，Na2S2O3.15.0 g，盐酸吡哆醇0.03 mg、核黄素0.03 mg，水1L，121℃灭菌20 min。
二、温度驯化
温度驯化分为两个阶段，中温驯化，30℃-45℃，温度每次调整5℃；高温驯化，45℃-60℃，温度每次调整3℃。
具体步骤：
1）中温驯化
将富集培养的排硫硫杆菌菌液以12%接种量接种到新鲜的富集培养基，30℃，转速150r/min，培养至菌数达到7.1×109CFU/mL将培养温度调整至35℃，继续培养2 d 。
将上步所得排硫硫杆菌菌液以12%接种量接种至另一新鲜的富集培养基，35℃，转速150r/min，培养至菌数达到6.8×109CFU/mL将培养温度调整至40℃，继续培养2 d 。
将上步所得排硫硫杆菌菌液以12%接种量接种至另一新的富集培养基，40℃，转速150r/min，培养至菌数达到6.5×108CFU/mL。根据上述方法，每次温度提高5℃，当培养温度达到45℃，菌数达到4.2×108CFU/mL完成中温驯化；
2）高温驯化阶段：
将上述45℃培养的菌液在48℃，150r/min，培养3d，然后以10%接种量接种至另一新鲜的富集培养基，48℃，转速150r/min，培养至菌数达到3.6×108CFU/mL；将培养温度调整至51℃，培养3d，然后以10%接种量接种至另一新鲜的富集培养基，51℃，转速150r/min，培养至菌数达到8.9×107CFU/mL。按上述方法进行高温驯化培养，每次菌液浓度达到1.0×108CFU/mL以上时，将温度提高3℃适应3天后，再将菌液接种到新的富集培养基，直至培养温度达到60℃，菌数达到4.9×108CFU/mL完成温度驯化。
三、环境驯化
将经温度驯化后的排硫硫杆菌菌液按12%接种量接种到堆肥原液培养基І，30℃，转速150r/min，培养至菌数达到7.1×109CFU/mL；
将上步所得菌液按12%接种量接种到堆肥原液培养基II，40℃，转速180r/min，培养至菌数达到5.7×108CFU/mL；
将上步所得菌液按12%接种量接种到堆肥原液培养基Ш，50℃，转速200r/min，培养至菌数达到4.6×108CFU/mL，结束驯化。
所述的堆肥原液培养基І：取堆肥初始的物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基І。
所述的堆肥原液培养基II：取堆肥升温阶段（30℃-45℃）的物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基II。
所述的堆肥原液培养基Ш：取堆肥高温阶段（50℃以上）的物料200g，加入1L水振荡30min，过滤，滤液121℃灭菌20 min，制成堆肥升温期原液培养基Ш。
下而对本发明驯化所得的高温好氧排硫硫杆菌作进一步的效果检测。
一、生长曲线的检测
测定驯化前后排硫硫杆菌在堆肥原液培养基中的生长曲线，如图3所示，从中可以看出，本发明驯化后的排硫硫杆菌在堆肥原液培养基中的生长速度显著快于驯化前的排硫硫杆菌。
二、在 堆肥 中的应用检测
以鲜鸡粪和蘑菇渣为堆肥原料进行好氧堆肥。将鲜鸡粪和蘑菇渣按照质量比3：2的比例进行混合，C/N为30：1，调整含水率50%左右。
试验设3个处理：1）堆肥原料（CK组）；（2）堆肥原料+未经驯化排硫硫杆菌菌液（T1组）；（3）堆肥原料+实施例1驯化所得的排硫硫杆菌菌液（T2组）。排硫硫杆菌菌液添加量为2%（V/W）。菌液是在物料搅拌过程中均匀的喷洒到物料中，堆肥的方法按常规的有氧堆肥方法进行。堆肥结束后检测各组肥料中有效硫的含量。
检测结果如表1所示，从中可以看出，应用本发明驯化后的排硫硫杆菌所得的堆肥产品中有效硫含量明显高于另外两个处理。本发明驯化后的排硫硫杆菌更好地适应了堆肥环境，从而促进了硫的氧化进程，提高了堆肥有效硫含量。
表1 堆肥产品各处理有效硫含量
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种排硫硫杆菌的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）富集培养
将排硫硫杆菌接种到基础培养基进行活化培养，获得活化后的初始排硫硫杆菌菌液；
将活化后的初始排硫硫杆菌菌液接种于富集培养基进行富集培养；
2）温度驯化
中温驯化：将富集培养后的排硫硫杆菌菌液接种到新的富集培养基，在28～31℃、150～200r/min条件下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；将驯化温度调高4～6℃继续培养1～2天，然后将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化温度调高4～6℃继续培养1～2天，然后再将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化培养温度上调4～6℃进行培养，如此重复，当驯化培养温度升高至44～46℃，且菌液浓度达1×108CFU/mL以上，完成中温驯化；
高温驯化：将上述44～46℃培养的菌液在47～49℃、150～200r/min条件下驯化培养2～3天，然后将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化温度调高2.5～3.5℃继续培养1～2天，然后再将菌液接种到新的富集培养基中，在相同温度下驯化培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上；再将驯化培养温度上调2.5～3.5℃进行培养，如此重复，当驯化培养温度达到59.5～60.5℃，且菌液浓度达1×107CFU/mL以上，完成高温驯化；
3）环境驯化
将经温度驯化后的排硫硫杆菌菌液接种到堆肥原液培养基І，于28～31℃、120～180r/min条件下，培养至菌液浓度达到1×109CFU/mL以上；然后将菌液接种到堆肥原液培养基II中，于39～41℃、150～200r/min条件下，培养至菌液浓度达到1×108CFU/mL以上；将菌液接种到堆肥原液培养基Ш中，于49～51℃、180～220r/min条件下培养至菌液浓度达到1×108CFU/mL以上，结束驯化；
所述基础培养基配方为：每升基础培养基配中含有Na2HPO4 1.0-1.5 g，KH2PO4 1.5-2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1-0.3 g，(NH4)2SO4 0.1-0.3 g，CaCl2 0.03-0.05 g，FeCl3 0.01-0.03 g，MnSO4 0.01-0.03 g，Na2S2O3 10.0-15.0 g，余量为水；
所述富集培养基配方为：每升富集培养基配中含有Na2HPO4 1.0-1.5 g，KH2PO4 1.5-2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1-0.3 g，(NH4)2SO4 0.1-0.3 g，CaCl2 0.03-0.05 g，FeCl3 0.01-0.03 g，MnSO4 0.01-0.03 g，Na2S2O3 10.0-15.0 g，盐酸吡哆醇0.01-0.03 mg，核黄素0.01-0.03 mg，余量为水；
所述堆肥原液培养基І为：将每180～220g好氧堆肥初始物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基І；
所述的堆肥原液培养基II：将每180～220g好氧堆肥升温至30℃-45℃的物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基II；
所述堆肥原液培养基Ш：将每180～220g 50℃以上高温阶段的好氧堆肥的物料加入1L水振荡25～40min，过滤，滤液中加入0.8～1.2%硫磺，灭菌，即得堆肥原液培养基Ш。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的排硫硫杆菌为Thiobacillus thioparus Beijerinck 1904，保藏于Leibniz Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Curators of the DSMZ; 编号DSM 5368。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述的活化培养具体操作为：将排硫硫杆菌接种到基础培养基中，在28℃～30℃、120～150r/min条件下活化培养3～5天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述的富集培养具体操作为：将初始排硫硫杆菌菌液以4～6%v/v的接种量接种于富集培养基，在29～31℃、150-200r/min条件下培养至菌液浓度为1×108CFU/mL以上。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）和3）中所有所述接种时的菌液量为8～12%v/v。
6.权利要求1～5任一所述方法驯化所得的排硫硫杆菌在高温好氧堆肥中的应用。
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