CN105030767B - 化合物t521或其结构类似物制备抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种化合物T521或其结构类似物制备抗肿瘤药物的应用，所述的应用基于T521或其结构类似物结合Plk1(Polo‑like kinases1)PBD(Polo Box Domain)从而抑制Plk1与其天然配体结合的功能。本发明还涉及一种以Plk1 PBD活性中心的关键氨基酸空间结构为靶标的Plk1抑制剂的筛选方法。

Description

化合物T521或其结构类似物制备抗肿瘤药物的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体而言，涉及一种化合物T521或其结构类似物制备抗肿瘤药物的应用。

背景技术

癌症是以细胞异常增殖及转移为特点的一大类疾病，其发病与有害环境因素、不良生活方式及遗传易感性密切相关。2000年全球新发癌症病例约1000万，死亡620万，现患病例2200万^[1]。预计2020年癌症新发病例将达到1500万，死亡1000万，现患病例3000万^[1]。癌症正在成为新世纪人类的第一杀手。伴随着人口老龄化加剧、生态环境破坏、不良生活方式及食品安全问题的凸现，我国恶性肿瘤发病率多年呈持续上升趋势，已经成为严重影响国民健康的危重疾病。廿世纪70年代以来，我国癌症发病及死亡率一直呈上升趋势，至90年代的20年间，癌症死亡率上升29.42％，年龄调整死亡率上升11.56％^[1]。2000年癌症发病人数约180-200万，死亡140-150万，在城镇居民中，癌症已占死因的首位。特别值得重视的是，我国农村癌症死亡率的上升速度明显高于城市，癌症高发地区亦多在农村和西部地区，危害尤为严重，是当地农民因病致贫及因病返贫的重要原因。目前我国每死亡5人，即有1人死于癌症；而在0～64岁人口中，每死亡4人，即有1人死于癌症^[1]。不仅严重影响劳动人口健康，而且成为医疗费用上涨的重要因素。据有关部门估算，每年用于癌症病人的医疗费用达数百亿元，中国亟须向恶性肿瘤宣战。因此，开发新型高效的抗肿瘤药物成为恶性肿瘤治疗的关键。

肿瘤的主要特征是遗传不稳定性诱发的连续基因突变、持续性的血管生成、细胞生长失控并抵抗细胞死亡、组织浸润及转移及细胞能量代谢异常。传统抗肿瘤药物以干扰或影响核酸生物合成、影响DNA结构与功能、干扰转录及阻止RNA合成、干扰蛋白质合成与功能及影响激素平衡以实现对肿瘤细胞的杀伤，但是大部分传统化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞尚缺乏理想的选择作用，骨髓抑制等毒性反应成为肿瘤化疗限制剂量使用的关键因素，同时也影响了患者的生存质量。因此，开发安全、高效、低毒的新型抗肿瘤药物具有重要的临床意义。

保罗样激酶(Polo-like kinases,Plks)是广泛存在于真核生物中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,其家族成员主要包括Plk1、Plk2、Plk3、Plk4和Plk5。Plk1是广泛存在于真核生物中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，主要在细胞有丝分裂的G2晚期和M期表达，在有丝分裂启动、中心体成熟、纺锤体组装、染色体分离及胞质分裂等细胞有丝分裂过程中发挥至关重要的作用^[2]。Plk1在大部分恶性肿瘤细胞中呈过度表达并且与肿瘤的发生与发展密切相关，因此以Plk1为靶点的药物较传统微管蛋白活性抑制剂(如紫杉醇、长春碱、长春瑞宾)具有更好的选择性、耐受性和临床应用优势^[3,4]，被认为是肿瘤治疗最具潜力的重要靶点。与Plk1功能相反，Plk2和Plk3被认为是重要的抑癌因子，在检查点导致的周期阻滞中发挥作用来保证基因组稳定性，防止癌变^[5,6]；另外，由于CpG甲基化导致的翻译沉默(transcriptional silencing)使Plk2在B细胞瘤中持续低水平表达，Plk2被认为是B细胞瘤中的重要抑癌因子^[7]；Plk3也可能通过调控HIF-1通路而发挥抑癌作用^[8]；当前对Plk4和Plk5的功能还不甚了解，目前认为Plk4通过对中心体复制调控在保证基因组稳定性方面发挥重要作用^[9,10]；Plk5与神经元分化功能密切相关，其被认为是神经胶质母细胞瘤的一个重要抑癌因子^[11]。

Plk1-3在结构方面有较大的相似性，N端具有一个高度同源的激酶催化结构域(ATP binding pocket/Kinase domain,KD)，C端具有调节Plks催化活性及亚细胞动态定位的特征性结构域PBD(Polo Box domain,PBD)。目前，大部分以Plk1为靶点的小分子抑制剂均是靶向激酶结构域的ATP结合位点(ATP-binding pocket)进行设计的，其中BI2536、BI6727、GSK461364、ON01910及HMN214等小分子抑制剂已经进入Ⅰ/Ⅱ期临床研究。尽管ATP竞争性抑制剂在一定程度上具有靶标选择性，但ATP结合域在众多激酶结构中的高度保守性及ATP结合域结构变异的积累导致的药物耐受等诸多问题，这使开发高选择性的Plk1抑制剂面临极大的挑战。

因此，Plk1特有的底物结合域PBD成为新型Plk1小分子抑制剂开发的理想靶点。PBD是Plks家族的特有结构域，Plk1-3 PBD由两个特异的Polo Box(PB1和PB2)组成，并具有较高的同源性；Plk4的C端具有较大的特异性，仅存在一个Polo Box；Plk5虽然具有两个Polo Box结构，但是其缺少激酶结构域。正常情况下,Plk1激酶区域(Kinase Domain,KD)与PBD结合，以一种自抑制的调控形式存在；当Thr210被上游的其他激酶磷酸化后,PBD便开始与磷酸化底物结合，KD解离后开启激酶催化活性，从而开始一系列的下游生物学反应。EliaAE等^[12]通过对定向肽库进行筛选发现了与Plks PBD特异结合的磷酸肽(S-[pS/pT]-P/X)并系统阐明了该磷酸肽与PBD共结晶的晶体结构及其相互作用的分子识别基础，使得人们对依赖PBD的蛋白质-蛋白质相互作用的认识有了本质的突破。故此，Plk1特有的底物结合域PBD成为新型Plk1小分子抑制剂开发的理想靶点。目前，已经报道的Plk1 PBD小分子抑制剂主要包括Poloxin及其结构类似物百里醌(Thymoquinone,TQ)、Poloxipan、红倍酚(Purpurogallin,PPG)和绿茶儿茶素类化合物(Green Tea Catechins)。但是，这些数量及结构有限的小分子抑制剂多属天然产物，极大地限制了靶向Plk1 PBD小分子抑制剂的基于结构的定向设计。靶向Plk1 PBD的小分子抑制剂的开发对于Plk1PBD生物学功能的研究以及靶向Plk1 PBD新型抗肿瘤药物的定向设计具有重要的理论和实际意义。

参考文献：

[1]《中国癌症预防与控制规划纲要(2004-2010)》

[2]Archambault V,Glover DM.Polo-like kinases:conservation anddivergence in their functions and regulation.Nat Rev Mol.Cell Biol,2009,10(4):265-75.

[3]Strebhardt K,Ullrich A.Targeting polo-like kinase 1for cancertherapy.Nat Rev Cancer,2006,6(4):321-30.

[4]Lens SM,Voest EE,Medema RH.Shared and separate functions of polo-like kinases and aurora kinases in cancer.Nat Rev Cancer,2010,10(12):825-41.

[5]Strebhardt K.Multifaceted polo-like kinases:drug targets and anti-targets for cancer therapy.Nat Rev Drug Discov,2010,9(8):643-60.

[6]Bahassi M.Polo-like kinases and DNA damage checkpoint:beyond thetraditional mitotic functions.Exp Biol Med,2011,236(6):648-57.

[7]Syed N,Smith P,Sullivan A,et al.Transcriptional silencing of Polo-like kinase 2(SNK/PLK2)is a frequent event in B-cell malignancies.Blood,2006,107(1):250-6.

[8]Yang Y,Bai J,Shen R,et al.Polo-like kinase 3 functions as a tumorsuppressor and is a negative regulator of hypoxia-inducible factor-1 alphaunder hypoxic conditions.Cancer Res,2008,68(11):4077-85.

[9]Holland AJ,Lan W,Niessen S,et al.Polo-like kinase 4kinase activitylimits centrosome overduplication by autoregulating its own stability.JCellBiol,2010,188(2):191-8.

[10]Sillibourne JE,Bornens M.Polo-like kinase 4:the odd one out ofthe family.Cell Div,2010,5(25):1-9.

[11]de Cárcer G,Escobar B,Higuero AM,et al.Plk5,a polo box domain-only protein with specific roles in neuron differentiation and glioblastomasuppression.Mol Cell Biol,2011,31(6):1225-39.

[12]Lee KS,Idle JR.Pinning down the polo-box domain.Chem Biol,2008,15(5):415-6.

发明内容

本发明首先涉及式1所示小分子化合物T521(5-乙基砜基-2-(4-氟苯基)-4-苯磺酰噁唑)或其结构类似物在制备用于细胞学研究的制剂或药物中的应用，所述的应用基于T521或其结构类似物结合Plk1(Polo-like kinases1)PBD(Polo Box Domain)从而抑制Plk1与其天然配体结合的功能，所述的应用为：

(1)制备阻断Plk1与其配体结合的阻断剂的应用；

(2)制备阻滞细胞至G2/M期的细胞周期调节剂的应用；

(3)制备引发染色体整列损伤及纺锤体组装障碍的调节剂的应用；

(4)制备促进凋亡制剂的应用；

(5)制备抗肿瘤的药物的应用。

所述的配体为人工或天然配体，优选为人工多肽Wee1A Peptide、或天然配体GST-Map205^PBM。

所述式1所示小分子化合物的结构类似物优选为式2所示化合物(1-羟基-4-N-(2,5-二甲基)-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫醚)。

所述的制剂或药物包括，有效量的式1所示化合物或其结构类似物，以及必要的制剂/药用辅料。

式1：化合物T521(5-乙基砜基-2-(4-氟苯基)-4-苯磺酰噁唑)

式2：1-羟基-4-N-(2,5-二甲基)-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫醚

本发明还涉及由式1所示化合物或其结构类似物制备的如下制剂或药物：

(1)阻断Plk1与其配体结合的阻断剂；

(2)阻滞细胞至G2/M期的细胞周期调节剂；

(3)引发染色体整列损伤及纺锤体组装障碍的调节剂；

(4)促进凋亡制剂；

(5)抗肿瘤药物。

所述的配体为人工或天然配体，优选为人工多肽Wee1A Peptide、或天然配体GST-Map205^PBM。

所述式1所示小分子化合物的结构类似物优选为式2所示化合物(1-羟基-4-N-(2,5-二甲基)-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫醚)。

所述的制剂或药物包括，有效量的式1所示化合物或其结构类似物，以及必要的制剂/药用辅料。

本发明还涉及一种以Plk1 PBD活性中心的关键氨基酸空间结构为靶标的Plk1抑制剂的筛选方法，所述的Plk1 PBD活性中心的关键氨基酸空间结构为Plk1蛋白的His538、Lys540、Arg557在具备生物学活性的Plk1蛋白三级结构的空间构象中形成的立体结构，所述的筛选方法包括：

(1)使用分子对接预测靶标和化合物的相互结合；

(2)使用生化检测方法验证二者的相互结合。

所述的生化检测方法包括但不限于，荧光偏振筛选、竞争性ELISA、等温滴定量热法。

本发明还涉及使用所述方法筛选获得的化合物，优选的，所述化合物为T521(如式1所示)或如式2所示化合物(1-羟基-4-N-(2,5-二甲基)-磺酰胺基-萘-2-羧甲基硫醚)

附图说明

图1、T521的结构及基本功能，1A，T521的分子结构；1B，T521的量效关系曲线；1C，T521专一的抑制Plk1 PBD；1D，T521与Wee1A磷酸肽的竞争ELISA实验；1D，T521与GST-Map205^PBM的竞争ELISA实验；1E，T521在HeLa细胞中的细胞毒性。

图2、T521与Plk1 PBD结合方式验证，2A，T521的时间依赖性抑制作用；2B，T521的温度依赖性抑制作用；2C，质谱法鉴定T521/PBD结合模式；2D，T521/Plk1 PBD结合动力学实验。

图3、T521的功能验证，3A，T521时间依赖性的引发HeLa细胞G2/M期阻滞；3B，T521剂量依赖性的引发HeLa细胞G2/M期阻滞；3C，T521引发剂量依赖性的G2/M期阻滞的定量分析；3D，Western Blot分析T521引发G2/M期阻滞。

图4、T521细胞学分布验证，4A，T521引发剂量依赖性前中期细胞阻滞的定量分析；4B，激光共聚焦实验(Plk1亚细胞定位改变)；4C，激光共聚焦实验(染色体整列损伤)。

图5、T521促进肿瘤细胞凋亡，5A，T521引发HeLa细胞的大量凋亡；5B，T521引发细胞大量凋亡的定量分析；5C，Western Blot分析PARP的大量断裂。

图6、T521和Plk1 PBD分子对接示意图。

具体实施方式

实施例1.细胞的培养

人成骨肉瘤细胞MG63、人成骨肉瘤细胞SaOS-2、人骨肉瘤细胞U-2OS、人骨髓神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人乳腺癌细胞MCF-7、人子宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞HCT-116、人结肠癌细胞HT-29、人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞Bel7402、人前列腺癌PC3、人肺癌A459、人胚肺成纤维细胞MRC-5、人胚肾细胞HEK-293，人肝细胞L02，所有细胞均为贴壁细胞，约48h传代一次。待细胞长满后，弃旧培养基，用PBS漂洗细胞后弃掉，之后加适量胰酶，在室温下消化约2-10min，弃掉消化液，立即加入含10％FBS的培养基，以抑制胰蛋白酶活力，用弯头吸管反复轻轻吹打培养瓶内细胞，使细胞完全脱离瓶底且吹打使之分散为单个细胞悬液。再按1:3-1:6比例接种细胞悬液于新的细胞瓶内，然后补加适量完全培养基，放入培养箱继续培养。培养条件：37℃，5％CO₂。

实施例2化合物T521对PLK1 PBD抑制活性的测定

本活性测定采用荧光偏振(FP)高通量筛选模型进行化合物活性的测定。

测定原理：

主要基于荧光分子的偏振性与其受激发时荧光分子的旋转速度密切相关的原理。当荧光分子受平面偏振光激发时，如果荧光分子在受激发时保持静止状态，那么发射光将位于同样的偏振平面；如果荧光分子在受激发时保持旋转状态，那么发射光将位于与激发光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。如果分子量较大，受激发时荧光分子的旋转速度较慢，则发射光偏振程度较高；如果分子量较小，受激发时荧光分子的旋转速度较快，则发射光相对于激发光平面将去偏振化。因此，本研究拟建立的荧光偏振高通量筛选方法将以FITC-Poloboxtide((FITC-GPMQSpTPLNG-OH；MW:1583.61；Purity＞95％；λex/λem:485/535nm，由上海强耀生物科技有限公司合成)作为Plk1 PBD的模拟底物，从而进行靶向Plk1 PBD的小分子抑制剂的活性测定。

测定方法：

(1)将400nM Plk1 PBD溶液以30μL/孔依次加入到384孔板中，将10mM的T521进行倍比稀释后，以终浓度100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.12μM、1.56μM和0.78μM依次加入到384孔板中并做好对应的准确记录，以同时加入0.3μL DMSO孔作为阴性对照(NegativeControl,0％Inhibition)；以仅含有60μL 30nM FITC-Probe孔为阳性对照(PositiveControl,100％Inhibition)。将其混匀后室温缓慢振摇，孵育60min。

(2)将60nM FITC-Probe以30μL/孔依次加入到384孔板中的上述各反应孔中，将其混匀后室温缓慢振摇，避光孵育15min，以多功能微孔板检测仪进行mP检测。

(3)用如下方程计算待测化合物抑制率：

并以GraphPad Primer 5拟合抑制曲线确定化合物T521的表观IC₅₀。

以FP实验对化合物T521进行量效关系分析，表观IC₅₀≈1.22μM(图1B)，能在体外抑制Plk1 PBD的活性。

分别以FITC-GPMQTSpTPKNG-OH(MW:1624.72；Purity＞95％；λex/λem:485/535nm)和FITC-GPLATSpTPKNG-OH(MW:1699.81；Purity＞95％；λex/λem:485/535nm)作为Plk2PBD2和Plk3 PBD模拟底物，以同法检测小分子抑制剂T521对GST-Plk2 PBD和GST-Plk3 PBD的选择性抑制作用。当小分子抑制剂T521在上述FP实验体系终浓度达到500μM时，我们仍然没有发现其对GST-Plk2 PBD和GST-Plk3PBD产生明显的抑制作用(图1C)。上述实验表明，小分子抑制剂T521对Plk1 PBD的抑制作用具有较好的体外选择性。

选用HeLa细胞作为肿瘤细胞的代表细胞，以MTT方法进行小分子抑制剂T521的细胞毒性初步评价。在上述实验中，我们发现小分子抑制剂T521对HeLa细胞具有明显的细胞毒性，其IC₅₀值约为4.43μM(图1F，表4)。

实施例3化合物T521对Wee1A磷酸化多肽介导的竞争ELISA实验

本活性测定采用Wee1A磷酸化多肽介导的竞争ELISA实验进行。

测定原理：

Wee1A Phosphopeptide(C-EEEGFGSSpSPVKSPAAP-OH)是人工合成的Plk1 PBD的底物Wee1磷酸化模拟肽(SpS motif)，其可以与Plk1 PBD蛋白发生特异结合反应。Wee1APeptide中的Cysteine巯基可与96孔板表面的马来酰亚胺基团发生共价反应，进而固定含有巯基的生物大分子或多肽。

测定方法：

100μL/孔4μM Wee1A Peptide包被板子，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，每次2min；加入200μL/孔Blocking Buffer封闭，37℃2h；PBST洗涤3次，每次2min；在0.4μM Plk1 PBD溶液中分别加入终浓度为400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.56μM的小分子化合物T521，以加入2μL DMSO组作为对照，将上述反应体系于室温反应45min，然后以100μL/孔依次加入到封闭后的包被Wee1A peptide的96孔板中(设立3组复孔)，37℃×60min PBST洗涤3次，每次2min；加入100μL/孔Mouse Anti-His Primary Antibody(1:2000)，37℃孵育60min；PBST洗涤3次，每次2min；加入100μL/孔Goat-anti-Mouse IgG-HRPSecondary Antibody(1:2000)，37℃孵育60min；PBST洗涤3次，每次2min；加入100μL/孔TMBSubstrate Solution，37℃避光反应5min；加入50μL/孔2M H₂SO₄终止反应；以多功能酶标仪进行OD₄₅₀检测并分析数据。

在Wee1A peptide介导的竞争ELISA实验中，发现与DMSO对照组相比，随着T521浓度的逐渐升高，与包被的Wee1A peptide结合的Plk1 PBD蛋白逐渐减少，导致OD₄₅₀逐渐减低(图1D)。上述结果表明，T521通过结合Plk1 PBD蛋白而阻断其与Wee1A Peptide的相互作用。

实施例4化合物T521阻断GST-Map205^PBM和Plk1 PBD相互作用

本活性测定采用的竞争ELISA实验进行。

测定原理：

Drosophila Map205(Microtubule-associatedprotein 205)是一类分布于微管并广泛参与细胞有丝分裂调控过程的大分子蛋白。Map205通过PBM结构域与PBD结构域相互作用，在有丝分裂间期和胞质分裂过程中将Plk1“锚定”在微管上，在间期和M期转化进程中发挥重要的调控作用。在Map205的作用下，实现了Plk1生物学活性在细胞内的精细调控和Plk1在微管的亚定位。但是，Plk1PBD与Map205的相互作用是非磷酸化依赖的相互作用，Map205也是迄今为止发现的唯一一个以非磷酸化形式与Plk1 PBD相互作用的底物蛋白。鉴于Map205^PBM和其他磷酸化底物蛋白(Wee1A、Cdc25C等)相比的原核表达优势和实验室现有条件，采用操作简便的原核表达体系进行GST-Map205^PBM(276-325aa)的高效表达与快速纯化，建立模拟底物蛋白Map205^PBM介导的竞争ELISA实验，确证小分子抑制剂T521能否有效地靶向结合Plk1 PBD而阻断Map205^PBM/Plk1 PBD的相互作用。

测定方法：

(1)Map205^PBM的原核表达与分离纯化

从GenBank检索Map205^PBM(Residues 276-325aa)的基因序列，在目的基因片段两端各加入BamHⅠ(gga tcc)和XhoⅠ(ctc gag)酶切位点并进行目的基因片段的人工合成。合成后的基因片段在酶切后，直接连接pGEX-4T-1表达载体；将上述构建的pGEX-4T-1-Map205PBM重组质粒转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，随机挑取的单菌落接种于5mL AmpRLB液体培养基于37℃震荡培养过夜，以终浓度20％的甘油于-80℃保存菌种备用；将活化的GST-Map205PBM重组工程菌10μL接种于5mL AmpRLB液体培养基于37℃震荡培养10h后，再将其转接于200mL AmpRLB液体培养基中，37℃震荡培养，生长至OD₆₀₀≈0.9左右时，加入0.5mM IPTG，37℃诱导4h，4℃3300rpm×30min收集菌体沉淀。将收集的菌体沉淀重悬于10mL TBS后，置于冰上并以超声波裂解菌体，待菌体悬液澄清后结束裂解，4℃12000rpm×30min离心，收集裂解上清液；裂解后的上清液进行饱和硫酸铵分级沉淀后，再采用琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)层析柱进行分离纯化。分离纯化后的GST-Map205PBM进行透析，最后进行GST-Map205PBM蛋白浓度测定。

(2)GST-Map205^PBM介导的竞争ELISA实验进行

100μL/孔10μg/mL GST-Map205^PBM包被板子，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，每次2min，再加入200μL/孔Blocking Buffer，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次2min；3μg/mL Plk1 PBD溶液中分别加入终浓度为400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.56μM的小分子化合物T521，以加入2μL DMSO组作为对照，将上述反应体系于室温反应45min，然后以100μL/孔依次加入到封闭后的包被GST-Map205PBM的96孔板中(设立3组复孔)，37℃反应45min；PBST洗涤3次，每次2min；加入100μL/孔Mouse Anti-His Primary Antibody(1:2000)，37℃反应45min；PBST洗涤3次，每次2min；加入100μL/孔Goat-anti-Mouse IgG-HRPSecondary Antibody(1:2000)，37℃反应45min；PBST洗涤3次，每次2min；加入100μL/孔TMBSubstrate Solution，37℃避光反应5min(蓝色)；加入50μL/孔2M H₂SO₄终止反应(黄色)，以多功能酶标仪进行OD₄₅₀检测并分析数据。

在GST-Map205^PBM介导的竞争ELISA实验中，发现与DMSO对照组相比，随着T521浓度的逐渐升高，与包被的GST-Map205^PBM结合的Plk1 PBD蛋白逐渐减少，导致OD₄₅₀逐渐减低(图1E)。上述结果表明，小分子抑制剂T521可以有效地阻断GST-Map205^PBM与Plk1 PBD的相互作用。

实施例5小分子抑制剂T521的成药性初步评价

利用ADMET Predictor6.0(Pharmogo Co.,Ltd.)软件进行。

测定原理：

ADMET(药物的吸收,分配,代谢,排泄和毒性)药物动力学方法是当代药物设计和药物筛选中十分重要的方法。药物早期ADMET性质研究主要以人源性或人源化组织功能性蛋白质为“药靶”，体外研究技术与计算机模拟等方法相结合，研究药物与体内生物物理和生物化学屏障因素间的相互作用。药物早期ADME/T性质评价方法可有效解决种属差异的问题，显著地提高药物研发的成功率，降低药物的开发成本，减少药物毒性和副作用的发生，并能指导临床合理用药。

A：Absorption：药物从作用部位进入体循环的过程

D：Distribution：药物吸收后通过细胞膜屏障向各组织、器官或者体液进行转运的过程

M：Metabolism(Biotransformation)：药物在体内受酶系统或者肠道菌丛的作用而发生结构转化的过程

E：Excretion：药物以原型或者代谢产物的形式排出体外的过程

T：Toxcity：药物对机体的毒性

作用：药物筛选(Drug screening)药物设计(Drug design)药物合成(Drugsynthesis)评价制剂(Drug formulation/Biopharmaceutics)中草药研究(TCM herbsresearch)；特点：1基于细胞或生物大分子的分析方法：小样品、高内涵和高通量分析能力；能够阐明药物性质的分子机理；建立结构-药物性质定量构效关系2人源材料的应用

测定方法：

利用ADMET Predictor6.0(Pharmogo Co.,Ltd.)软件对小分子抑制剂T521进行ADMET中主要的药理学性质进行了初步的预测分析。

小分子抑制剂T521药理学相关的主要理化性质预测的数据(表2)表明，小分子化合物T521可能具有较低的血浆蛋白结合率和血脑屏障通透性，虽具有一定的肝毒性但其CYP450抑制作用较低并具有适中的脂溶性，表明，T521具有成为成药先导化合物的开发潜力。

表2

实施例6小分子抑制剂T521与Plk1 PBD结合方式的研究

本活性测定采用等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)。

测定原理：

ITC(Isothermal Titration Calorimetry)是一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2℃-80℃，滴定池体积1.43ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液，而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。用途广泛，包括：蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。

测定方法：

将ITC200的样品池和滴定注射器清洗干净，通过水滴水的实验观察噪音水平，确认其是否清洗干净。滴定实验使用的Plk1 PBD样品以PBS透析后配成浓度为30μM的Plk1PBD滴定液，同时全部滴定实验操作中均以PBS为滴定缓冲液，反应温度25℃；取出进样针，检查是否干净，并用缓冲液润洗3次。用进样针慢慢吸取300μL Plk1 PBD(30μM)样品，小心去除针管中的气泡。将进样针垂直插入样品池，直到针头触到样品池底部，然后将进样针略微提起约1mm，缓慢匀速向下推注射器活塞，直至样品池金属管口有溢出。将进样针进行几次连续的小幅度的吹打，将样品池内可能存在的气泡赶出。慢慢地将进样针抽出，吸走金属管口处的溢出的样品。用同样的方法在参比池中加入超纯水；将约60μL小分子化合物T521(1mM)样品加入PCR管中，将PCR管的管盖打开并固定在卡槽中，使用Syringe Fill命令对滴定注射器进行加样。加样完毕后，将滴定注射器放入样品池中；按照控制软件的操作要求，在Advanced Experimental Design模式下，本滴定实验主要参数设置如下：CellTemperature 25℃；Reference Power 5μcal/s；Initial Delay 60s；Cell Concentration30μM；Stirring Speed 1000RPM；Volume 1.5μL；Duration 3s；Spacing150s。使用同样的设置，用同样的样品滴定PBS缓冲液作为空白对照。最后，以ORIGIN 7.0软件(Origin Lab)进行实验数据分析并拟合滴定曲线。

以1mM小分子抑制剂T521对30μM Plk1 PBD蛋白进行滴定。在本滴定实验过程中，观察到了放热现象的产生。这说明，在其相互作用的过程中的确有由于氢键的较快速生成而出现的能量变化。在不断调整并优化实验体系后，在每一次的滴定实验完毕后，都没有观察到滴定热量曲线的平台期。产生这种现象的原因可能与T521/Plk1 PBD在相互作用过程中，水桥式氢键较慢的生成速率有关。

实施例7小分子抑制剂T521时间、温度依赖性抑制实验

依然采用荧光偏振(FP)的方法，除各反应的孵育时间为10min、20min、40min、60min、80min、100min(时间依赖性)和各反应的反应温度为20℃、25℃、30℃(温度依赖性)外，其余方法步骤与实施例2相同。

结果表明，小分子抑制剂T521的抑制作用具有明显的反应时间依赖性(图2A)。随着小分子抑制剂T521与Plk1 PBD反应时间的不断延长，其对Plk1 PBD与FITC-Probe结合的抑制作用也不断增强，表观IC₅₀逐渐减小(表3)。小分子抑制剂T521的抑制作用还具有明显的反应温度依赖性(图2B)。随着小分子抑制剂T521与Plk1 PBD反应温度的不断升高，其对Plk1 PBD与FITC-Probe结合的抑制作用也不断增强，表观IC₅₀逐渐减小(表3)。

表3

实施例8小分子抑制剂T521/Plk1 PBD结合模式的质谱法鉴定实验

本实验以MALDI-TOF/TOF质谱学方法鉴定Plk1 PBD与小分子化合物T521的结合模式，根据Plk1 PBD与饱和量的小分子化合物T521反应前后的分子量的变化即可判断其结合模式。

实验样品的制备：

样品①：含0.70mg/mL(20μM)Plk1 PBD的PBS溶液；

样品②：10μM Plk1 PBD+500μM T521(MW:395.44)室温孵育1h后的反应体系溶液。

各取2μg上述样品分别以C4-Zip-Tip脱盐后，收集样品(～10μL)。各取1μL样品再加入等量的芥子酸(sinapinic acid)均匀混合，然后以MALDI-TOF/TOF(UltrafleXtreme,Bruker)在2,000amu/s的条件下采集数据，上述采集的数据再以Flex Analysis(Bruker)软件进行数据分析并计算上述样品中Plk1 PBD蛋白的精确分子量，比较各样品中的Plk1 PBD蛋白分子量的变化即可推断Plk1 PBD/T521的结合模式。在上述实验中，我们以MALDI-TOF/TOF质谱法对小分子抑制剂T521/Plk1 PBD结合模式进行了鉴定与分析。与对照组样品①相比，样品②中的Plk1 PBD蛋白的分子量并没有发生明显的改变，Plk1 PBD蛋白与小分子化合物T521并没有发生共价键式结合反应(图2C)。上述实验表明，小分子抑制剂T521与Plk1PBD以非共价键的作用方式进行了牢固而紧密的结合。

实施例9小分子抑制剂T521/Plk1 PBD结合动力学实验

将终浓度2μM、4μM和8μM的小分子抑制剂T521按照下述方法进行实验：

30μL 400nM Plk1 PBD+0.3μL 200μM/400μM/800μM Compound T521室温缓慢振摇，孵育X min→加入30μL 60nM FITC-Probe室温缓慢振摇，避光孵育15min→检测mP值并以GraphPad Primer 5拟合曲线并确定小分子抑制剂T521抑制率与反应时间的关系，以此实验数据反映小分子抑制剂T521/Plk1 PBD复合物的解离/聚合情况。X min指各反应的孵育时间为10min、20min、40min、60min、80min、100min和120min。

由于反应时间的限制，将反应时间终点设置到120min。从反应时间10min到反应时间120min，随着反应时间的不断延长，T521的抑制率也随之发生明显的升高。其中4μM和8μM的T521在反应时间70min至120min时，其抑制率始终维持在90％～97％，在反应的时间终点依然没有发现T521/Plk1 PBD复合物的明显解离(图2D)。上述实验说明，小分子抑制剂T521与Plk1 PBD的相互结合过程是一个典型的慢速结合、慢速解离的“慢上慢下”过程。

实施例10分子对接

利用Discovery Studio 4.0软件(Designed by Accelrys Inc.San Diego,CA)软件进行。

测定原理：

分子对接(Molecular Docking)是指配体与受体之间通过能量匹配和几何匹配而互相识别的过程，其主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用力、范德华力等。近年来，随着计算机辅助药物设计技术的飞速发展，分子对接技术已成为基于结构的药物设计和计算机辅助药物设计的重要方法之一。Discovery Studio 4.0软件(Designed by AccelrysInc.San Diego,CA)是目前全球应用最为广泛的计算机辅助设计平台之一，其在计算分子模拟和药物设计领域都有着极其广泛的应用。

Discovery Studio 4.0软件有多个模块，主要功能包括：蛋白质的表征(包括蛋白质-蛋白质相互作用)、同源建模、分子力学计算、分子动力学模拟、基于结构药物设计(包括配体-蛋白质相互作用、全新药物设计和分子对接)、基于小分子的药物设计(包括定量构效关系、药效团、数据库筛选、ADMET)和组合库的设计与分析等。

测定方法：

在以Discovery Studio 4.0软件进行的小分子抑制剂T521和Plk1 PBD的分子对接中，我们选择PDB(Protein Data Bank)中4H71结构，并根据其结合的Poloxin及TQ化合物进行小分子化合物活性中心的遴选和定义，确定选择直径为

使用Discovery Studio 4.0软件将小分子抑制剂T521与Plk1 PBD的活性中心(PDB code 4H71)进行分子对接。小分子抑制剂T521完全“锚定”在由PB1和PB2形成的狭小“沟槽”内并趋于稳定，T521分子结构中的苯磺酰基的氧原子与PBD结构中的水化His538、Lys540侧链形成较为牢固的氢键。His538、Lys540侧链与磷酸肽pThr/pSer形成的“钳式”(Pincer-like bond)氢键结构对于PBD与磷酸肽的结合是极其重要的。另外，T521分子结构中的苯环、噁唑环可以与PBD结构Arg557产生π键(Pi bond)，T521还可以与周围诸多活性氨基酸形成范德华力(Van der Waals interaction)。上述所形成的化学键的综合作用，使小分子抑制剂T521牢固地“锚定”于PBD的“沟槽”内，进而阻断PBD与其磷酸化底物蛋白的结合(图6)。分子对接结果也再次表明了小分子抑制剂T521以非共价的竞争方式结合Plk1 PBD。

实施例11小分子抑制剂T521的细胞毒性测定

利用MTT比色实验进行。

测定原理：

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在560nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。

测定方法：

(1)从保存细胞冻存管的液氮中取出细胞冻存管后，迅速投入37℃水浴中，轻轻摇动使其尽快融化。然后从37℃水浴中取出细胞冻存管，用乙醇消毒后，1000rpm×5min离心，小心地吸去上清液，再加入1mL培养液重悬细胞并再次离心。用生长培养基适当稀释后，接种培养瓶，接种密度以5×10⁵/mL为宜。将细胞培养瓶放入CO2培养箱37℃、5％CO2静止培养。次日更换培养液，继续培养备用。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化单层贴壁培养的细胞，用含10％FBS的生长培养基配成单细胞悬液，以4～5×103/mL接种于96孔细胞培养板，每孔体积200μL，同时96孔细胞培养板的边缘孔以无菌PBS填充，尽量避免边缘效应。

(3)将上述接种细胞的96孔细胞培养板放入CO2培养箱，在37℃、5％CO2条件下静止培养24小时至对数生长期。

(4)准备从50μM开始以生长培养基2倍梯度稀释的化合物T521，共制备10个梯度浓度(50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.56μM、0.78μM、0.39μM、0.19μM、0.09μM)，各梯度浓度的稀释液1mL。

(5)小心地吸弃各孔内的生长培养基后，将化合物T521的上述10个梯度浓度分别加入对应96孔细胞培养板，每孔200μL，每个浓度设置5组复孔并做好相应的标记。以加入DMSO组为阴性对照，只含正常培养基组为阳性对照，各组分别设置5组复孔。

(6)在37℃、5％CO2培养条件下，化合物T521与细胞继续共培养48小时。尔后小心地吸弃各孔内生长培养基，每孔各加入200μL新鲜生长培养基，继续培养24小时。

(7)培养24小时后，每孔加入MTT溶液22μL，37℃避光培养4小时后终止培养。小心地吸弃各孔内培养基后，每孔加入150μL DMSO，避光震荡15min，使甲瓒充分溶解呈紫色。

(8)选择560nm波长，在多功能微孔板检测仪上测定各孔OD值，记录并保存数据，以GraphPad Prism5拟合化合物T521在各细胞株的生长抑制曲线并计算其EC₅₀值。

本实验选用本室保存的12株临床常见的人癌细胞系和3株正常人源细胞，以MTT比色法进行小分子抑制剂T521的细胞毒性评价。发现小分子抑制剂T521对12株肿瘤细胞具有明显的细胞毒性，EC50值在1～5μM。但是，小分子抑制剂T521对MRC5、HEK-293和L02代表的正常细胞的细胞毒性与肿瘤细胞的细胞毒性相比并没有显著差别，其EC₅₀值在3～10μM(表4)。上述数据表明，小分子抑制剂T521在体外对肿瘤细胞和正常细胞具有等同的细胞毒性。

表4

实施例12小分子抑制剂T521对Hela细胞周期的影响

利用流式细胞仪和Western blot进行。

测定方法：

周期同步化的HeLa细胞是后续FACS和Western Blot进行细胞周期分析的基础，周期同步化方法如下：

(1)将HeLa细胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁵/mL接种于6孔细胞培养板，接种量2mL/孔。将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下培养24h至指数生长期。

(2)细胞贴壁后，小心地弃掉生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。然后加入终浓度2mM Thymidine的生长培养基，在37℃、5％CO2条件下继续培养12h。

(3)小心地弃掉含2mM Thymidine的生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。更换新鲜的生长培养基，在37℃、5％CO₂条件下继续培养12h。

(4)轻轻地弃掉正常生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。然后再次加入终浓度2mM Thymidine的生长培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养12h后，此时所有的HeLa细胞的周期将被阻滞在G1/S期。

本案例将同步化的HeLa细胞以小分子抑制剂T521作用24h，在各设置的时间点收集细胞并与DMSO对照组比较，以FACS和Western Blot进行HeLa细胞周期的综合分析。

以FACS进行HeLa细胞周期的综合分析：

(5)在上述含有细胞周期同步化的HeLa细胞6孔细胞培养板中，分别加入含有10μM小分子抑制剂T521的新鲜培养基继续培养，在0h、8h、12h、16h、20h和24h时间点分别收集细胞。在Western Bolt实验中，另加入40ng/mL诺考达唑作用16h作为标准M期阻滞的阳性对照。

(6)在上述各时间点收集的细胞分别以4℃预冷的PBS漂洗细胞3次并以0.25％胰酶消化细胞，再以4℃预冷的PBS重悬细胞，1000rpm×6min离心并收集细胞。

(7)小心地弃掉离心后的细胞上清液，缓慢加入4℃预冷的含70％乙醇的PBS固定液1mL充分悬浮细胞，4℃固定30min。

(8)固定后的细胞以1200rpm×6min离心并收集细胞，小心地弃掉乙醇固定液。尔后加入100μL PI/RNase A溶液并充分混匀，37℃避光孵育30min。

(9)各样品做好对应的标记后，将细胞过滤到BD流式细胞管，各管再补加400μLPBS后，以FACS进行分析。

(10)将含5μM、10μM和15μM小分子抑制剂T521的新鲜培养基加入到周期同步化的HeLa细胞中并在作用16h后收集细胞，固定步骤及PI染色步骤同上所述，以FACS进行量效关系分析。

或，以Western Blot进行HeLa细胞周期的综合分析：

(5)将周期同步化的HeLa细胞以5μM、10μM和15μM小分子抑制剂T521作用16h后，收集细胞。各收集的细胞样品分别加入60μL RIPA细胞裂解液(含100μg/mL PMSF)，充分悬浮细胞，冰浴30min，12000rpm×30min离心，小心地吸取上清液并做好对应的标记，再以BCA法进行裂解蛋白的定量。裂解蛋白定量后，将各样品的蛋白裂解液浓度调整为2mg/mL，每次上样量约为30～40μg/Lane。

(6)准备15％SDS-PAGE，上样量30μg/Lane。SDS-PAGE电泳结束后，将聚丙烯酰胺凝胶和2张3mm Bio-Rad滤纸放入4℃预冷的1×转移缓冲液中浸泡2～5min。

(7)将裁剪的与胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇润湿30s，再用蒸馏水洗1min，然后置于上述1×转移缓冲液浸泡2min。

(8)在Bio-Rad半干法转膜仪的正极上放置一张平衡过的滤纸，将PVDF膜整齐地放在滤纸上，然后将聚丙烯酰胺凝胶平铺于PVDF膜上，最后在该凝胶上面再整齐地放置另一张平衡过的滤纸。用洁净的试管小心地轻压，以去除夹层中的气泡，然后以上述少许1×转移缓冲液润湿周围，使其保持一定的导电性。最后放置转膜仪的负极并压紧、压实。

(9)Western Blot电转条件设置：恒流转膜0.2A×30min。

(10)电转结束后，用镊子小心地取出PVDF膜浸入TBST洗涤1次，再用镊子小心夹出并室温晾干后，依据预染Marker标示分子量和目的蛋白分子量适当裁剪PVDF膜并做好相应的标记。

(11)将裁剪的PVDF膜放入含5％Milk-TBST的封闭液中室温缓慢振摇2h进行封闭。

(12)封闭结束后，取出PVDF膜，将其放入到TBST中漂洗3次，每次10min。漂洗完毕后将标记好的PVDF膜放入孵育盒中进行一抗孵育反应。

(13)按照相关抗体说明书，以封闭液稀释上述抗体并将抗体稀释液置于孵育盒中，室温缓慢振摇1h后，4℃过夜。

(14)从孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗完毕后再将PVDF膜放入孵育盒中进行二抗孵育反应。

(15)用封闭液稀释对应的HPR-Secondary Antibody(WB 1:2000)并将其置于含有对应一抗孵育完毕的PVDF膜的孵育盒中，室温缓慢振摇1～2h。

(16)从孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。然后进行显色反应。

(17)显色反应：在PVDF膜正面(印记目的蛋白一面)加入适量增强型HRP底物化学发光液(按照说明书配制A:B＝1:1)，立即置于凝胶成像仪中曝光5～10s后成像。

在流式实验中发现10μM小分子抑制剂T521可以明显地使周期同步化的HeLa细胞发生G2/M期阻滞，延缓细胞周期的进程。在HeLa细胞周期同步化后的8h内，各组细胞均能通过S期而开始进入G2/M期，这表明小分子抑制剂T521对HeLa细胞的S期没有产生显著的影响；小分子抑制剂T521作用于周期同步化的HeLa细胞16h时，与DMSO对照组相比，其表现出极其明显的G2/M期阻滞作用，40％左右的HeLa细胞发生明显的G2/M期阻滞；在整个细胞周期过程中，10μM小分子抑制剂T521始终能使20％左右的HeLa细胞发生G2/M期阻滞。但是随着细胞周期的持续进行，仍然会有一部分细胞重新回归到正常的细胞周期，这可能与小分子抑制剂T521中等强度的抗肿瘤活性相关(图3A、表5)。

表5

依据上述实验结果，选用16h作为G2/M期阻滞的比较时间点。当5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521作用于周期同步化的HeLa细胞16h时，与DMSO对照组相比，随着小分子抑制剂T521剂量的不断增加，HeLa细胞的G2/M期比率逐渐升高(图3)。与DMSO对照组的G2/M期比率2.87％相比，5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521作用于周期同步化的HeLa细胞16h后，HeLa细胞的G2/M期比率分别达到9.82％、39.86％和55.59％，HeLa细胞的G2/M期比率呈剂量依赖性的增加趋势(图3B、C)。上述数据表明，小分子抑制剂T521对HeLa细胞的G2/M期阻滞作用具有明显的剂量依赖性。

Western Blot实验中，我们发现5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521作用16h的HeLa细胞中Plk1、Cyclin B1、pHH-3随着T521剂量的不断增加而逐渐积聚。其中，15μM小分子抑制剂T521引发的周期阻滞中含有大量的M期细胞(图3D)。Plk1、CyclinB1、pHH-3在HeLa细胞周期中的大量积聚表明，小分子抑制剂T521引发了HeLa细胞的G2/M期阻滞。

综上所述，小分子抑制剂T521可以引发HeLa细胞发生G2/M期阻滞。

实施例13小分子抑制剂T521对HeLa细胞Plk1亚细胞定位、染色体整列、中心体成熟及纺锤体组装

利用激光共聚焦显微镜进行。

测定方法：

(1)将HeLa细胞以0.25％胰酶消化后，轻轻吹打为均匀的单细胞悬液。以3×10⁴/mL接种于6孔细胞培养板(每孔各含3片平铺的无菌盖玻片)，接种量2mL/孔。将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下继续培养24h至指数生长期。

(2)将上述HeLa细胞周期同步化。尔后在周期同步化的HeLa细胞中各加入4μM小分子抑制剂T521和DMSO(对照组)。做好相应标记后，将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下继续培养10h。

(3)取出上述细胞培养板，以PBS小心地清洗1次。HeLa细胞以甲醇于-20℃固定15min。

(4)小心地吸弃甲醇固定液后，HeLa细胞以PBST室温洗涤3次，每次10min。洗涤完毕后以封闭液进行室温封闭60min。

(5)以封闭液稀释一抗反应混合液(Primary Antibody)：

第1组：Anti-hPlk1 Mouse MAb(IF 1:1000)+Anti-γ-Tubulin Rabbit PAb(IF1:1500)

第2组：Anti-α-Tubulin Mouse MAb(IF 1:800)+Anti-γ-Tubulin Rabbit PAb(IF 1:1500)

将上述抗体稀释液以500μL/孔的量加入到封闭后的6孔细胞板中，室温缓慢振摇孵育60min。另外，以封闭液孵育组作为空白对照，用以调整和校正激光共聚焦显微镜成像的荧光强度及背景值。

(6)小心地吸弃上述一抗稀释液后，HeLa细胞以PBST室温洗涤3次，每次15min。

(7)以封闭液稀释二抗反应混合液(Secondary Antibody)：

Alex Fluor-488Goat Anti-Mouse IgG(IF 1:1000)+Alex Fluor-594DonkeyAnti-Rabbit IgG(IF1:1000)

将上述抗体稀释液以500μL/孔的量加入到上述洗涤后的6孔细胞板中，室温避光孵育60min。

(8)小心地吸弃上述二抗稀释液后，HeLa细胞以PBST室温避光洗涤3次，每次15min。

(9)将少许(约50μL)2μg/mL的DAPI溶液均匀滴加到各盖玻片上，避光孵育90s。以PBST室温避光洗涤10min。

(10)封片：

将一滴ProLong Gold Antifade Mountant滴加于已标记样品名称的双凹载玻片上，以镊子小心地夹取对应的盖玻片并以滤纸吸去盖玻片表面及边缘的水，将盖玻片黏附细胞面向下并小心地将其放置于上述滴加封片剂的双凹载玻片上，小心地按压确数次确保其贴牢。将上述封片完毕的载玻片放置于切片盒后，4℃避光保存。

(11)以空白对照组调整和校正激光共聚焦显微镜成像的荧光强度及背景值后，化合物T521组和DMSO组样品以Olympus FV-1000激光共聚焦显微镜在油镜(×600)下分析并成像，最后以FV10-ASW 3.0Viewer(Olympus,Japan)软件处理图像。

激光共聚焦实验中，4μM小分子抑制剂T521作用于周期同步化的HeLa细胞10h后，通过Olympus FV-1000激光共聚焦显微镜分析，与DMSO对照组相比，小分子抑制剂T521可以明显地引发Plk1亚细胞定位(动粒)改变、染色体整列损伤及中心体片段化(图4B、C)。在整个细胞有丝分裂期，Plk1依赖PBD使其分布于中心体、动粒及赤道板。Plk1对中心体成熟及双极纺锤体形成进而完成胞质分裂的进程是必须的。与DMSO对照组相比，在小分子抑制剂T521组中Plk1明显地呈弥散性分布，Plk1在动粒的定位显著地减少。Plk1在动粒定位的减少也将使微管-动粒稳定连接形成受阻，引发染色体整列损伤。另外，在小分子抑制剂T521组中也有较多片段化的中心体的形成，中心体片段化将极大地影响中心体分离及中心体成熟，最终导致纺锤体组装障碍，加剧染色体整列损伤。

在上述实验中，小分子抑制剂T521在引发Plk1亚细胞定位改变及中心体片段化的同时，同样更加明显地引发了染色体整列损伤及纺锤体组装障碍。正是由于小分子抑制剂T521通过干扰Plk1亚细胞定位而抑制Plk1生物学活性，使一大部分染色体不能通过动粒与纺锤体结合而产生稳定的微管-动粒连接，进而导致染色体整列损伤。染色体整列损伤将极大地活化纺锤体组装检查点(Spindle Assembly Checkpoint,SAC)，抑制后期促进复合物(Anaphase Promoting Complex,APC)的活性，引发细胞周期阻滞，延迟细胞周期进程。在小分子抑制剂T521组中由于中心体片段化，这也将导致纺锤体组装障碍，加剧上述染色体整列损伤及细胞周期阻滞。

综上所述，小分子抑制剂T521通过影响Plk1亚细胞定位而抑制Plk1生物学活性，进而导致染色体整列损伤、中心体片段化及纺锤体组装障碍而发挥抗肿瘤效应。上述实验数据也进一步证实了Plk1 PBD是小分子抑制剂T521发挥抗肿瘤效应的一个重要的潜在靶点。

实施例14小分子抑制剂T521对HeLa细胞凋亡的影响

利用Annexin V/PI双染法和Western Blot进行。

测定方法：

Annexin V/PI双染法

(1)将HeLa细胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁶/mL接种于6孔细胞培养板，接种量2mL/孔。将细胞板置于37℃、5％CO2条件下培养24h至指数生长期。

(2)上述HeLa细胞培养24后，以无菌PBS清洗细胞3次，更换分别含有DMSO、5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521的新鲜培养液。做好相应标记后，将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下继续培养24h。

(3)取出上述细胞培养板，以PBS小心地漂洗1次，再以0.25％胰酶消化细胞，1000rpm×5min离心，收集细胞。

(4)用去离子水按1:4稀释结合缓冲液(1×结合缓冲液：10mM Hepes/NaOH、140mMNaCl,2.5mM CaCl₂pH7.4)。

(5)将上述消化的HeLa细胞以4℃预冷的PBS洗涤2次，用250μL 1×结合缓冲液悬浮细胞，调节其浓度为5×10⁶/mL。

(6)取100μL的细胞悬液(细胞数约为5×10⁵)于EP管中，再加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488，室温避光孵育30min。

(7)在上述反应体系中再加入5μL PI，室温避光孵育5～10min。

(8)将上述细胞悬液过滤到BD流式管中，再补加400μL PBS并做好对应的标记，立刻以流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测和数据统计分析。

Western Blot方法进行断裂的PARP检测，对HeLa细胞的晚期凋亡进行更进一步的确证。

(1)将HeLa细胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁶/mL接种于6孔细胞培养板，接种量为2mL/孔。将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下培养24h至指数生长期。

(2)将上述HeLa细胞培养24后，以无菌PBS漂洗细胞3次，更换分别含有DMSO、5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521的新鲜培养液。做好相应标记后，将细胞板置于37℃、5％CO2条件下继续培养24h。

(3)取出上述细胞培养板，将HeLa细胞以PBS小心漂洗1次，以0.25％胰酶消化细胞，1000rpm×5min离心，收集细胞。

(4)相关抗体使用方法：

Primary Antibody：Anti-PARP Rabbit Polyclonal Antibody(WB 1:1500)4℃孵育过夜；Secondary Antibody：Goat-anti-Rabbit IgG-HRP(WB 1:3000)室温孵育1h；ECL10s显像。

AnnexinⅤ/PI双染实验中，5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521作用HeLa细胞24h后，通过FACS检测，与DMSO对照组相比，随着小分子抑制剂T521剂量的不断增加，HeLa细胞的凋亡比率逐渐升高(图5A)。

与DMSO对照组相比，5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521作用于HeLa细胞24h后，HeLa细胞的早期凋亡率分别为3.66％、5.39％和22.37％，其早期凋亡率呈明显的递增趋势；HeLa细胞的晚期凋亡率分别为3.67％、12.7％到25.55％，其晚期凋亡率也依然呈明显的递增趋势。这些数据表明，小分子抑制剂T521可以明显地引发HeLa细胞发生大量的凋亡，并且其引发的细胞凋亡具有明显的剂量依赖性(图5B)。

Western Blot实验中，5μM、10μM、15μM小分子抑制剂T521作用HeLa细胞24h后，随着T521剂量的增加，PARP逐渐发生断裂并产生89kDa的PARP片段。与DMSO对照组相比，从5μM开始，HeLa细胞断裂的PARP逐渐增多；在15μM时，由于HeLa细胞的大量凋亡，断裂的PARP异常增多(图5C)。产生上述现象的主要原因是小分子抑制剂T521通过干扰Plk1亚细胞定位而影响Plk1的生物学活性，进而激活Caspase3使PARP发生大量的断裂，促使HeLa细胞发生大量的凋亡。

综上所述，小分子抑制剂T521可以引发HeLa细胞发生大量凋亡。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，而不用于对本发明保护范围的限制。

Claims (4)

1.式1所示小分子化合物T521在制备用于细胞学研究的制剂或用于治疗疾病的药物中的应用，所述的应用基于T521结合Plk1(Polo-like kinases1)PBD(Polo Box Domain)从而抑制Plk1与其配体结合的功能，所述的应用具体为：

(1)制备阻断Plk1与其配体结合的阻断剂的应用；

(2)制备阻滞细胞至G2/M期的细胞周期调节剂的应用；

(3)制备引发染色体整列损伤及纺锤体组装障碍的调节剂的应用；

(4)制备促进凋亡制剂的应用；

(5)制备抗肿瘤的药物的应用；

式1：5-乙基砜基-2-(4-氟苯基)-4-苯磺酰噁唑。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的配体为人工或天然配体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的配体为人工多肽Wee1A Peptide、或天然配体GST-Map205^PBM。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的制剂或药物包括，有效量的式1所示化合物以及必要的制剂辅料或药用辅料。