CN105030677A - 一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体抗菌剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗菌剂及药物制剂或者化妆品领域，具体涉及一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体抗菌剂及制备方法。本发明由柠檬桉精油，大豆卵磷脂，胆固醇，表面活性剂，壳聚糖和明胶制成柠檬桉精油纳米脂质体。其方法是将柠檬桉精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸干形成光滑的薄膜，加入水相介质和表面活性剂溶解膜状物并超声成乳，再分别与壳聚糖，明胶溶液搅拌均质均匀。通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的脂质体。本发明制备工艺重现性好，柠檬桉精油多层纳米脂质体包封率最高可达86.7%，且产品形态完整，粒径均一，具有良好的稳定性与抗菌性。

Description

一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体抗菌剂及制备方法

技术领域

本发明属于抗菌剂及药物制剂或者化妆品领域，具体涉及一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体抗菌剂及制备方法。

背景技术

柠檬桉（学名：Eucalyptuscitriodora，科名：桃金娘科，属名：桉属）原产于澳大利亚，20世纪20年代中期中国将其引进，目前在广东、广西、四川、云南等省区已有大量栽培；从柠檬桉叶中提取、纯化出的柠檬桉叶油，主要活性成分为香茅醛，这种精油具有令人愉快的香味，已在香精、香料、肥皂、化妆品及食品等行业中广泛使用；研究表明柠檬桉精油中的挥发性成分对植物病原性真菌有抑制效果，其中，香茅醛对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)具有比较明显的抑制效果，利用柠檬桉精油开发天然抗菌剂，对于食品的保鲜具有十分重要的意义。

国内外关于柠檬桉的专利申请很少；CN102942461A公开了一种柠檬桉油单离香茅醛的方法，CN102860303A公开了一种利用柠檬桉叶油提取废液制备蚊子驱避剂的方法，CN101880600A公开了一种提取柠檬桉叶挥发油及3,8-二醇的方法。

虽然柠檬桉精油具有较好的抗菌性能，但是柠檬桉精油的提取全部来自纯天然植物，不添加任何人工合成的防腐剂等，因此其化学成分极其脆弱，并会受到空气、阳光等自然环境的影响而变质，而且，柠檬桉精油中易挥发物质含量较高，在使用过程中极易挥发，从而会降低柠檬桉精油的使用率，造成资源浪费，因此有必要寻找有效地方法改善这些问题。

本专利发明了一种柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，纳米脂质体是一种由两性类脂质形成的具有类似生物膜双分子层的微型囊泡，因此，脂质体具有良好的生物相容性，并且纳米脂质体不会对柠檬桉精油的主要活性成分造成破坏；纳米脂质体能够有效地保护包裹在内的柠檬桉精油，避免了精油的挥发，而且减少了光对精油的作用，另外，纳米脂质体具有良好的靶向性,可以靶向到特定的细菌释放被包裹的精油，从而增加精油的杀菌性能和生物利用性；但由于脂质体的缓释作用，包裹精油的脂质体保质期受限，所以，本专利选用了壳聚糖和明胶制成稳定性高的多层脂质体，柠檬桉精油多层纳米脂质体的制备有效地提高了精油的利用率，延长了脂质体的贮藏期。

发明内容

本发明的目的是公开一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体及其制备方法，通过将柠檬桉精油包裹在多层纳米脂质体中，以实现减少柠檬桉精油在使用过程中的挥发，从而减少柠檬桉精油的浪费，达到长效抗菌与高效利用的目的。

一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，柠檬桉精油包裹在磷脂双分子层中，其特征在于：磷脂双分子层为第一层纳米脂质体，还设有第二层纳米脂质体，第二层由壳聚糖组成。

进一步地，所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：还设有第三层纳米脂质体，第三层由明胶组成。

进一步地，第二层纳米脂质体中壳聚糖的浓度为0.2mg/mL。

进一步地，第三层纳米脂质体中明胶的浓度为0.4mg/mL。

大豆卵磷脂、胆固醇是构成脂质体的组要成分，胆固醇均有调节膜流动性的作用，所以考察其两者的配比变化，对构成的脂质体分散性等参数有无影响；表面活性剂是增加脂质体稳定性；柠檬桉精油浓度是根据包封率来确定的；醋酸盐溶液的pH是为了最佳溶解壳聚糖；壳聚糖和明胶都可以增加稳定性。

本发明的制备方法是将柠檬桉精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸干形成光滑的薄膜，加入水相介质和表面活性剂组成的混合溶液溶解薄膜并超声成乳、离心后取上层液体过滤得到单层柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：将单层柠檬桉精油纳米脂质体与壳聚糖溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的双层柠檬桉精油纳米脂质体。

进一步地，将双层柠檬桉精油纳米脂质体与明胶溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的多层柠檬桉精油纳米脂质体。

进一步地，本发明的大豆卵磷脂和胆固醇的质量比例为5:1；表面活性剂、柠檬桉精油与胆固醇的质量比为：1:5:4，此条件下可以得到最高的包封率。

进一步地，表面活性剂为PVP，混合溶液中PVP的浓度为1.0mg/mL。

单层柠檬桉精油纳米脂质体与壳聚糖溶液的体积比为1:10；双层柠檬桉精油纳米脂质体与明胶溶液的体积比为1:10。

本发明中所述的有机溶剂是氯仿。

本发明中所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3.5~4.0。

所述的壳聚糖溶液为壳聚糖的醋酸盐溶液，浓度为0.2mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3.5~4.0，优选3.6，能够最佳溶解壳聚糖。

所述明胶溶液为明胶的醋酸盐溶液，浓度为0.4mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3.5~4.0。

本发明中脂质体的第一层是磷脂双分子层，即人工细胞膜层。

本发明中脂质体的第二层由壳聚糖组成，浓度为0.2mg/mL。

本发明中脂质体的第三层由明胶组成，浓度为0.4mg/mL。

附图说明

图1为柠檬桉精油纳米脂质体的包封率。

图2为柠檬桉精油纳米脂质体的粒径与多分散系数PDI。

图3为多层柠檬桉精油纳米脂质体荧光显微图。

图4为多层柠檬桉精油纳米脂质体原子力显微图。

图5多层柠檬桉精油纳米脂质体对大肠杆菌的抗菌性能。

图6多层柠檬桉精油纳米脂质体对金黄色葡萄球菌的抗菌性能。

表1为柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1多层柠檬桉精油纳米脂质体的包封率

1实验材料

大豆卵磷脂；BR；国药集团化学试剂有限公司。

胆固醇；AR；国药集团化学试剂有限公司。

三氯甲烷；AR；国药集团化学试剂有限公司。

柠檬桉精油；AR；法国florihana精油。

PVP；GR；国药集团化学试剂有限公司。

壳聚糖；BR；国药集团化学试剂有限公司。

明胶；BR；国药集团化学试剂有限公司。

2实验方法

1)单层柠檬桉精油纳米脂质体的制备

①　称取1g大豆卵磷脂，0.2g胆固醇和250mg的柠檬桉精油，加50mL氯仿使其溶解。

②　在旋转蒸发仪中蒸发至溶剂蒸干，蒸发温度为10~30℃，圆底烧瓶内壁会形成光滑的薄膜；然后将所得产品放入真空干燥箱中，30℃，真空状态下干燥24小时。

③　称取0.05g的PVP于醋酸盐缓冲液中，超声波条件下扩散，然后将PVP的醋酸盐缓冲液加入圆底烧瓶中超声波条件下进行水化。

④　将水化后的混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10s,间隙5s的频率粉碎30min。

⑤　将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体。

⑥　将所得液体用0.22μm滤膜进行过滤，得滤液，为单层柠檬桉精油纳米脂质体。

2)双层柠檬桉精油纳米脂质体的制备

①　按照上述单层柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，制备含250mg柠檬桉精油的单层纳米脂质体。

②　将单层柠檬桉精油纳米脂质体分散在含0.2mg/mL壳聚糖的醋酸盐溶液中混合均匀；单层柠檬桉精油纳米脂质体与壳聚糖的醋酸盐溶液的体积比1：10。

③　将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10s,间隙5s的频率粉碎30min。

④　将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体。

⑤　将所得液体用0.22μm滤膜进行过滤，得滤液，为双层柠檬桉精油纳米脂质体。

3）多层柠檬桉精油纳米脂质体的制备

①　按照上述双层柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，制备含250mg柠檬桉精油的双层纳米脂质体。

②　将双层柠檬桉精油纳米脂质体分散在含0.4mg/mL明胶的醋酸盐溶液中使其混合均匀；双层柠檬桉精油纳米脂质体与明胶的醋酸盐溶液的体积比为1：10。

③　将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10s,间隙5s的频率粉碎30min。

④　将所得产品进行离心，4000rpm，15min，取上层液体。

⑤　将所得液体用0.22μm滤膜进行过滤，得滤液，为多层柠檬桉精油纳米脂质体。

4）包封率的测定

用无水乙醇稀释柠檬桉精油，逐级稀释成浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的标准溶液，然后，分别吸取1μL标准溶液进行GC-MS分析，对其主要成分香茅醛的谱峰面积进行自动积分，绘制香茅醛峰面积-柠檬桉精油浓度标准曲线；首先取1mL柠檬桉精油纳米脂质体样品，13500rpm，离心3h，倒掉上清液。接着加入1mL乙醇破乳剂，超声3h，最后以10000rpm的转速离心15min，取上清液，用于GC-MS分析，制备好的脂质体样品，对精油主成分的峰面进行自动积分，再根据步骤1中绘制的标准曲线，计算出脂质体中植物精油的含量。

则：。

3柠檬桉精油纳米脂质体的包封率

包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标，也是脂质体能否发挥较普通制剂高效、低毒等特点的关键；由图1可看出，单层柠檬桉精油纳米脂质体的包封率为22.1%，双层柠檬桉精油纳米脂质体的包封率为47.3%，多层柠檬桉精油纳米脂质体的包封率最大，为86.7%，因此制备多层柠檬桉精油纳米脂质体可以明显提高脂质体的包封率。

实施例2多层柠檬桉精油纳米脂质体的粒径与多分散系数PDI

1实验材料

①　单层柠檬桉精油纳米脂质体。

②　双层柠檬桉精油纳米脂质体。

③　多层柠檬桉精油纳米脂质体。

2实验方法

用美国布鲁克海文仪器公司产的，型号为BI-9000的高浓度激光粒度仪测定柠檬桉精油纳米脂质体的粒径和多分散系数PDI值，所测样品放入样品池直接测量即可。

3柠檬桉精油纳米脂质体的粒径与多分散系数PDI

多分散系数PDI直接反映柠檬桉精油纳米脂质体的稳定性，因此是主要参考指标，脂质体的PDI在0~0.3范围内属于最好，在0.3~0.7范围内较差，但可以接受，当PDI>0.8时，不予考虑；如图2所示，单层柠檬桉精油纳米脂质体的粒径为157.8nm、PDI为0.298，双层柠檬桉精油纳米脂质体的粒径为189.4nm、PDI为0.259，多层柠檬桉精油纳米脂质体的粒径为252.3nm、PDI为0.185；多层柠檬桉精油纳米脂质体的多分散系数PDI最小，因此制备多层柠檬桉精油纳米脂质体可以明显提高脂质体的稳定性。

实施例3柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位

1实验材料

①　单层柠檬桉精油纳米脂质体。

②　双层柠檬桉精油纳米脂质体。

③　多层柠檬桉精油纳米脂质体。

2实验方法

用英国马尔文仪器有限公司生产的型号为ZetasirernanoZSZeta的电位仪测量，直接将待测脂质体样品放入电位仪中测量即可。

3柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位

表1柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位

柠檬桉精油纳米脂质体	Zeta电位
		单层	-21.5mV
双层	-30.2mV
		多层	-43.8mV

Zeta电位也可以直接反映柠檬桉精油纳米脂质体的稳定性，因此也是主要参考指标，脂质体的Zeta电位的绝对值越大说明脂质体越稳定性，Zeta电位的绝对值在0~30范围内属于不稳定，在大于30时脂质体较稳定性；如表1所示，三种柠檬桉精油纳米脂质体均带负电，单层柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位为-21.5mV，其绝对值小于30脂质体不稳定，双层柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位为-30.2mV，其绝对值大于30脂质体较稳定，多层柠檬桉精油纳米脂质体的Zeta电位为-43.8mV，其绝对值最大，脂质体最稳定。

实施例4多层柠檬桉精油纳米脂质体的荧光显微镜观察

1实验材料

多层柠檬桉精油纳米脂质体。

2实验方法

用德国徕卡仪器公司生产的型号为TCS-SP5的荧光显微镜，直接将待测脂质体样品放入荧光显微镜中观察。

荧光显微镜样品前处理方法：

（1）多层柠檬桉精油纳米脂质体样品的制备（A液）：取1mL柠檬桉精油脂质体，0.5mL甲醇和0.5mL氯仿混合。

（2）荧光染料DIL的制备（B液）：0.1mL的DIL溶于0.1mL的二氯甲烷中。

（3）取A液0.5mL和B液50μL放入小离心管混合，震荡均匀。

（4）将上述混合液体放入真空干燥箱，干燥一夜。

（5）取已干燥的离心管，加入0.5mL超纯水，在振荡器上震荡30min。

（6）室温放置3h。

（7）滴在载玻片上进行观察。

3多层柠檬桉精油纳米脂质体的荧光显微镜观察

由以上荧光显微镜拍摄到的显微照片可以看出，脂质体染色后，呈现圆形，分散较均匀。

实施例5多层柠檬桉精油纳米脂质体的原子力显微镜观察

1实验材料

多层柠檬桉精油纳米脂质体。

2实验方法

用美国安捷伦科技公司生产的型号为Agilent5500的原子力显微镜，直接将待测脂质体样品放入原子力显微镜中观察，原子力前处理方法是取植物精油脂质体样品10μL滴在云母片上10min，然后用移液枪吸除表面的液体，再滴上10μL超纯水30s，重复清洗3次，通风处静置3h，放置于原子力显微镜下观察。

3多层柠檬桉精油纳米脂质体的原子力显微镜观察

由以上原子力显微镜拍摄到的显微照片可以看出，脂质体呈现圆形，分散较均匀。

实施例6多层柠檬桉精油纳米脂质体的抗菌性能

1实验材料

①　单层柠檬桉精油纳米脂质体（保存7天、30天、60天、90天）。

②　双层柠檬桉精油纳米脂质体（保存7天、30天、60天、90天）。

③　多层柠檬桉精油纳米脂质体（保存7天、30天、60天、90天）。

2实验方法

采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为模式菌测定柠檬桉精油纳米脂质体的残存菌数，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种到液体培养基中，分别置于气浴摇床中在37℃、150rpm条件下震荡培养24~48h，获得对数生长期的细菌，取适量处于对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别加入含有一定量无菌磷酸缓冲液的试管中(菌浓度约为10⁵~10⁶cfu/mL），然后再向试管中加入浓度为10%的各种柠檬桉精油纳米脂质体，同时另取两个分别含有以上两种菌的试管并向其中加入等量无菌水(不加柠檬桉精油纳米脂质体)作为对照，将各试管均置于气浴摇床中在37℃、150rpm条件下震荡反应24h，分别于不同时间点的取适量培养液进行十倍梯度稀释到合适的浓度，然后移取100μL稀释液滴到无菌固体平板培养基上，涂布均匀，之后放入37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，24~48h后进行平板菌落计数，从而对评价各柠檬桉精油纳米脂质体的抗菌活性，做三次重复，结果取平均值。

3多层柠檬桉精油纳米脂质体的抗菌性能

不同保存期的柠檬桉精油纳米脂质体的抗菌活性的变化也可以间接反映脂质体的稳定性，因此对保存7天、30天、60天、90天的各种柠檬桉精油纳米脂质体进行了抗菌性能评价，结果如图5、图6所示；保存时间为7天时，单层柠檬桉精油纳米脂质体、双层柠檬桉精油纳米脂质体、多层柠檬桉精油纳米脂质体的抗菌活性均相同，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示了良好的抗菌效果；保存时间为30天时，单层柠檬桉精油纳米脂质体的抗菌效果明显降低、而双层柠檬桉精油纳米脂质体和多层柠檬桉精油纳米脂质体均显示良好的抗菌效果；保存时间为60天和90天时，单层柠檬桉精油纳米脂质体没有显示抗菌效果，双层柠檬桉精油纳米脂质体的抗菌效果明显降低，而多层柠檬桉精油纳米脂质体一直保持良好的抗菌效果。

Claims (10)

1.一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，柠檬桉精油包裹在磷脂双分子层中，其特征在于：磷脂双分子层为第一层纳米脂质体，还设有第二层纳米脂质体，第二层由壳聚糖组成，以提高包封率、稳定性和抗菌性能。

2.如权利要求1所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：还设有第三层纳米脂质体，第三层由明胶组成，进一步提高包封率、稳定性和抗菌性能。

3.如权利要求1所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：第二层纳米脂质体中壳聚糖的浓度为0.2mg/mL。

4.如权利要求2所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：第三层纳米脂质体中明胶的浓度为0.4mg/mL。

5.如权利要求1所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，是将柠檬桉精油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸干形成光滑的薄膜，加入水相介质和表面活性剂组成的混合溶液溶解薄膜并超声成乳、离心后取上层液体过滤得到单层柠檬桉精油纳米脂质体，其特征在于：将单层柠檬桉精油纳米脂质体与壳聚糖溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的双层柠檬桉精油纳米脂质体。

6.如权利要求5所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，其特征在于：进一步地，将双层柠檬桉精油纳米脂质体与明胶溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的多层柠檬桉精油纳米脂质体。

7.如权利要求5所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，其特征在于：大豆卵磷脂和胆固醇的质量比例为5:1；表面活性剂、柠檬桉精油与胆固醇的质量比为：1:5:4，此条件下可以得到最高的包封率；所述的有机溶剂是氯仿。

8.如权利要求5所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，其特征在于：表面活性剂为PVP，混合溶液中PVP的浓度为1.0mg/mL；所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3.5~4.0。

9.如权利要求5所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，其特征在于：单层柠檬桉精油纳米脂质体与壳聚糖溶液的体积比为1:10；所述的壳聚糖溶液为壳聚糖的醋酸盐溶液，浓度为0.2mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3.5~4.0，优选3.6，能够最佳溶解壳聚糖。

10.如权利要求6所述的一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体的制备方法，其特征在于：双层柠檬桉精油纳米脂质体与明胶溶液的体积比为1:10；所述明胶溶液为明胶的醋酸盐溶液，浓度为0.4mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3.5~4.0。