CN105007951A - 治疗乙型肝炎的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的组合物和方法以及用于鉴定适于治疗HBV感染的化合物或组合物的方法。此外，本发明提供了一种适宜的非哺乳动物模型，所述模型能够用于筛选能够在哺乳动物中抑制HBV复制或治疗HBV感染的化合物或组合物。特别地，本发明提供了通过抑制HBV？x蛋白与Bcl-2家族蛋白相互作用或通过降低Bcl-2家族蛋白的表达水平治疗乙型肝炎感染的组合物和方法。

Description

治疗乙型肝炎的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年9月26日提交的美国临时申请号61/706,083的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
关于联邦资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院提供的基金号为GM059083、GM079097和GM088241的政府支持下进行。政府享有本发明的一些权益。
发明领域
本发明涉及治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的组合物和方法。特别地，本发明涉及通过调节HBV x蛋白与Bcl-2家族蛋白之间的相互作用或通过降低Bcl-2家族蛋白的表达水平治疗乙型肝炎感染的组合物和方法。
发明背景
世界上有超过4亿人受乙型肝炎病毒(HBV)感染并且其是肝细胞癌(HCC)和其他肝脏疾病的主要起因。其已在多个国家中成为主要的健康问题。尽管目前HBV疫苗能够阻止新型HBV感染，但是对于慢性HBV携带者仍没有有效的治疗方法，其中有很多人将最终发展成多种肝脏病症和HCC。
研究已显示HBV编码的关键致病和致癌蛋白之一是17-kDa HBV x蛋白(HBx)。HBx是一种多功能HBV蛋白，已发现其对HBV感染和发病机制具有关键作用并且能够导致肝细胞癌。如其名称所恰如其分体现的，HBx是一种能够与多种体外系统中数量巨大的多种蛋白结合的神秘莫测的蛋白。不幸的是，对HBx确切的宿主靶点和作用机制还知之甚少。事实上，到目前为止鉴定HBx的细胞靶点及其作用机制仍是一个重大的挑战。由于HBx在HBV感染和发病机制中具有作用，据信对特异性的HBx细胞靶点的鉴定将为慢性HBV携带者的治疗提供重要的治疗潜能。
因此，存在对于鉴定HBx的细胞靶点或配体的需求。此外，存在对于通过靶向HBx的细胞靶点治疗HBV感染的需求。
发明概述
本发明的一些方面基于本发明人的发现：人抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL是HBx的宿主靶点。此外，本发明人发现了HBx与Bcl-2、Bcl-xL或后两者之间的相互作用是刺激胞质钙升高、HBV病毒复制和诱导细胞死亡所需的。本发明人关于Bcl-2蛋白作为HBx诱导的病毒复制和宿主细胞死亡的宿主靶点的这些发现对于鉴定和/或生产用于治疗慢性HBV患者的组合物是有用的。
研究已发现HBV病毒DNA滴度高的患者更可能发展成HCC。因此，在本发明的一些实施方式中，本发明人的发现能够用于显著降低HBV的复制，从而减小发展成HCC的可能性。事实上，本发明人在本申请中公开的发现能够通过例如显著减少HBV的复制用于治疗与HBV感染相关的多种临床状况。能够由本发明的组合物和方法治疗的示例性的临床状况包括但不限于由HBV活化的坏死和凋亡诱导的宿主炎症、肝硬化、HCC和肝炎。
在一些实施方式中，本发明的组合物与HBx的Bcl-2同源性3(BH3)样基序(即，BH3结构域)、Bcl-2或Bcl-xL或者其他Bcl-2家族成员结合。
附图简述
图1a显示了peptaibol TK序列比对。红色框中突出显示的是序列之间的微小差异。
图1b是显示peptaibol TK在ced-1(e1735)胚胎中导致更加持续的细胞尸体(cell corpse)产生的柱状图。所检查的胚胎阶段为逗号期、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍和4倍。y轴表示记录的细胞尸体平均数和误差线表示SEM。
图1c是显示peptaibol TK在ced-1(e1735)动物的种系中导致更加持续的细胞尸体的柱状图。记录L4进入成虫蜕皮后24小时和48小时动物中生殖细胞的尸体(n＝30)。
图1d是显示对秀丽线虫(C.elegans)核心凋亡通路中peptaibol TK靶点进行化学遗传分析的柱状图。对下述细胞死亡突变体进行Peptaibol TK处理：ced-1(e1735)、ced-1(e1735)；egl-1(n3082)、ced-1(e1735)；ced-9(n1950gf)、ced-1(e1735)；ced-4(n1162)、ced-1(e1735)；ced-3(n2433)和ced-1(e1735)smIs111；ced-4(n1162)。smIs111是携带Pegl-1acCED-3的整合的转基因。在各次实验中记录2倍阶段的胚胎。
图1e是显示peptaibol TK能够与EGL-1协同作用而诱导凋亡的柱状图。使用peptaibol TK处理ced-1(e1735)；egl-1(n3082)；smIs82动物并对其进行热休克处理。记录2倍阶段胚胎的细胞尸体。smIs82是携带PhspEGL-1的整合的转基因。数据为平均值±SEM。在各次实验中记录超过20个的胚胎(b,d,e)或超过30只动物(c)。**P<0.01；***P<0.001。
图1f是显示在秀丽线虫中peptaibol TK与核心凋亡通路相互作用的示意图。Peptaibol TK可能在EGL-1上游或与之平行的诱导和增强凋亡。
图2是显示在秀丽线虫中peptaibol TK增强HBx诱导的细胞死亡的图。使用5μM peptaibol TK处理两种不同的HBx转基因动物smIs98和bzIs8；smEx(Pmec-7HBx)和缺乏HBx表达的两种对照转基因动物smIs3和bzIs8。smIs98是含有Pmec-3GFP和Pmec-7HBx的整合的转基因。smIs3是含有Pmec-3GFP的整合的转基因，其在包括PLM触觉感受器神经元的10个秀丽线虫感觉神经元中指导GFP表达。bzIs8是含有Pmec-4GFP的整合的转基因，其在包括PLM神经元的6个秀丽线虫触觉感受器神经元中指导GFP表达。使用Nomarski显微镜记录GFP阳性PLM神经元的存在情况。数据以三类表示：两个PLM均丢失(黑色柱)、一个PLM丢失(灰色柱)和无PLM丢失(白色柱)。y轴表示每一类的百分率。柱子下方的百分数表示在各次实验中的总PLM缺失百分比。在各次实验中记录超过40只动物。
发明详述
乙型肝炎病毒(HBV)感染能够导致多种临床状况包括但不限于发展成肝炎(hepatitis)、肝脏炎症(liver inflammation)、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。HBV感染是在世界范围内导致患病和死亡的主要原因。HBV X蛋白(HBx)是HBV发病的重要效应器，但其细胞靶点和作用机制到目前为止仍不明确。本申请披露了发明人的一个发现，在哺乳动物的肝细胞中HBx与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL通过Bcl-2同源性3(BH3)样基序相互作用。本发明人还观察到阻止HBx与Bcl-2和Bcl-xL的结合的BH3-样基序中的突变消除了肝细胞中由HBx的表达导致的胞质钙升高和细胞死亡并使HBV的复制严重受损。由HBx的BH3样基序中的突变引起的HBV复制极大降低能够基本上被胞质钙的恢复所挽救。这些结果表明HBx与Bcl-2家族成员结合并且随后使得胞质钙升高对于HBV病毒的复制而言是重要的。
而且，通过RNA干扰敲低Bcl-2或Bcl-xL导致在肝细胞中出现由HBx诱导的钙升高减少和病毒复制减少。这些结果进一步表明HBx通过其BH3样基序靶向Bcl-2蛋白，其促进了在HBV发病过程中的胞质钙升高、细胞死亡和病毒复制。因此，本发明的一些方面提供了通过以下治疗HBV感染的方法：(i)抑制HBx与Bcl-2家族蛋白结合，(ii)减少Bcl-2家族蛋白的表达或(iii)其组合。
HBV是肝细胞特异性DNA病毒，其编码若干不同的病毒蛋白，包括DNA聚合酶、表面抗原、核心抗原和X蛋白(HBx)。尽管在HBV DNA复制和病毒粒子组装中其他病毒基因的功能已被很好地揭示，但是HBx在HBV感染和发病中的作用及其机制仍不明确。HBx参与介导HBV感染细胞中的多种病毒和细胞事件，包括病毒复制、转录因子的反式激活、信号转导、细胞周期进展和细胞死亡。尽管在细胞质和细胞核中均发现了HBx，但是线粒体似乎是HBx作用的重要位点，因为已发现HBx的表达诱导线粒体聚集、线粒体膜电势丢失和细胞色素C的释放。
HBx对于HBV感染肝脏中的病毒致病和肿瘤形成是必需的。已发现HBx基因是HCC中最常见的整合的病毒序列之一。事实上，在大多数HBV相关的HCC患者中，甚至是在不存在病毒DNA复制的情况下，均检测到了HBx蛋白。在一些情况下，在HCC组织中已鉴定出了HBV变体携带HBx的突变。此类突变导致HBx依赖性活性的丧失，这表明进化中的HBx功能可能是HBV相关的肝脏疾病的基础。在缺乏HBV病毒粒子的其他组分的转基因小鼠中还发现了HBx促进肝脏肿瘤发生。因此，HBx在HBV相关HCC的发展中具有重要作用是明确的。
已发现钙信号传导对多种HBx活性具有重要作用。例如，已发现HBx诱导的胞质钙升高对HBV DNA的复制、HBV核心组装以及若干转录事件和信号传导级联的活化具有重要作用。HBx诱导凋亡和坏死也需要胞质钙增加和线粒体渗透性改变(MPT)，这是一个在内稳态和细胞死亡过程中线粒体通过其调控细胞钙的过程。然而，到目前为止尚未鉴定与HBx相互作用以诱导MPT和胞质钙增加的细胞靶点。
已在多个体外系统中发现了多种与HBx相互作用的蛋白。然而，尚未在重演肝细胞中HBV感染的条件下确证这些蛋白大部分的相互作用。复杂哺乳动物系统的遗传冗余性是对HBx细胞靶点进行确定性鉴定的主要障碍。使用遗传上易控的秀丽线虫动物模型，本发明人发现了HBx直接与Bcl-2的同源物CED-9相互作用以诱导胞质钙升高和细胞死亡，这模拟了肝细胞中HBx表达的下游的两个重要事件。此外，本发明人发现了HBx与肝细胞中的两个Bcl-2家族成员(Bcl-2和Bcl-xL)相互作用以诱导胞质钙升高、细胞死亡和病毒DNA复制。
HBV X基因是HBV基因组的四种编码基因之一，其编码HBV感染和复制所必需的多功能蛋白(HBx)。HBx还影响感染细胞中的多种细胞事件，包括转录、信号转导、蛋白酶体活性、细胞周期进展和细胞死亡。HBx在HBV感染的患者中还显示出对肝细胞的肿瘤转化具有重要作用。甚至在仅表达HBx的转基因小鼠中，也发现了肝脏肿瘤的高发生率，这表明HBx和HCC之间具有因果关系。
已通过研究在肝细胞中建立了HBx的表达与坏死和凋亡的激活之间的联系。HBx能够通过多种损伤使肝细胞对细胞死亡敏化，包括使用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和剥夺生长因子。HBx还显示出诱导线粒体聚集、线粒体膜电势丢失和细胞色素C释放，这表明HBx可能通过线粒体发挥诱导细胞死亡的作用。凋亡和坏死也是在HBx转基因小鼠中肝脏发病的早期事件并且其能够导致肝硬化和HCC的发生。尽管这些结果均提示HBx具有肝毒性作用，但是到目前为止HBx用于促进细胞死亡和HCC发展的细胞靶点和信号通路仍是不明确的。不受任何理论的束缚，据信慢性肝细胞死亡导致以下循环：炎性细胞因子释放、局部肝损伤和代偿性再生，导致持续获得致癌性突变并发展成HCC。因此，对介导HBx诱导细胞死亡的细胞靶点和通路的鉴定能够导致对包括多种肝脏疾病在内的HBV相关临床状况的治疗学有效治疗。
已发现钙信号传导对多种多样的HBx活性均具有重要作用。例如，已发现HBx在感染HBV的肝细胞中负责触发胞质Ca2+增加，这是HBV DNA复制所需的。HBx诱导的胞质Ca2+升高还对HBV核心组装、一些HBx活化的转录事件以及包括JNK和MAPK通路在内的一些信号传导级联的活化具有重要作用。还显示HBx通过改变胞质Ca2+调节细胞死亡。尽管已发现在Ca2+调控中HBx靶向线粒体和线粒体渗透性转变(MPT)，但是与HBx相互作用以改变胞质Ca2+的细胞靶点在本发明人在本申请中披露其发现之前是未知的。
考虑到在哺乳动物中进行HBx研究的复杂性，本发明使用了简单的、遗传上易控的动物模型秀丽线虫鉴定HBx的靶点和信号通路。如本申请所公开的，本发明人披露了人Bcl-2同源物CED-9是与HBx相互作用以诱导胞质Ca2+增加和细胞凋亡的细胞靶点。
本发明一个特定的方面提供了在受试者中治疗乙型肝炎感染的方法。此类方法包括对需要此类治疗的受试者施用组合物，所述组合物(i)能够在所述受试者中抑制乙型肝炎病毒X蛋白与Bcl-2家族成员蛋白的结合；(ii)能够在所述受试者中减少Bcl-2家族成员蛋白的表达；或(iii)其组合。应注意的是，术语对疾病的“治疗”(“treating”或“treatment”)包括：(1)预防所述疾病，即使得在受试者中不出现所述疾病的临床症状，所述受试者可能暴露于所述疾病或对所述疾病易感但是尚未经历或显示出所述疾病的症状；(2)抑制所述疾病，即阻止或减轻所述疾病或其临床症状的发展；或者(3)缓解所述疾病，即使得所述疾病或其临床症状减轻。术语“抑制”蛋白指降低所述蛋白的水平或者其活性或表达的程度。例如，抑制Bcl-2蛋白包括降低Bcl-2基因转录、Bcl-2基因翻译和/或Bcl-2蛋白活性。可以采用本领域技术人员公知的任意方法容易地确定某种组合物对特定蛋白的抑制情况，例如通过确定间接或直接受到所述基因编码蛋白表达影响的任意参数或通过确定所述蛋白的活性。此类参数包括但不限于RNA或蛋白水平的改变、蛋白活性的改变、产物水平的改变、下游基因表达的改变、报告基因转录的改变(荧光素酶、CAT、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、绿色荧光蛋白(参见例如Mistili&Spector,Nature Biotechnology 15:961-964(1997))；信号转导、磷酸化和去磷酸化、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如cGMP、cAMP、IP3和Ca2+)和细胞生长的改变。
在一些实施方式中，Blc-2家族成员蛋白包括Bcl-2、Blc-xL、另一种Bcl-2成员或其组合。
在其他实施方式中，所述组合物包含结合抑制剂，所述结合抑制剂能够抑制乙型肝炎病毒X蛋白与所述Bcl-2家族成员蛋白结合。此类结合抑制剂可以是有机小分子或药物、小肽、小RNA分子如适体、抗体、siRNA(短抑制性RNA)或短发夹RNA(shRNA)，其减少相应基因的表达，如在实施例章节中所公开的那些。此外，能够使用本申请所述的程序容易地确定能够抑制Bcl-2家族成员蛋白表达的其他适宜的shRNA。此类适宜shRNA的合成是公知的并且通常能够使用任意市售自动寡核苷酸合成仪实现。能够抑制Bcl-2家族成员蛋白活性的有机小分子(例如分子量小于1kD的)也能够通过使用本申请所公开的测定技术容易地确定。而且，能够抑制HBx与Bcl-2家族成员蛋白结合的有机小分子也能够通过使用本申请所公开的方法以及使用计算机辅助模拟容易地鉴定。适宜有机小分子的合成是本领域技术人员公知的。此类化合物可以制备为化学物质阵列并针对活性化合物进行筛选。在一些实施方式中，使用能够抑制HBx与Bcl-2家族成员蛋白结合的抗体治疗HBV感染。在一些例子中，本发明的组合物包括使用抗体，所述抗体能够靶向乙型肝炎病毒X蛋白的Bcl-2同源性3(BH3)样基序、Bcl-2家族成员蛋白或其组合。抑制HBx与Bcl-2家族成员蛋白结合的适宜抗体是本领域技术人员在阅读了本申请后能够使用任意公知的抗体生产方法容易地制备的。
在其他实施方式中，所述结合抑制剂能够与乙型肝炎病毒X蛋白的Bcl-2同源性3(BH3)样基序相互作用。如本申请所公开的，本发明人已发现HBx通过其Bcl-2同源性3(BH3)样基序与Bcl-2和Bcl-xL结合。因此，通过靶向HBx的BH3样基序或者在Bcl-2或Bcl-xL中的BH3结合口袋，能够抑制HBx与Bcl-2和/或Bcl-xL的结合。
在又一些另外的实施方式中，组合物包含能够降低Bcl-2家族成员蛋白表达的表达抑制剂。此类表达抑制能够在转录水平、翻译水平或这两者上实现。在一些特定的实施方式中，所述表达抑制剂是shRNA，所述shRNA能够降低Bcl-2、Bcl-xL、另一个Bcl-2家族成员或其组合的表达。
本发明的另一方面提供了一种在感染HBV的细胞中减少乙型肝炎病毒(HBV)复制的方法。此类方法通常包括将感染HBV的细胞与组合物接触，所述组合物(i)能够在所述受试者中抑制乙型肝炎病毒X蛋白与Bcl-2家族成员蛋白结合；(ii)能够在所述受试者中降低Bcl-2家族成员蛋白的表达；或(iii)其组合。如上文所讨论的，本领域技术人员在阅读了本申请后能够容易地确定并合成适宜的结合抑制剂和表达抑制剂。
本发明的另一方面提供了一种在细胞中降低胞质钙水平升高的方法，如在感染乙型肝炎病毒(HBV)的肝细胞中。此类方法通常包括将感染HBV的细胞与组合物接触，所述组合物(i)能够在所述受试者中抑制乙型肝炎病毒X蛋白与Bcl-2家族成员蛋白结合；(ii)能够在所述受试者中降低Bcl-2家族成员蛋白的表达；或(iii)其组合。如上文所讨论的，本领域技术人员在阅读了本申请后能够容易地确定和合成适宜的结合抑制剂和表达抑制剂。
本发明的其他方面包括一种用于鉴定在哺乳动物中能够治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的组合物的方法。应注意的是，目前尚没有本领域技术人员已知的能够相对迅速地对HBV进行分子遗传分析的适宜动物模型。然而，如本申请所公开的本发明人发现了秀丽线虫的CED-9蛋白含有与人Bcl-2家族成员蛋白相似的与HBx结合的结合结构域。因此，用于鉴定能够在哺乳动物中治疗HBV感染的组合物的方法包括确定特定组合物在HBV X蛋白与秀丽线虫CED-9蛋白的相互作用之间的作用。在通常情况下，如果在存在所述组合物的条件下观察到HBV X蛋白与CED-9蛋白之间的相互作用降低，则其指示特定组合物能够在哺乳动物中治疗HBV感染。
本发明的另一方面提供了一种通过施用治疗有效量的peptaibol在受试者中治疗HBV感染的方法。“peptaibol”是以其三个特征性的结构特征命名的一大类短多肽：肽(peptide)、Aib(α-氨基丁酸)和C-末端氨基醇(alcohol)。其含有高比例的不常见的氨基酸，特别是Aib，其是在真菌物种的氨基酸序列中具有较高相似性的真菌的次级代谢产物。自从在1976年发现了peptaibol的第一个成员阿拉霉素(Alamethicin)后，到目前为止已鉴定了300多个peptaibol。
大多数peptaibol影响微生物和动物细胞的生物过程并导致培养的人类细胞的细胞死亡。通常将其插入质膜并寡聚化以形成离子可渗透的通道，导致电压急剧改变和所处理细胞的死亡。在peptaibol的大家族中，首先从拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)中分离和纯化得到了康宁霉素(Trichokonins)(TK)。不受任何理论的束缚，据信与其他peptaibol类似，peptaibol TK插入脂膜并且通过寡聚物形成而形成离子通道。当使用peptaibolTK处理人类肿瘤细胞时，这些细胞显示出特征性凋亡特征，这表明peptaibolTK促进凋亡性细胞死亡。最近的研究显示使用peptaibol TK处理肝细胞癌(HCC)通过钙介导的机制导致凋亡和自噬性死亡。然而，peptaibol TK的细胞靶点仍不明确。
程序性细胞死亡或凋亡是动物界中高度保守的细胞过程。在线虫秀丽线虫中的对程序性细胞死亡的遗传分析是鉴定关键性凋亡调节因子和效应物进而鉴定保守的细胞杀伤通路的手段。不受任何理论的束缚，据信在该细胞杀伤通路中，EGL-1(人仅含BH3区域促凋亡蛋白的同源物)通过与CED-9(人Bcl-2细胞死亡抑制剂的同源物)结合而起始凋亡，导致CED-4(人凋亡蛋白酶激活剂Apaf-1的同源物)从栓系(tether)在线粒体外部膜上的抑制性CED-4/CED-9复合物上解离。然后，释放的CED-4发生寡聚化以诱导CED-3酶原(人半胱天冬酶的同源物)通过蛋白水解活化，已发现人半胱天冬酶其中的多种参与凋亡起始或实施。已通过下述发现证实了该凋亡通路具有高度的保守性，即人Bcl-2蛋白能够部分地代替秀丽线虫中CED-9蛋白的功能以及含有BH3样基序的人病毒蛋白乙肝病毒X蛋白(HBx)能够通过直接靶向CED-9和Bcl-2家族蛋白在秀丽线虫和人肝细胞两者中诱导凋亡和坏死。
最近，已将秀丽线虫作为药物筛选和随后进行靶点鉴定的有力的动物模型。例如，在秀丽线虫中进行的研究揭示了苯环型化学物质包括萘和对二氯苯在秀丽线虫和人类中均靶向半胱天冬酶以抑制凋亡，导致在蠕虫中出现细胞死亡异常和在人类中的肿瘤发生。
本发明的一些方面基于本发明人的发现，peptaibol TK在秀丽线虫中促进凋亡。不受任何理论的束缚，据信peptaibol TK通过靶向细胞死亡抑制剂CED-9促进凋亡，从而其在EGL-1的协作下导致CED-4从抑制性CED-9/CED-4复合物中的释放增加。本发明的其他方面基于发明人的发现，peptaibol TK在秀丽线虫、HBV转基因小鼠和人肝细胞中增强HBx诱导的细胞死亡。这些结果表明peptaibol TK是一种还能够用于治疗HBV感染的潜在抗肿瘤药物。在一些实施方式中，peptaibol TK包括peptaibol TK VI(SEQID:NO 1)、peptaibol TK VII(SEQ ID:NO 2)或peptaibol TK VIII(SEQ ID:NO3)。
应意识到的是本发明的范围还包括衍生的或经修饰的peptaibol。在本申请中使用的peptaibol的“衍生物”指经修饰的peptaibol，其中在所关注的peptaibol肽中有一个或多个氨基酸被功能相似的氨基酸取代。例如，基于其共有侧链的性质将可以将天然存在的残基分成下组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)具有影响链方向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
因此，在通常情况下，经修饰的peptaibol指其中所关注的peptaibol的一个或多个，一般是5个或更少的，通常是3个或更少的和更通常是2个或更少的氨基酸被具有相似侧链性质的氨基酸取代的peptaibol。例如，peptaibolTK的“衍生物”指peptaibol TK的同源物、类似物。peptaibol TK的示例性衍生物包括但不限于：
(i)其肽片段来源于peptaibol TK的peptaibol，所述peptaibol TK含有α-氨基异丁酸和醇并且具有相似活性(即在体外测定中活性在±25％以内、一般在±10％以内并且通常在±5％以内)；
(ii)其中天然peptaibol TK序列的一个或若干氨基酸被其他氨基酸取代的peptaibol；
(iii)在peptaibol TK序列的N-和/或C-末端例如通过取代而修饰的peptaibol；这样，可以将酯和酰胺认为是衍生物；
(iv)peptaibol TK肽，其修饰阻止其被蛋白酶或肽酶破坏，以及来源于peptaibol或其片段的基本序列的肽-PEG-缀合物；
(v)peptaibol TK的经修饰的肽，来源于peptaibol TK肽或其片段的链并且其中所述序列的一个或若干个氨基酸被基因编码或非基因编码氨基酸或者肽模拟物取代；
(vi)与peptaibol TK的天然序列相比在一个或若干位置具有保守性氨基酸取代的peptaibol TK肽。将保守性取代定义为各氨基酸侧链被具有相似化学结构和极性的侧链取代，该侧链来源于基因编码或非基因编码氨基酸。这种具有相似侧链的氨基酸家族是本领域公知的。其包括例如具有碱性侧链(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(甘氨酸、天冬酰胺(aspartamic acid)、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此类侧链的保守性取代通常在非必需位点进行。在本申请中，在序列中的基本位点是其中相应氨基酸的侧链对其生物作用是有意义的位点。
对其下述实施例进行考察后本发明的其他目标、优势和新特征对本领域技术人员而言将是显而易见的，其并非旨在限制。在实施例中，建设性地应用于实践的程序用现在时态描述，已在实验室中实施的程序用过去时态表示。
实施例
实施例1
免疫沉淀测定。将使用pcDNA3.1-标签(Flag)-HBx构建体或pHBV复制子(野生型和G124L/I127A突变)转染的HepG2细胞并使用抗标签抗体或抗HBx抗体沉淀。通过免疫印迹分析或质谱分析检测与HBx一起沉淀的蛋白。
钙成像和分析。在转染后48hr使用4μM Fura-2-AM和0.04％普朗尼克溶液(Pluronic solution)孵育使用pcDNA3-mCherry和pcDNA3.1-标签-HBx构建体(野生型或G124L/I127A突变)共转染的HepG2细胞35min，使用缓冲液洗涤3次并且再孵育15min以使得乙酰氧甲基(AM)酯裂解，其捕获细胞中的Fura-2。使用Metafluor软件采集数据并使用Excel对其进行分析。使用KaleidaGraph程序中的t-检验进行统计学分析。误差线表示SEM(均值的标准偏差)。
对HBV DNA复制和HBcAg的定量。使用Southern杂交分析和定量实时PCR对从HepG2细胞或从小鼠肝脏中分离的HBV复制DNA中间体的量进行定量。使用市售测定试剂盒通过化学发光检测胞质中HBcAg的水平。
流体力学注射。在5秒钟内在相当于小鼠体重10％体积的PBS中将30μg pHBV复制子和3μg pcDNA3-GFP注射进入Balb/c小鼠的尾静脉中。在注射两天后，测定注射小鼠肝脏中的HBcAg和病毒DNA。
分子生物学。HBx cDNA克隆来自Xiao-Kun Zhang博士(The BurnhamInstitute for Medical Research)。使用克隆、测序、聚合酶链式反应扩增(PCR)的标准方法。为了制备HBx哺乳动物表达构建体，利用PCR扩增编码标签-HBx的DNA片段并且通过其Nhe I和EcoRV位点将其亚克隆进入pcDNA3.1(+)载体。使用QuickChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene Inc.)生成含有G124L和I127A取代的HBx突变构建体并且通过DNA测序对其进行确证。pHBV复制子含有HBV基因组中140％的DNA拷贝并且在HepG2细胞中以HBx依赖性的方式进行复制。使用Quick-Change定点诱变制备含有HBx(G124L，I127A)的pHBV并通过DNA测序对其进行确证。
细胞培养。在含有10％胎牛血清(FBS；Sigma-Aldrich)的DMEM中培养人HepG2细胞。使用Effectene转染试剂(Qiagen)依据生产厂商的方案转染HepG2细胞。通常能够达到15至30％的转染效率。所有转染实验均在铺板后24小时进行。在生产厂商(Qiagen)提供的100μl DNA浓缩缓冲液(缓冲液EC)中稀释1μg pcDNA3.1、pcDNA3.1-标签-HBx或pcDNA3.1-标签-HBx(G124L,I127A)。依据生产厂商的方案将8μl增强子和10μlEffectene顺序加入混合物中，每次加入后均涡旋混合并在室温下孵育。随后，在所述混合物中加入0.6ml完全培养基并将其加入细胞。在适当情况下包括共转染GFP(EGFP)表达增强的质粒pEFGP-C1(1μg)，以通过在细胞杀伤测定中进行流式细胞术分析对转染效率进行监测。
免疫共沉淀测定。使用针对标签表位(Sigma)的抗体(M2)或抗-HBx抗体(16F9)进行免疫共沉淀实验。简言之，在含有蛋白酶抑制剂混合片(Roche)的裂解缓冲液(100mM NaCl、0.5mM MgCl2、0.15mM CaCl2、1％(v/v)NP-40、10mM Tris-HCl，pH 8.0)中裂解使用pcDNA3.1-标签-HBx或pHBV构建体(野生型或突变体)转染的HepG2细胞。在4℃下10,000g离心10分钟除去细胞碎片。使用蛋白G Sepharose小珠(GE healthcare)预澄清细胞裂解物，随后在4℃、轻柔振摇条件下与M2或16F9抗体孵育1小时。然后加入蛋白G Sepharose小珠并且再持续孵育2小时。使用裂解缓冲液洗涤小珠5次。使用15％SDS聚丙烯酰胺凝胶分辨结合蛋白并分别使用抗-Bcl-2、抗-Bcl-xL和抗-Mcl-1抗体(Cell Signaling Technology)对其进行免疫印迹检测。
流式细胞术。转染后36小时，将存活和死亡的HepG2细胞刮入细胞生长培养基并通过离心沉淀。使用冷PBS洗涤来自6孔板1个孔中的细胞(～6x 105个细胞)两次并将其重悬于600μl Annexin V-结合缓冲液(10mMHEPES、140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4)中。根据Invitrogen提供的方案使用碘化丙啶(Sigma)和Annexin-V太平洋蓝(Invitrogen)标记细胞。简言之，将100μl重悬的细胞转移至新试管中。在各管中加入5μlAnnexin-V太平洋蓝(Invitrogen)和5μl碘化丙啶(Sigma)并在室温下避光孵育30分钟。然后在各管中加入400μl Annexin V-结合缓冲液。在CyAnTMADP分析仪(DakoCytomation)上对细胞进行分析，将背景门设为排除未转染的GFP(-)细胞并限定为仅为Annexin-V太平洋蓝染色或仅为碘化丙啶染色以使得阳性事件低于0.5％。数据采集自每个样品超过10,000个细胞。
胞质钙测量。使用lipofectamine LTX(Invitrogen)将HepG2细胞用pcDNA3-mcherry和pcDNA3.1-标签-HBx构建体(野生型或突变体)共转染。在48小时或更长时间后，使用HHBSS缓冲液(添加了20mM HEPES和11mM葡萄糖的Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞三次，然后使用4μM Fura-2-AM和0.04％普朗尼克溶液孵育35分钟。使用HHBSS洗涤细胞3次并再保留HHBSS 15分钟以使得捕获细胞中Fura-2的乙酰氧基甲基(AM)酯裂解。
在带有Cascade 512B CCD照相机(Roper Scientific)的Axiovert 200M倒置荧光显微镜(Zeiss)上进行成像实验，该荧光显微镜配有氙弧灯(XBO75)，340/26和380/10激发滤光片，450nm分光镜和535/45发射滤光片。将激发和发射滤光片置于由Lambda 10-3滤光片变换器(SutterInstruments)控制的在显微镜外部的滤光片转盘上以使得能够迅速地按照比例采集图像。使用Metafluor软件(Universal Imaging)收集图像。使用40X油浸物镜收集具有相似mCherry强度的健康细胞的所有图像并且通过在盖玻片的空白区域上产生一个目标区域(ROI)并减去各激发通道的荧光强度进行背景校正。使用在340nM和380nM激发波长下的背景校正强度计算Fura-2340/380比。
为了确定胞质中的静息[Ca2+]，使用含5μM离子霉素和5mM EGTA的无Ca2+-HBSS处理细胞以获得未结合指示剂的比率(Rmin)。然后使用无Ca2+-HBSS清洗细胞3次并使用含5μM离子霉素和10mM Ca2+的HBSS处理细胞以获得钙饱和指示剂的比率(Rmax)。在各个细胞中根据下述公式使用Fura-2报告的Kd值和来源于实验的R、Rmin、Rmax、Sf和Sb(分别为在380nm下无Ca2+和与Ca2+结合的Fura-2的发射强度)计算Ca2+浓度：
[ Ca 2 + ] = K d &times; ( R - R min ) ( R max - R ) &times; S f S b .
关于显微镜，传感器校正和将Fura-2比率转化成Ca2+浓度的详细情况参见J Biol Chem.,1985,260,3440-3450。结果以在经pcDNA3-标签-HBx转染的细胞中相对于经空载体转染的细胞中钙浓度的增加倍数表示。
Southern印迹分析。使用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤经pHBV复制子(野生型或突变体)转染的HepG2细胞(每个样品3×10cm培养板)两次，并且每个10cm培养板使用750μl NET缓冲液(50mM Tris–HCl pH7.5、1mM EDTA、100mM NaCl、0.5％Nonidet P-40)裂解1小时。通过4℃下12000g离心30分钟将HepG2细胞裂解物澄清。将上清液调整为含6mMCaCl2并使用100μg/ml微球菌核酸酶在37℃下处理其30分钟。通过加入EDTA至终浓度为25mM而终止反应。使用0.2mg/ml蛋白酶K和0.5％SDS在37℃下将蛋白消化过夜。通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化核酸。在4℃下12000g离心30分钟后，将沉淀物(pellet)重悬于10μl TE缓冲液中。在1.2％琼脂糖凝胶中分辨DNA样品，转移至尼龙膜(Bio-Rad)并使用地高辛标记的涵盖整个HBx基因的DNA片段杂交。
Northern印迹分析。按照生产厂商的说明使用Trizol试剂(Invitrogen)从转染细胞中提取总细胞RNA。在1％的变性甲醛琼脂糖凝胶上分离20μgRNA，转移至尼龙膜并使用按照上文所述的方法制备的涵盖整个HBV基因组的探针杂交。
定量实时PCR分析。如EMBO J.,1999,18,5019-5027中所述从胞质病毒核心颗粒中分离胞内HBV复制中间体。使用pHBV质粒作为定量标准并制备2x 108至200IU/ml的系列稀释物。从HBV S抗原和聚合酶的编码区中认真选择定量PCR的引物序列。引物集合1的序列(对应于HBS)：正向引物：5’–GTGTCTGCGGCGTTTTATCA–3’(SEQ ID:NO 4)，反向引物：5’–GACAAACGGGCAACATACCTT–3’(SEQ ID:NO 5)。引物集合2(对应于聚合酶)：正向引物：5’–TACTAGTGCCATTTGT–TCAGTGG–3’(SEQID:NO 6)，反向引物：5’–CACGATGCTGTACAGACTTGG–3’(SEQ ID:NO7)。使用SYBR Green Premix Ex Taq试剂盒(Takara Bio)在ABI Prism 7500PCR系统(Applied Biosystems)中进行实时PCR分析。通过荧光分析PCR产物。在至少两个独立的实验中对各标准稀释物进行两个PCR运行批次。根据每个稀释物的均值阈循环(CT)，使用CT值作为每个反应的模板分子数以十为底对数的函数进行线性回归。利用ABI prism 7500进行最小二乘回归分析，使用CT作为标称输入数的函数作图。使用各PCR内插的CT值对标准曲线的线性回归计算从每个反应测得的原始拷贝数。在至少三个独立的实验中对每个DNA标本进行4个PCR运行批次。
HBV核心抗原分析。利用化学发光使用市售测定试剂盒(Wantai,Beijing,China)确定HBcAg的量。
小鼠。将Balb/c小鼠(雄性，6至7周龄)分成两组(每个注射组6只小鼠)。在5秒内在相当于10％小鼠体重的PBS体积中将30μg pHBV复制子(野生型或突变体)加上3μg pcDNA3-GFP注射进入小鼠的尾静脉。在注射2天后，如Proc Natl Acad Sci USA.,2006,103,17862-17867所述收集这些小鼠的肝脏并分别测定HBcAg和病毒DNA水平。
在HepG2细胞中shRNA-介导的敲低。经验证的靶向人Bcl-2的shRNA慢病毒颗粒或对照shRNA慢病毒颗粒来自科罗拉多大学的功能性基因组实验室。使用基于慢病毒的shRNA递送载体pLL3.7-neo生产靶向人Bcl-xL的短发夹RNA。在HEK 293FT细胞中生产靶向Bcl-xL的病毒颗粒并使用其感染HepG2细胞。对于shRNA敲低实验而言，在注射前24小时将细胞铺板。在存在海美溴铵(hexadimethrine bromide)的情况下以推荐的感染复数加入慢病毒颗粒。使用嘌呤霉素(1μg/mL；Sigma-Aldrich)或新霉素(0.5mg/mL；Sigma-Aldrich)选择培养基中的感染细胞。shRNA靶向的Bcl-2mRNA序列为：5′–CCGGGAGATAGTGATGAAGTA–3’(SEQ ID:NO 8)。shRNA靶向的Bcl-xL mRNA序列为：5′–GTGGAACTCTATGGGAACAAT–3′(SEQ ID:NO 9)。
结果
本发明人在秀丽线虫中对HBx活性的分析显示HBx与秀丽线虫中的CED-9相互作用以诱导胞质钙增加和细胞死亡。而且，HBx还在体外通过其BH3样基序与人Bcl-2和Bcl-xL相互作用且通过在BH3-样基序的保守性残基上引入两个取代(G124L和I127A)能够破坏该相互作用。本发明人还通过免疫共沉淀测定进行了实验以确定在人肝HepG2细胞中HBx是否与Bcl-2和/或Bcl-xL相互作用。在使用pcDNA3.1-标签-HBx转染的HepG2细胞中，使用针对标签表位的抗体，内源性Bcl-2和Bcl-xL而非抗凋亡性Bcl-2家族成员Mcl-1与标签-HBx共沉淀。而相反的是，无Bcl-xL和仅痕量Bcl-2与标签-HBx(G124L，I127A)共沉淀，其在HepG2细胞中以与标签-HBx相当的水平表达。这些结果表明Bcl-2和Bcl-xL在人细胞中通过其BH3-样基序与HBx结合。重要的是，在经具有或不具有HBx(G124L，I127A)突变的HBV基因组(pHBV)140％头至尾DNA拷贝转染的HepG2细胞中，使用针对HBx的抗体时，内源性Bcl-2和Bcl-xL而非Mcl-1与HBx而非HBx(G124L，I127A)共沉淀。因此，在HBV基因组的复制中由其天然启动子表达的HBx通过其BH3-样基序与人肝细胞中的内源性Bcl-2和Bcl-xL联合。
通过使用Annexin-V太平洋蓝和碘化丙啶(PI)对经HBx转染的HepG2细胞进行染色以便将活细胞与凋亡和坏死细胞进行区分对人细胞中HBx的细胞杀伤活性进行分析。对经pcDNA3.1-标签-HBx转染细胞的流式细胞术分析显示了10.6％的凋亡细胞(Annexin-V阳性和PI阴性)和7.9％的坏死细胞(Annexin-V阳性和PI阳性)。在使用相同量的pcDNA3.1-标签-HBx(G124L，I127A)(4.87％的凋亡细胞和1.14％的坏死细胞)或空pcDNA3.1载体(1.14％的凋亡细胞和0.32％的坏死细胞)转染的HepG2细胞中观察到了细胞死亡显著降低。因此，与在秀丽线虫中一样，在人肝细胞中HBx利用其BH3样基序与抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xL蛋白结合并且诱导凋亡和坏死。
由于钙信号传导是HBx下游重要的事件，因此考察了HBx的BH3-样基序是否是HBx诱导的胞质钙升高所必需。使用按比例计量的荧光钙指示剂Fura-2确定经pcDNA3.1-标签-HBx或pcDNA3.1-标签-HBx(G124L，I127A)转染的HepG2细胞中的胞质钙。发现与仅载体的对照相比，表达HBx后静息钙浓度显著增加，而HBx(G124L，I127A)的表达则不会导致该现象。据信HBx诱导的钙升高不是由于细胞死亡增加所致，因为在存在Z-VAD时观察到了相似水平的钙增加，Z-VAD是一种阻断细胞死亡的泛-半胱天冬酶抑制剂。这些结果表明HBx能够诱导胞质钙增加，这依赖于其BH3-样基序和与Bcl-2家族蛋白的联合。
考虑到HBx在HBV DNA复制中的作用，检查了HBx与Bcl-2蛋白之间的相互作用对于HBV的复制是否是重要的。从经具有或不具有HBx(G124L，I127A)突变的pHBV复制子转染的HepG2细胞分离胞质病毒核心颗粒(HBV DNA的复制在此处进行)。通过southern印迹分析检测HBVDNA复制的水平。与经野生型pHBV转染的细胞相比，在经突变pHBV转染的细胞中HBV DNA复制显著减少。在经突变HBV基因组转染的细胞中HBV核心蛋白(HBcAg)的水平也显著降低，该水平与HBV DNA的水平相关。Northern印迹分析显示在经突变pHBV复制子转染的细胞中HBV前基因组(pg)/前核心(pc)RNA、前S/S mRNA或HBx mRNA未显示出减少。对分离的病毒颗粒进行的定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)分析显示与经野生型HBV基因组转染的细胞相比在经突变HBV基因组转染的细胞中HBV DNA的复制减少8-9倍。这些结果表明HBx的BH3-样基序对HBVDNA复制是重要的，但是其对于HBV的转录而言是可有可无的。有趣的是，通过使用5μM离子霉素进行处理能够较大程度的挽救在经突变HBV基因组转染的细胞中HBV DNA的复制，离子霉素是一种能够增加胞质钙的离子载体。该结果表明胞质钙增加是HBx与Bcl-2蛋白相互作用的重要下游信号传导事件，其刺激HBV DNA复制。
在已建立的慢性HBV感染小鼠模型中考察了HBx与Bcl-2蛋白的相互作用在HBV复制中的作用。通过流体力学尾静脉注射将具有野生型HBx或HBx(G124L，I127A)的pHBV复制子导入BALB/C小鼠(n＝6)中，同时使用pcDNA3-GFP报告子作为确定注射效率的对照。在注射2天后从肝脏中分离胞质病毒核心颗粒并对其进行southern印迹分析。与接受野生型pHBV复制子的小鼠相比，在接受突变pHBV复制子小鼠的肝脏中复制性DNA中间体的平均水平降低2-3倍。在接受突变pHBV复制子的小鼠中肝内HBV核心抗原(HBcAg)的表达出现了类似的下降。这些结果确证了在HBV感染的肝脏中针对HBV DNA的复制HBx的BH3-样基序以及HBx与Bcl-2家族蛋白联合的作用。
通过RNA干扰(RNAi)敲低HepG2细胞中Bcl-2或Bcl-xL的表达确定Bcl-2蛋白对于HBV复制的作用。与对照短发夹RNA(shRNA)相比，Bcl-2和Bcl-xL shRNA显著降低Bcl-2和Bcl-xL在HepG2细胞中的表达。对分离的病毒颗粒进行的Q-PCR分析显示与用对照shRNA的细胞相比在经表达Bcl-2或Bcl-xL shRNA的慢病毒感染的细胞中HBV DNA的复制减少21-41％。在使用Bcl-2或Bcl-xL shRNA处理的细胞中，不与HBx相互作用的抗凋亡Mcl-1蛋白的过表达并不显著阻止HBV DNA复制的减少，这表明由Bcl-2或Bcl-xL的丧失导致的HBV DNA复制的减少不可能是由于宿主细胞的存活受损所致。而且，Bcl-2或Bcl-xL的RNAi敲低降低但不是完全消除HBx诱导的细胞内钙增加，这与Bcl-2或Bcl-xL敲低减少但不是阻断HBVDNA复制的发现一致，并且其表明Bcl-2和Bcl-xL在介导HBx功能中是部分过剩的。Bcl-2和Bcl-xL双敲低细胞不能存活以便进行HBV病毒复制和细胞内钙改变分析。这些结果表明Bcl-2和Bcl-xL对于HBV病毒复制是重要的，其与上文所述的发现一起提供了强有力的证据，即HBx靶向Bcl-2和Bcl-xL两者以增加细胞内钙和促进HBV DNA复制。
讨论
尽管已经知晓了HBx在HBV的致病和肿瘤发生中的作用，对HBx宿主靶点的鉴定仍是过去三十年中面临的主要挑战。HBx活性的复杂性，缺乏研究HBV感染的适宜动物模型，细胞培养测定之间的变异性以及哺乳动物基因组的复杂性(其编码至少6种Bcl-2家族蛋白)，均导致了关于HBX功能、其与宿主靶点的相互作用及其作用机制的长久以来存在的问题。本发明人已工程化秀丽线虫动物模型以鉴定HBx的靶点和下游信号传导通路(参见实施例2)。模拟肝脏被HBV感染后展开的初始细胞事件，HBx在秀丽线虫中通过典型的细胞死亡通路诱导凋亡和坏死。有趣的是，通过阻断内源性仅含BH3区域的细胞死亡诱导剂EGL-1与CED-9的结合在秀丽线虫中抑制细胞死亡的在Bcl-2同源物CED-9中独特的获得功能的突变(G169E)在秀丽线虫中也完全阻断CED-9和HBx的BH3样基序之间的相互作用和HBx诱导的细胞死亡。值得注意的是，Bcl-2能够被秀丽线虫中的CED-9完全取代以介导HBx诱导的细胞杀伤，这表明在哺乳动物中Bcl-2可能与HBx相互作用。本发明人在本申请中还证明了HBx在人肝细胞中通过其BH3样基序与Bcl-2和Bcl-xL联合，并且该蛋白相互作用对HBx诱导的胞质钙升高、细胞死亡和病毒DNA复制是关键的。这些发现表明HBx对内源性仅含BH3区域蛋白的分子模拟实现了其与保守宿主靶点的相互作用以及拦截对病毒感染有益的细胞信号传导通路。
钙信号传导是HBx表达下游的关键事件，特别是其促进HBV复制、核心组装、细胞死亡以及其他HBx功能等。已假设HBx影响线粒体渗透性改变(MPT)，其对细胞内的钙稳态和细胞死亡是重要的。重要的是，Bcl-2和Bcl-xL均为线粒体蛋白并且已发现其参与调控MPT。HBx与Bcl-2和Bcl-xL的结合对HBx的钙调控作用是重要的，因为HBx的表达触发肝细胞中的胞质钙升高，而不能与Bcl-2和Bcl-xL结合的HBx(G124L，I127A)不具有这一作用。发现在HBx的BH3样基序中的G124L/I127A突变极大地减少人和小鼠肝细胞中HBV DNA的复制，其基本上能够被离子霉素对胞质钙的恢复所挽救，并且观察到Bcl-2或Bcl-xL的RNAi敲低能显著降低HBx诱导的细胞内钙增加和HBV复制，这进一步证实了HBx靶向Bcl-2蛋白以触发HBV复制和其他事件如细胞死亡所需要的胞质钙升高。
肝癌发生是一个复杂的和知之甚少的过程。由HBV感染或致癌物诱导的慢性肝细胞死亡可能触发了炎症循环、免疫应答、代偿性组织再生以及获得导致发展成HCC的癌基因突变。另一方面，促存活因子如Bcl-2和p38α激酶在肝细胞中的表达已显示出对阻止HCC的发展有效。而且，HBV病毒的复制在肝癌发生中具有重要作用。在慢性HBV患者中HCC的发展和进展以剂量依赖性的方式与病毒DNA的水平具有非常强的相关性。因此，阻断HBV病毒复制和HBV诱导的细胞死亡是治疗慢性HBV患者和阻止HCC发展的有效策略。本发明人发现了HBx的BH3-样基序对于HBx与Bcl-2家族蛋白的结合是必要的，这种结合导致细胞内钙升高、病毒有效复制和HBV诱导的细胞死亡。因此，靶向HBx的BH3-样基序或HBx与Bcl-2蛋白之间的相互作用的治疗是一种治疗慢性HBV患者和阻止HCC发展的新的有效策略。
实施例2
本实施例显示了HBx在秀丽线虫中的表达诱导坏死和凋亡性细胞死亡等，其模拟了HBV导致肝脏感染的早期事件。遗传和生化分析显示HBx通过Bcl-2同源性3(BH3)-样基序直接与Bcl-2的同源物CED-9相互作用以触发胞质Ca2+增加和细胞死亡。重要的是，CED-9介导的HBx诱导的秀丽线虫中的细胞杀伤能够被Bcl-2所代替，这表明CED-9和Bcl-2是HBx保守的细胞靶点。HBx诱导细胞死亡的遗传抑制剂筛选产生了多种突变，包括在凋亡和坏死通路关键调控因子中的突变，其表明这种筛选能够鉴定新的凋亡和坏死基因。本发明人发现了秀丽线虫是用于鉴定HBx的关键宿主因子和信号传导通路的动物模型并且能够用于治疗HBV诱导的肝脏病症的策略的研发。
秀丽线虫品系和细胞死亡测定。使用标准方案使动物生长和维持。使用种系转化生成表达HBx和其他基因的转基因秀丽线虫品系。记录热休克处理24小时后的胚胎致死率。如Nat StructMol Biol.,2008,15,1094-1101中所述记录HBx导致的PLM杀死。
GST下拉测定。使用谷胱甘肽Sepharose小珠纯化GST-HBx蛋白并如Nat StructMol Biol.,2008,15,1094-1101中所述测定其与CED-9或Bcl-2家族蛋白的结合。
钙成像和分析。利用FRET显微术使用整合了Pmec-4YC2.12cameleon转基因的秀丽线虫品系(bzIs17)对PLM神经元中的相对胞质钙水平进行定量。
蠕虫品系和培养条件。使用标准程序在20℃培养秀丽线虫品系。使用N2Bristol品系作为野生型品系。在基因分析中使用下述等位基因：LGI、mec-6(e1342)；LGIII、ced-4(n1162)、clp-1(tm690)、cnx-1(nr2009)、ced-9(n1950,n2812)；LGIV、itr-1(sa73)、ced-3(n2433)；LGV、crt-1(bz29)、unc-68(e540)、egl-1(n3082)、cyn-1(tm4171)；LGX、asp-3(tm4559)、asp-4(ok2693)。详细的等位基因信息参见蠕虫数据库(www.wormbase.org/)。除了这些品系以外，bzIs8是位于LGX上的整合的转基因并且其含有Pmec-4GFP构建体，该构建体指导GFP在6个秀丽线虫触觉感受器神经元中的表达。smIs98是位于LGII上的整合的转基因并且其含有Pmec-3GFP和Pmec-7HBx构建体。smIs3是含有Pmec-3GFP的整合的转基因。bzIs17是含有Pmec-4YC2.12的整合的转基因，其在mec-4基因启动子的调控下指导YC2.12cameleon钙传感器的表达。smIs451是仅含Pmec-7HBx的整合的转基因。在用于进一步的基因分析之前所有整合的转基因均与N2品系回交6次。
胚胎死亡率测定。在20℃将怀卵的转基因成虫置于培养板上2hr让其产卵。然后将培养板在33℃下热休克1hr并返回20℃放置1hr，随后除去所有成虫。在20℃放置24hr后，计数转基因胚胎的胚胎死亡率。
EMS诱变。进行EMS诱变。简言之，在搅拌条件下将smIs98；smEx[PhspHBx+PhspGFP]L4幼虫暴露于47mM EMS 4hr。克隆出诱变动物的F1代，并将F2胚胎在33℃下热休克1hr并返回20℃持续1hr。将该热休克处理重复3次以上以确保HBx将100％的胚胎杀死。将在许多细胞中具有强大GFP表达的存活幼虫鉴定为推定的抑制因子突变体，使用smIs98对其进行二次筛选。仅将HBx诱导的触觉细胞死亡被完全或部分抑制的那些突变体认为是真正的抑制因子并对其进行进一步的分析。
HBx对PLM杀伤的定量。在存在整合的转基因smIs98或bzIs8的情况下使用配有落射荧光的Nomarski显微镜记录L4幼虫中的PLM神经元。
转基因蠕虫。如Cell Death Differ.,2009,16,1385-1394所述进行种系转化。将PhspHBx构建体(均为25ng/μl)注射进入具有适宜遗传背景的动物中，使用Psur-5GFP(25ng/μl)作为共注射标记物，其在大部分发育阶段中的所有体细胞中指导GFP表达。将Pmec-7HBx构建体或其突变体衍生物(25ng/μl)注射进入bzIs8；unc-76(e911)动物中，使用p76-16B(5ng/μl)作为共注射标记物，其挽救unc-76(e911)突变体的不协调缺陷。将Pmec-7CED-9、Pmec-7CED-9TM或Pmec-7hBcl-2构建体(25ng/μl)注射进入smIs98；ced-9(n1950)动物，使用pRF4(50ng/μl)作为共注射标记物，其在转基因动物中导致滚筒(Roller)表型。
分子生物学。使用克隆、测序和聚合酶链式扩增(PCR)的标准方法。简言之，通过其EcoRI和Not I位点将全长HBxcDNA亚克隆进入pGEX-4T-2载体，生成pGEX-4T-2-HBx蛋白表达载体。为制备PhspHBx构建体，通过Nhe I和Kpn I位点将全长HBxcDNA亚克隆进入秀丽线虫热休克载体pPD49.78和pPD49.83中。通过其Nhe I和Kpn I位点将HBx cDNA亚克隆进入pPD52.102载体中构建Pmec-7HBx。使用QuickChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene Inc.)生成含有G124L，I127A、E125A或E126A取代的HBx突变体并使用DNA测序对其进行确证。为制备Bcl-2、Bcl-xL和Bax蛋白表达载体，通过PCR扩增人Bcl-2(1-218)、人Bcl-xL(1-209)和小鼠Bax(1-173)的编码区并分别通过其Nde I和Xho I位点将其亚克隆进入pET-19b载体。根据Parrish et al.(7)中的方法生成pET-24a-CED-9(68-251)和pET-24a-CED-9(68-251；G169E)。分别通过其Nhe I和EcoR V位点将全长ced-9和人Bcl-2cDNA片段亚克隆进入pPD52.102载体生成Pmec-7CED-9和Pmec-7hBcl-2。通过其Kpn I和EcoR V位点将编码CED-9氨基酸1-251的cDNA片段亚克隆进入pPD52.102载体生成Pmec-7CED-9△TM。
蛋白表达和纯化。在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中表达GST-HBx蛋白(野生型或突变体)。将大肠杆菌裂解物的可溶性成分与谷胱甘肽Sepharose小珠(Pharmacia)共同孵育并使用10mM还原型谷胱甘肽(Amersham)洗脱纯化的GST-HBx蛋白。分别使用pET-24a或pET-19b载体(Novagen)将CED-9(68-251)、人Bcl-2(1-218)、人Bcl-xL(1-209)和小鼠Bax(1-173)蛋白单独在BL21(DE3)中表达，在其C-末端或N-末端引入6组氨酸标签。使用Talon Metal亲和柱(Clontech)对其进行亲和纯化并使用250mM咪唑对其进行洗脱。
GST融合蛋白下拉测定。在4℃下将固化于谷胱甘肽Sepharose小珠(Pharmacia)上的纯化的GST-HBx蛋白或GST蛋白(均为2.5μg)与在含有25mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1％Nonidet P40、10％甘油、1mM苯甲基磺酰氟和5mM二硫苏糖醇的结合缓冲液中的5μg纯化的CED-9(68-251)-His6、CED-9(68-251；G169E)-His6、His6-hBcl-2(1-218)、His6-hBcl-xL(1-209)或His6-mBax(1-173)共同孵育2hr。分别使用针对GST(B-14)或6组氨酸标签(H15)的抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)利用western印迹对孵育混合物的一部分进行分析以确定GST-HBx蛋白和Bcl-2家族蛋白的输入水平。然后使用相同的缓冲液洗涤Sepharose小珠5次，随后在15％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分辨结合蛋白并通过免疫印迹对其进行检测。
结构建模。使用已公开的EGL-1BH3结构域和CED-9之间的复合结构作为模板(PDB代码：1TY4)进行HBx肽(残基120-128)和CED-9之间复合结构的同源建模。使用程序COOT人工对该模型进行优化是合理的。这两个建模图均使用PyMOL程序创建和使用Adobe Illustrator CS4标记。
对秀丽线虫的化学处理。采用基于油的方案使用化学药品对蠕虫进行处理。简言之，将毒胡萝卜素(Thapsigargin)(Sigma)或环孢菌素A(Sigma)溶解在DMSO中，然后使用100％的大豆油(Crisco)对其进行稀释。将L4幼虫阶段的雌雄同体动物与OP50一起接种于标准NGM培养板上。将含有化学物质的油溶液(0.8-1.0ml)分散于各板上以使得NGM表面上完全被油覆盖。蠕虫生活在NGM培养基与油的界面处。检查F1代中的PLM细胞死亡或在PLM中的FRET比率。
在秀丽线虫中的钙成像和分析。使用整合了Pmec-4YC2.12cameleon转基因(bzIs17)的秀丽线虫品系对PLM神经元中的相对胞质钙水平进行定量。将处于L1幼虫阶段的动物固定在含0.3M 2,3-丁二酮单肟和10mM HEPES的溶液(pH 7.2)中2％的琼脂板上。使用配有SensiCam CCD照相机(PCOImaging Kelheim，德国)的Axioplan 2Nomarski显微镜(Zeiss)对PLM神经元进行目测检查。使用CFP(427/10-25激发、440分色镜、472/30-25发射)、YFP(504/12-25激发、520分色镜、542/27-25发射)和FRET(427/10-25激发、440分色镜、542/27-25发射)滤光片(Semrock)，colliminating发射端口适配器(Photometrics)和Slidebook 5.0软件(Intelligent ImagingInnovations)采集FRET数据。使用CFP通道采集CFP激发后的CFP发射和使用FRET通道采集CFP激发后的YFP发射。使用ImageJ软件(NIH)对含有来自FRET或CFR通道的数据的输出TIFF文件进行分析。根据(FRETPLM–FRET背景)/(CFPPLM-CFP背景)计算FRET比，其中FRETPLM和CFPPLM是PLM神经元在FRET和CFP通道中的均值荧光强度以及FRET背景和CFP背景是与PLM神经元邻近的背景区在FRET和CFP通道中的均值荧光强度。
统计分析。实验数据以均值±均值的标准误差(SEM)表示。使用Studentt检验确定两个数据集合之间差异的显著性。
结果
为了在秀丽线虫中评估HBx的活性，在秀丽线虫热休克蛋白启动子(PhspHBx)的控制下诱导HBx的总体表达。在秀丽线虫中HBx的表达具有有害的作用，其导致高百分比的胚胎致死率。约97％的PhspHBx转基因胚胎不能孵化并且总是变形。很多胚胎中含有较大的空泡其类似于坏死细胞和凋亡细胞特征性的凸起圆盘。为了确定HBx诱导的细胞死亡的性质，将PhspHBx转基因引入ced-3缺陷的动物中，ced-3编码凋亡所必须的半胱天冬酶，或mec-6缺陷的动物中，mec-6对坏死是重要的。在ced-3(n2433)或mec-6(e1342)中较强的功能丢失(lf)突变部分抑制由HBx过表达导致的胚胎死亡，表明凋亡和坏死性细胞死亡均导致了HBx转基因胚胎的死亡。
为了分析HBx的细胞杀伤活性，在mec-7基因启动子(Pmec-7HBx)的控制下，在6个应力感受神经元(ALML/R、AVM、PVM、PLML/R)中表达HBx。为了帮助识别这些非必需神经元，在mec-3启动子(Pmec-3GFP)的控制下表达GFP，其在相同的6个触觉细胞加上4个其他感觉神经元(PVDL/R和FLPL/R)中驱动基因表达。使用含有Pmec-7HBx和Pmec-3GFP两者的整合的转基因(smIs98)测定由HBx导致的触觉细胞的杀伤。一般说来，在smIs98动物中13-50％的触觉细胞出现了异常的细胞死亡，其中两个后部PLM神经元显示出最强的异常死亡(50％)。因此，在后续所有的基因分析中采用PLM死亡。在smIs98动物中，一些濒死触觉细胞显示出坏死细胞特征性的扩大的空泡形态，一些显示出凋亡细胞凸起的圆盘样形态。一致的是，ced-3(n2433)或mec-6(e1342)lf突变能够部分地抑制由HBx导致的细胞杀伤并且通过缺失这两个基因能够将其消除。这些结果确证了HBx在秀丽线虫中诱导凋亡和坏死。
已在秀丽线虫中鉴定出了参与凋亡和坏死的许多基因。在凋亡通路中，四个关键蛋白EGL-1(相似于人仅含BH3区域促凋亡蛋白)、CED-9(人Bcl-2蛋白)、CED-4(人Apaf-1)和CED-3(人半胱天冬酶)依次作用以控制凋亡的活化。在坏死通路中，若干保守性内质网(ER)蛋白参与了调控Ca2+稳态，包括两个Ca2+-结合蛋白CRT-1(钙网织蛋白)和CNX-1(钙联接蛋白)以及两个Ca2+通道ITR-1(三磷酸肌醇受体)和UNC-68(不协调的兰尼碱受体同源物)，其控制在响应多种坏死性损害后Ca2+从ER向胞质释放。然后胞质中的Ca2+升高通过保守性的Ca2+-依赖性蛋白酶CLP-1(钙蛋白酶家族)和TRA-3(转化子)及其下游的天冬氨酰蛋白酶(ASP-3和ASP-4)启动坏死。对凋亡和坏死性细胞死亡通路中的这些关键组分是否影响HBx诱导的细胞死亡进行了考察。egl-1、ced-3或ced-4的缺失部分抑制HBx诱导的细胞死亡(PLM的死亡由50％降至22-26％)，表明HBx部分地通过凋亡通路诱导细胞死亡。相似地，crt-1、cnx-1、itr-1、clp-1、tra-3、asp-3或asp-4的缺失部分抑制HBx诱导的细胞杀伤(PLM的死亡由50％降至12-32％)，表明HBx部分地通过坏死通路诱导细胞死亡。重要的是，ced-3和凋亡通路中组分之一(mec-6、clp-1、itr-1和crt-1)的缺失几乎完全阻断了由HBx导致的异常的触觉细胞死亡，表明实际上凋亡和坏死是导致由HBx引起的几乎全部细胞死亡的原因。
与egl-1、ced-4或ced-3的缺失类似，在ced-9中的获得功能(gf)的突变(n1950)阻止了秀丽线虫中的大部分体细胞凋亡。然而，与部分阻断HBx诱导的细胞死亡的egl-1(lf)、ced-4(lf)和ced-3(lf)突变不同，ced-9(n1950gf)基本上完全抑制了HBx诱导的触觉细胞死亡和胚胎死亡。而且，在ced-4(n1162)突变背景下，ced-9(n2812)中的强lf突变基本上完全抑制了由HBx诱导的异常细胞杀伤，其阻断了由ced-9(n2812)(25)引起的大量异常细胞死亡和胚胎死亡。这些结果表明HBx通过CED-9诱导凋亡和坏死性细胞死亡。
ced-9(n1950gf)突变导致了在CED-9的BH3结合口袋中的Gly169被Glu取代，其破坏了仅含BH3区域的蛋白EGL-1与CED-9的结合并且阻止了EGL-1-诱导的促凋亡CED-4二聚体从栓系在线粒体表面上的CED-4/CED-9复合物中的释放。据信HBx通过与CED-9结合作用，从而拮抗其死亡抑制性功能。在体外使用谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白下拉测定考察了HBx是否与CED-9结合。GST-HBx特异性地与具有6个组氨酸表位标签的CED-9相互作用，但是不与突变的CDE-9(G169E)蛋白相互作用。有趣的是，HBx含有与多个促凋亡仅含BH3区域的蛋白的BH3基序关系较远的序列(残基116-132)。通过改变在仅含BH3区域蛋白中保守且朝向HBx/CED-9复合物结构模型中的CED-9的HBx中的两个氨基酸(将Gly124变为Leu和将Ile127变为Ala)测定HBx通过该基序与CED-9相互作用的可能性。G124L取代显著降低和I127A取代损害了在体外HBx与CED-9的结合。对这两个残基(G124L；I127A)的改变消除了HBx与CED-9的结合。一致的是，在体外CED-4释放测定中，HBx而非HBx(G124L；I127A)突变体能够使CED-4从栓系在谷胱甘肽树脂上的GST-CED-9/CED-4复合物中释放。当HBx(G124L)或HBx(I127A)在mec-7启动子的调控下表达时，这两种突变体蛋白均显示出细胞杀伤活性降低，而双突变体(G124L；I127A)诱导最小程度的异常的触觉细胞死亡。类似地，当在热休克启动子的控制下表达时，HBx(G124L；I127A)不会像HBX那样导致秀丽线虫中的胚胎死亡。这些体外和体内结果表明HBx与CED-9的联合是HBx在秀丽线虫中诱导异常细胞杀伤所需要的。
为了进一步表征HBx与CED-9之间的相互作用，使用已公开的EGL-1/CED-9复合结构对HBx/CED-9复合物进行结构建模，其使用推定的HBx的BH3基序代替EGL-1BH3螺旋。在模拟的HBx/CED-9结构中，HBx的Glu125和Glu126与CED-9的Gly169残基是邻近的。在ced-9(n1950gf)突变体中Gly169被体积较大的带负电的Glu取代预计会导致其与Glu125或Glu126或这两者之间产生空间碰撞和/或电荷互斥，从而破坏了HBx与CED-9之间的相互作用。在HBx中产生两个单独的Glu变成Ala的取代(E125A和E126A)并检测是否具有中性的、更小侧链的残基可能会减轻空间碰撞或电荷排斥并恢复HBx与CED-9(G169E)的结合。尽管在体外这两个突变均未影响HBx与野生型CED-9的结合，但是E125A而非E126A特别地恢复了HBx与CED-9(G169E)的结合。在体内，当分别在mec-7和热休克启动子的调控下表达时，在野生型动物中与HBx类似HBx(E125A)和HBx(E126A)均导致异常的触觉细胞死亡和较高的胚胎死亡百分率。然而，在ced-9(n1950)动物中，仅HBx(E125A)而非HBx或HBx(E126A)诱导较强的触觉细胞和胚胎杀伤。这些结果与在体外观察到的HBx(E125A)而非HBx或HBx(E126A)与CED-9(G169E)结合相关。综上所述，其为HBx在秀丽线虫中通过与CED-9的直接相互作用诱导细胞死亡提供了强有力的证据。
CED-9和Bcl-2在调控细胞死亡中的功能是高度保守的，并且Bcl-2能够部分地取代ced-9以抑制在秀丽线虫中的凋亡。因此，对HBx是否与Bcl-2家族蛋白结合和在秀丽线虫中介导HBx诱导的细胞杀伤中Bcl-2是否能够代替CED-9进行了检测。已发现GST-HBx特异性地与人抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL相互作用，而不与促凋亡蛋白Bax相互作用。通过G124L和I127A突变使得HBx与Bcl-2和Bcl-xL的结合显著降低，这表明HBx在体外也能够通过其BH3-样基序与Bcl-2和Bcl-xL相互作用。
HBx在ced-9(n1950)动物中不能诱导触觉细胞死亡，因为其不能与CED-9(G169E)结合。通过在smIs98；ced-9(n1950)动物中表达野生型CED-9(Pmec-7CED-9)能够完全逆转对HBx诱导的细胞死亡的这种抑制。重要的是，在smIs98；ced-9(n1950)动物中，在触觉细胞(Pmec-7hBcl-2)中人Bcl-2的表达也能够完全恢复HBx诱导的细胞杀伤，这表明HBx与Bcl-2和CED-9之间的相互作用以及随后的信号传导机制是保守的。
由于在秀丽线虫中HBx通过CED-9诱导坏死并且因为胞质Ca2+增加是坏死的活化所必需的，因而对HBx是否靶向CED-9以影响细胞内Ca2+进行了考察。通过荧光共振能量转移(FRET)测定使用携带在mec-4基因启动子的控制下表达cameleonCa2+传感器的整合的转基因(bzIs17)的秀丽线虫品系在六种触觉细胞中监测胞质Ca2+。在这项测定中，FRET比率(将其定义为在FRET通道中的荧光强度除以在CFP通道中的强度)指示相对胞质Ca2+浓度。使用毒胡萝卜素处理bzIs17动物，毒胡萝卜素抑制ER ATPase，其将Ca2+由胞质泵入ER，并且预计会导致胞质Ca2+升高。事实上，与未经处理或使用载体处理的动物相比，在使用毒胡萝卜素处理动物的PLM神经元中FRET比率显著增加。为了评估在活细胞中HBx的表达对胞质Ca2+的影响，使用asp-3(tm4559)突变阻断由整合的Pmec-7HBx转基因(smIs451)诱导的大部分触觉细胞死亡(PLM的丢失由50％降至12％)。asp-3的缺失本身不改变胞质Ca2+，因为在bzIs17和bzIs17；asp-3(tm4559)动物中FRET比率是基本相同的。然而，在bzIs17；asp-3(tm4559)；smIs451动物中，观察到FRET比率增加40％，这表明在触觉细胞中HBx的表达导致胞质Ca2+显著增加。重要的是，HBx诱导的Ca2+增加被ced-9(n1950)突变清除，其阻止了HBx与CED-9的结合。因此，在秀丽线虫中HBx似乎直接靶向CED-9以诱导细胞内Ca2+增加。
已发现CED-9通过其C-末端跨膜(TM)结构域定位于线粒体的外膜。缺乏其TM结构域的CED-9突变体(CED-9△TM)不能定位于线粒体并且其存在于胞质中。有趣的是，在ced-9(lf)动物中CED-9△TM的表达仍部分地挽救了在凋亡和胚胎死亡中的缺陷，这表明线粒体定位不是CED-9在秀丽线虫中抑制凋亡所必需的。对线粒体定位是否对CED-9介导的HBx诱导的细胞杀伤是重要的进行了考察。与由野生型CED-9的表达导致的46-52％的PLM杀伤相比，在smIs98；ced-9(n1950)动物中触觉细胞(Pmec-7CED-9△TM)中CED-9△TM的表达仅能将PLM的杀伤恢复至7-9％。这些结果表明线粒体定位对于CED-9介导HBx诱导的细胞杀伤是关键的。
由于线粒体渗透性转变(MPT)参与了介导HBx诱导的Ca2+增加，因而对在秀丽线虫中MPT是否影响HBx诱导的细胞杀伤和Ca2+增加进行了检测。使用环孢菌素A(CsA)处理smIs98动物，其是通过抑制线粒体亲环蛋白D的活性将MPT脱敏的肽，亲环蛋白D是MPT必需的调控组分。在正常丢失50％PLM神经元的smIs98动物中，CsA的处理使PLM的丢失百分率降至15％。类似地，编码秀丽线虫亲环蛋白D同源物的cyn-1中的缺失突变(tm4171)使得在smIs98动物中PLM的丢失百分率降至17％。这些结果表明MPT可能参与了HBx诱导的细胞杀伤。而且，ced-3的丢失使得由CsA引起的HBx诱导的细胞杀伤抑制增加(在经CsA处理的动物中由PLM死亡15％降至PLM死亡4％)，而clp-1或mec-6的丢失不具有这种作用。这些结果表明MPT对于HBx诱导的坏死性细胞死亡是关键的并且其首次报道了在秀丽线虫中MPT对于坏死是重要的。
对MPT是否参与了HBx诱导的胞质Ca2+增加进行了考察。在使用CsA处理的bzIs17；asp-3(tm4559)；smIs451动物中FRET比率降至在bzIs17；asp-3(tm4559)动物中观察到的水平，这表明HBx诱导的胞质Ca2+增加被CsA完全抑制。因此，HBx诱导的Ca2+增加可能由MPT介导，这与在人类细胞中观察到的结果一致。
为了鉴定HBx诱导的细胞杀伤的靶点或效应物，对从由HBx的总体表达导致的胚胎死亡表型中分离得到的抑制物进行了基因筛选。为便于鉴定真正的HBx抑制物，在热休克启动子(PhspHBx和PhspGFP)的控制下共表达HBx和GFP的smIs98动物中进行该筛选。使用PhspGFP以消除影响热休克启动子转录的突变，而smIs98提供了对HBx诱导的细胞杀伤的真正抑制物的二次筛选。从筛选得到的约20,000个单倍体基因组中，分离得到的31个HBx诱导的死亡抑制物，将其称为hids突变。在smIs98动物中，大部分hids突变不仅抑制由HBx的总体表达(PhspHBx)导致的胚胎死亡，而且还降低或阻断异常的神经元死亡，这表明其影响凋亡或坏死通路或者这两者。事实上，一个突变(sm250)不能补救clp-1(tm690)并且其是clp-1(Trp295变成Opal)无意义的等位基因。另一个hids突变体(sm221)不能补救mec-6(e1342)并且其是mec-6(Gly77变成Ser)错义的等位基因。还有一个hids突变(sm224)不具有凋亡细胞尸体并且其是ced-4(Glu383变成Ochre)无意义的等位基因。这些发现表明基因抑制物筛选成功地鉴定了参与HBx诱导的凋亡和坏死的基因并且其是鉴定新的凋亡和坏死基因以及HBx附加的效应器或靶点的强有力的工具。
讨论
在世界范围内，HBV感染超过3.5亿人口并且其是导致肝脏疾病和HCC的主要原因。作为HBV编码的关键致病性和致癌蛋白，推测HBx与宿主因素之间相互作用以促进病毒复制和多种病理结果，如肝细胞死亡和HCC。然而，HBx的宿主靶点及其作用机制仍是不明确的，部分原因是由于缺乏适合进行基因分析的适宜动物模型，通常与细胞培养研究的结果有关的不一致和哺乳动物系统的遗传复杂性(例如哺乳动物具有至少6种Bcl-2样细胞死亡抑制物)。在过去三十年中，这些技术障碍阻碍了对HBx的细胞靶点进行确定性的鉴定。因此，开发一种更加简单的动物模型，使得在其中能够通过有力的分子遗传方法对HBx宿主因素和下游效应物进行鉴定和验证，已成为了解HBx功能和治疗HBV患者的当务之急。
本发明人发现了一个这样的动物模型，秀丽线虫具有非常简单的基因组(仅有一个Bcl-2同源物)并且是一种有力的遗传学工具。本发明人发现了HBx在秀丽线虫中的表达诱导凋亡和坏死两者，其模拟肝脏被HBV感染后的早期细胞事件之一，这使得能够对涉及高度保守的细胞死亡调控因子和执行因子的HBx诱导的细胞死亡通路进行全面的遗传剖析。其包括关键的凋亡调控因子(CED-9、CED-4和CED-3)和在坏死通路中的关键组分，特别是参与调控Ca2+信号传导的那些，包括ER Ca2+结合蛋白和通道(CRT-1、CNX-1、UNC-68和ITR-1)、Ca2+-依赖性蛋白酶(CLP-1和TRA-3)以及MPT，此前尚不知晓其中的多种参与HBV或HBx诱导的致病过程。然而，已知MPT在人类中参与了HBx诱导的细胞杀伤和HBV复制。CED-9是一种关键的凋亡调节因子，出乎意料地发现了其是在秀丽线虫的细胞死亡和Ca2+信号传导中HBx的宿主靶点，这导致了人Bcl-2蛋白作为在人肝细胞中HBx介导的Ca2+刺激和HBV复制保守的宿主靶点的鉴定。这些发现表明了秀丽线虫模型对于研究HBV和HBx的有效性。HBx抑制物筛选鉴定了这两条细胞死亡通路的重要调控因子并且其仍具有鉴定HBx的新靶点或效应物以及新的凋亡和坏死基因的潜力。
重要的是，HBx的细胞杀伤活性依赖于CED-9，其是Bcl-2的同源物和关键的细胞死亡抑制物，因为在CED-9的BH3结合口袋中的获得功能的突变(G169E)在秀丽线虫中阻断了HBx诱导的细胞死亡。在体外，HBx通过其BH3-样基序与CED-9相互作用，而不与CED-9(G169E)相互作用。在HBx的BH3-样基序中改变两个保守性残基消除了HBx与CED-9的结合和HBx的细胞杀伤活性。在HBx的BH3-样基序中恢复HBx与CED-9(G169E)结合的补偿性突变(E125A)使得HBx能够在ced-9(n1950gf)动物中有效地杀伤。这些体外和体内结果确立了HBx通过其BH3-样基序直接与CED-9相互作用以诱导细胞杀伤，以及CED-9是HBx真正的细胞靶点。重要的是，在人肝细胞中HBx通过相同的HBx-样基序与两种人抗-凋亡CED-9同源物Bcl-2和Bcl-xL相互作用，并且该相互作用对于HBx诱导的胞质Ca2+升高、细胞死亡和HBV病毒复制是关键的。在秀丽线虫中Bcl-2能够完全取代CED-9以介导HBx诱导的细胞杀伤的这些结果和发现提示HBx通过保守的宿主靶点(Bcl-2家族成员)和保守的信号传导通路发挥作用以诱导胞质Ca2+升高、细胞杀伤以及其他细胞和病毒事件。其还表明秀丽线虫遗传系统对于明确地确定体内蛋白的相互作用和靶点的鉴定具有得天独厚的优势，这在复杂的哺乳动物系统中是一项艰巨的任务。
与肝细胞中HBx的表达相关的一个信号传导事件是胞质Ca2+升高，其对于HBV的复制、转录和核心组装是关键的，并且其参与了细胞死亡和若干其他信号传导通路的活化。尽管HBx介导的钙刺激的细胞靶点是未知的，但是已提出了HBx靶向线粒体以影响其渗透性转变，这在对细胞内Ca2+稳态的调控中具有重要作用。在本研究中，本发明人发现HBx直接与线粒体蛋白CED-9相互作用以增加胞质Ca2+，然后其在秀丽线虫中通过Ca2+-依赖性蛋白酶(CLP-1和TRA-3)触发坏死的活化。HBx诱导的CED-9-依赖性Ca2+升高和坏死均能够被MPT的抑制剂CsA所抑制。这些结果与在人细胞中观察到的结果HBx通过MPT控制细胞内钙、细胞死亡和HBV复制一致，并且表明在细胞内Ca2+升高中CED-9是HBx的细胞靶点。由于在HBV感染的肝细胞中Bcl-2与HBx联合，在秀丽线虫中HBx诱导的细胞杀伤中代替CED-9，并且已发现其参与调控线粒体渗透性改变，因而线粒体蛋白Bcl-2和Bcl-xL在HBV感染期间均可能是HBx的靶点以改变Ca2+信号传导。诱导的胞质Ca2+增加然后触发多种病毒和宿主事件的活化，包括HBV复制、组装和细胞死亡。因此，靶向HBx的BH3-样基序以阻止HBx与Bcl-2家族蛋白的结合可能是用于治疗与HBV相关的肝脏病症同时不干扰宿主细胞信号传导通路的新的和理想的治疗策略。
实施例3
对秀丽线虫的微规模液体培养。将Peptaibol TK与S-培养基混合以形成70％的peptaibol TK浓度溶液。将该混合物与蠕虫一起置于96-孔培养板中，使用纯S-培养基(wormbook，用于维持秀丽线虫)作为对照。以1:1的体积比将HB101的离心沉淀物悬浮于培养液以作为秀丽线虫食物来源。
胚胎/种系细胞尸体计数测定。在Zeiss Nomarski显微镜的DIC视野下计数胚胎和种系细胞的尸体。对于胚胎细胞尸体计数而言，将晚期L4蠕虫转移至微规模液体培养基中并且使用其24小时内产的卵记录细胞尸体。对于种系细胞尸体计数而言，将中期L4蠕虫转移至微规模液体培养基中并且在转移至液体培养基后的24小时和48小时计数其种系细胞尸体。在细胞尸体计数测定中使用的等位基因为egl-1(n3082)、ced-9(n1950)、ced-4(n1162)和ced-1(e1735)。
生殖腺解剖。在smIs203蠕虫上进行生殖腺解剖，其携带整合的CED-4::GFP转基因。将蠕虫在常规玻片上解剖。在使用10μL 30μM的叠氮钠麻醉蠕虫后，再加入30μL M9进行稀释。为解剖生殖腺，将蠕虫的头置于两个注射针之间并且在剪刀运动中通过移动针将头切下。然后，在盖上盖玻片后观察释放出的生殖腺。
结果
为了了解peptaibol TK是如何在人类癌症细胞中选择性地促进凋亡，使用peptaibol TK VI(SEQ ID:NO 1)、peptaibol TK VII(SEQ ID:NO 2)和peptaibol TK VIII(SEQ ID:NO 3)的混合物检测在秀丽线虫中的凋亡。见图1a。在96孔板中含有20μM peptaibol TK的S培养基中培养秀丽线虫并计数秀丽线虫胚胎和种系中的凋亡细胞尸体数。为了增加细胞死亡测定的灵敏度，使用ced-1(e1735)动物，在其中凋亡细胞的吞噬被阻断，其使得能够容易地记录凋亡细胞。研究发现与缓冲液对照相比peptaibol TK处理能够在ced-1(e1735)胚胎和种系中导致产生明显更多的凋亡细胞尸体(图1a-c)，这表明peptaibol TK能够在秀丽线虫中诱导异常的凋亡。
为了研究peptaibol TK是如何诱导异常的细胞死亡的，对peptaibol TK诱导细胞死亡的遗传条件进行了考察。在秀丽线虫中中心细胞杀伤通路由负性调控级联介导，在其中细胞死亡起始因子EGL-1通过拮抗细胞死亡抑制剂CED-9的活性诱导细胞死亡，其使得半胱天冬酶激活剂CED-4活化细胞杀伤半胱天冬酶CED-3(图1f)。发现在ced-4(n1162)或ced-3(n2433)中强烈的导致功能丧失(lf)的突变完全阻断peptaibol TK诱导的在ced-1(e1735)胚胎和种系中的异常细胞死亡(图1d)。这些结果表明peptaibol TK作用于ced-4上游或与之平行以诱导凋亡。类似地，在egl-1(n3082)强烈的lf突变完全阻断peptaibol TK诱导的在ced-1(e1735)胚胎中的异常细胞死亡(图1d)。有趣的是，在ced-9(n1950)中获得功能(gf)的突变导致在CED-9蛋白BH3-基序结合口袋中的Gly169被Glu取代，其阻断仅含BH3区域蛋白EGL-1与CED-9的结合以及EGL-1诱导的CED-4从栓系在线粒体外膜上的抑制性CED-4/CED-9复合物上的释放。与egl-1(n3082)一样，ced-9(n1950)在ced-1(e1735)胚胎中阻断peptaibol TK诱导的异常细胞死亡(图1d)。这些结果表明peptaibol TK作用于CED-9的上游或与之平行并且能够直接靶向CED-9以诱导凋亡。
由于CED-4从抑制性CED-4/CED-9复合物中的释放是秀丽线虫凋亡中的关键事件，因此对peptaibol TK是否促进了CED-4的释放以诱导凋亡进行了研究。已报道在凋亡期间CED-4从线粒体上解离并转位至凋亡细胞中的细胞核周围的区域。生成在内源性ced-4启动子的控制下的携带翻译CED-4::GFP融合的低拷贝整合的转基因(smIs203)。在从smIs203动物中解剖得到的生殖腺中，CED-4::GFP显示出明显的点状胞质染色，其为线粒体定位的特征。使用线粒体特异性染料MitoTracker红进行染色，确证了CED-4::GFP与MitoTracker红共定位于线粒体。使用peptaibol TK处理结果导致胞质染色丧失并出现GFP环，这表明CED-4::GFP从线粒体转位至核膜。这些结果表明peptaibol TK能够在体内促进凋亡性CED-4的释放。
还考察了peptaibol TK是否能够在体外促进CED-4的释放。在这项实验中，在存在或不存在有限量EGL-1的条件下将peptaibol TK与CED-4/CED-9复合物共同孵育，单独的peptaibol TK几乎不能使CED-4从CED-4/CED-9复合物中释放。尽管单独的peptaibol TK不能导致CED-4的释放，但是其与EGL-1的组合极大地增加了CED-4的释放。因此，peptaibolTK能够与EGL-1协作以促进CED-4从CED-4/CED-9复合物中释放并且从而导致凋亡。
使用凝胶过滤测定考察了peptaibol TK对EGL-1诱导的CED-4从CED-4/CED-9复合物释放的增强作用。当将7nmol CED-4/CED-9复合物上样至Superdex 200柱时，所述复合物在单峰中洗脱。当将相同量的CED-4/CED-9复合物预先与12nmol EGL-1进行孵育然后再上样至Superdex柱时，观察到与CED-4四聚体尺寸一致的较小的第二个峰，这表明有限量的CED-4从CED-4/CED-9复合物中释放。尽管将相同量的CED-4/CED-9复合物预先与150nmol peptaibol TK进行孵育不会导致任何可检测的CED-4的释放，但是将150nmol peptaibol TK和150nmolEGL-1预先与CED-4/CED-9复合物进行孵育导致CED-4/CED-9蛋白峰向CED-4四聚体峰出现较大位移，这表明CED-4从CED-4/CED-9复合物中的释放出现了较大的增加。综上所述，这些体外CED-4释放结果表明peptaibol TK通过增强EGL-1诱导的CED-4从抑制性CED-4/CED-9复合物中的释放促进了凋亡并且其与所观察到的peptaibol TK不能在egl-1(n3082)胚胎中诱导细胞死亡的结果一致(图1d)。
为了探索peptaibol TK是如何增强EGL-1诱导的CED-4从CED-4/CED-9复合物中释放的，使用等温滴定量热法(ITC)检测了peptaibol TK是否与EGL-1、CED-9或者这两者相互作用。当使用peptaibol TK滴定CED-9时，差示加热功率与peptaibol TK和CED-9之间的摩尔比具有良好的相关性表明其具有较弱的但是可检测的相互作用，其结合亲和性(KB)为4.26×104M-1。而相反的是，EGL-1与peptaibol TK的滴定显示出具有较小偏差的离散数据点，其表示背景热波动和EGL-1和peptaibol TK之间不存在显著的相互作用。与预期一致，CED-9与EGL-1之间具有较强的相互作用，其产生的结合亲和性为4.04×106M-1。当在与EGL-1滴定前将CED-9与peptaibol TK预孵育时，检测到了强得多的结合亲和性(1.52×108M-1)，其约为CED-9与EGL-1之间的38倍。考虑到peptaibol TK不与EGL-1结合，EGL-1与CED-9之间结合亲和性的这种较强的增强可能是由于peptaibol TK与CED-9之间的相互作用引起的，其可以诱导CED-9空间构象的改变使得其与EGL-1的结合极大地增强。这还与所观察到的peptaibol TK在体外和体内增强EGL-1诱导的CED-4从CED-4/CED-9复合物中释放的结果一致。
已发现乙型肝炎病毒的X蛋白HBx在HBV感染患者的致病作用和肝细胞的肿瘤转化中具有重要作用。有趣的是，HBx与高度保守的宿主靶点Bcl-2家族细胞死亡抑制物通过BH3-样基序相互作用以促进细胞内钙增加，导致凋亡、坏死和病毒复制。由于HBx在秀丽线虫中通过与CED-9的相互作用诱导凋亡和坏死性细胞死亡，因此使用smIs98动物检测了peptaibol TK是否能够类似地在秀丽线虫中增强HBx诱导的细胞死亡，所述动物携带分别在触觉细胞特异性mec-7和mec-3基因启动子(Pmec-7HBx和Pmec-3GFP)的控制下表达HBx和GFP的整合的转基因。在使用peptaibol TK处理的smIs98动物中，PLM触觉细胞死亡的百分率为71％，其显著高于在使用缓冲液对照处理的smIs98动物中观察到的结果(52％)(图2)。另一方面，在peptaibol TK或缓冲液对照处理的smIs3动物中，均得到了相似的较低的PLM细胞杀伤百分率，所述动物携带仅含Pmec-3GFP而不含Pmec-7HBx的整合的转基因(图2)。当Pmec-7HBx作为染色体外阵列存在于bzIs8动物中时，也得到了类似的结果，所述动物携带含有Pmec-4GFP的整合的转基因，其还使用GFP特异性地对触觉细胞进行了标记(图2)。这些结果表明peptaibol TK能够在秀丽线虫中增强HBx诱导的细胞死亡，这与其在增强EGL-1诱导的细胞死亡中的作用是一样的。
由于HBx在秀丽线虫和人肝细胞中通过保守的宿主靶点Bcl-2家族细胞死亡抑制物促进了细胞杀伤，因此对peptaibol TK在HBV感染的人肝细胞中是否能够促进细胞杀伤增加进行了检测。使用不同浓度的peptaibol TK处理HepG2-N10细胞和对照HepG2细胞，HepG2-N10细胞是携带140％头至尾HBV基因组(pHBV)整合拷贝的的人肝细胞。增加浓度(4、8、12、16μM)的peptaibol TK似乎不会明显改变对照HepG2细胞的细胞密度，但是其显著减少了HepG2-N10细胞的细胞密度，这表明peptaibol TK在HBV感染的肝细胞中而非未经感染的HepG2细胞中促进细胞杀伤的增加。通过腹腔注射检测了peptaibol TK对携带整合了pHBV拷贝的C57BL/6小鼠和对照C57BL/6小鼠的影响。与对照C57BL/6小鼠相比，HBV转基因小鼠对于peptaibol TK的注射更加敏感，因为在IP注射6小时后在HBV小鼠中作为肝损伤指示物的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平高于对照小鼠。这些结果为peptaibol TK选择性地在HBV感染的肝细胞中促进细胞杀伤增加提供了初步的支持性证据。
讨论
与在培养细胞中的情况类似，peptaibol TK在秀丽线虫中通过凋亡通路诱导细胞死亡。基因分析表明peptaibol TK与EGL-1合作通过凋亡杀伤细胞。为了证明这个假设，进行了实验，结果显示当存在EGL-1时，peptaibol TK实际上在体内和体外促进更多的CED-4释放以增强诱导凋亡的作用。而且，使用ITC研究peptaibol TK、EGL-1和CED-9/CED-4复合物之间的相互作用过程的细节。基于实验数据，首次发现了peptaibol TK以热力学不稳定的方式与CED-9/CED-4复合物中的CED-9结合。据信Peptaibol TK的结合改变了CED-9的构象，使其转变成与EGL-1具有更高亲和性的状态，从而极大地促进了EGL-1诱导的CED-4释放。
本发明前述的讨论存在的目的是解释和说明。前述内容并非旨在将本发明限制为本申请所公开的形式。尽管本发明的说明书中包括了对一个或多个实施方式以及某些改变和修订的描述，但是例如在理解了本申请后根据本领域的技术和知识能够获得的其他改变和修订也在本发明的范围内。其旨在获得权利，所述权利包括在允许范围内的替代实施方式，包括与所主张的那些可替代的、互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤，无论此类可替代的、互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤是否被本申请所披露，并且其并不旨在向公众贡献任何可专利的主题。本申请中引用的所有参考文件均通过引用整体并入本申请。

Claims (11)

1.一种用于在受试者中治疗乙型肝炎感染的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用组合物，所述组合物(i)能够在所述受试者中抑制乙型肝炎病毒X蛋白与Bcl-2家族成员蛋白结合；(ii)能够在所述受试者中降低Bcl-2家族成员蛋白的表达；或(iii)其组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Bcl-2家族成员蛋白包括Bcl-2、Blc-xL、其他成员或其组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含结合抑制剂，所述结合抑制剂能够抑制乙型肝炎病毒X蛋白与所述Bcl-2家族成员蛋白的结合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述结合抑制剂能够与乙型肝炎病毒X蛋白的Bcl-2同源性3(BH3)样基序或Bcl-2家族成员相互作用。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含表达抑制剂，所述表达抑制剂能够降低Bcl-2家族成员蛋白的表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述表达抑制剂是siRNA或小RNA，所述siRNA或小RNA能够降低Bcl-2、Bcl-xL或其组合的表达。
7.一种在感染HBV的细胞中减少乙型肝炎病毒(HBV)复制的方法，所述方法包括将所述HBV感染的细胞与组合物接触，所述组合物(i)能够在所述受试者中抑制乙型肝炎病毒X蛋白与Bcl-2家族成员蛋白结合；(ii)能够在所述受试者中降低Bcl-2家族成员蛋白的表达；或(iii)其组合。
8.一种在感染乙型肝炎病毒(HBV)的细胞中降低细胞内胞质钙升高水平的方法，所述方法包括将HBV感染的细胞与组合物接触，所述组合物(i)能够在所述受试者中抑制乙型肝炎病毒X蛋白与Bcl-2家族成员蛋白结合；(ii)能够在所述受试者中降低Bcl-2家族成员蛋白的表达；或(iii)其组合。
9.一种鉴定能够在哺乳动物中治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的组合物的方法，所述方法包括确定所述组合物在HBV X蛋白与秀丽线虫(C.elegans)的CED-9蛋白之间的相互作用中的作用，其中在存在所述组合物的情况下调节所述HBV X蛋白与CED-9蛋白之间的相互作用是表示所述组合物能够在哺乳动物中治疗HBV感染的指示。
10.一种在受试者中治疗乙肝感染的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含peptaibol TK或其衍生物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述peptaibol TK包含peptaibolTK VI(SEQ ID：NO.1)、peptaibol TK VII(SEQ ID：NO.2)、peptaibol TK VIII(SEQ ID：NO.3)或其衍生物或其混合物。
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