CN104987408A - 一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104987408A
CN104987408A CN201510412223.3A CN201510412223A CN104987408A CN 104987408 A CN104987408 A CN 104987408A CN 201510412223 A CN201510412223 A CN 201510412223A CN 104987408 A CN104987408 A CN 104987408A
Authority
CN
China
Prior art keywords
iga
mercury
inner complex
sample
chromatography column
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510412223.3A
Other languages
English (en)
Inventor
张积仁
阳帆
董欣敏
吴婧
蔡睿
孙遥
赵乙木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Baihao Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Baihao Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Baihao Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Baihao Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201510412223.3A priority Critical patent/CN104987408A/zh
Publication of CN104987408A publication Critical patent/CN104987408A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用，该汞-IgA螯合物是汞离子与IgA通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。本发明建立了汞-IgA螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测汞-IgA螯合物在评价一个地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中汞-IgA螯合物可以间接反映这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这个地区汞污染程度。本发明建立的汞-IgA螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。

Description

一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用。
背景技术
IgA主要由粘膜相关淋巴样组织产生，其中大部分是由胃肠淋巴样组织所合成，少部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜组织合成。哺乳期产妇腺组织含有大量IgA产生细胞，这些细胞主要来自胃肠。在人类，还有少量的IgA来自骨髓。人出生后4～6月开始合成IgA，4～12岁血清中含量达成人水平，血清型IgA总Ig的10％左右，半衰期约5～6天。IgA有IgA1和IgA2两个亚类。IgA1主要存在于血清中，约占血清中IgA的85％，α1链分子量为56kD；IgA2主要存在于外分泌液中，少部分以血清型IgA存在，约占血清中IgA的15％，α2链缺乏铰链区，分子量为52kD。血清中的IgA除单体形式外还有由J链共价相连的二聚体或三聚体等形式。分泌型IgA是由J连接的双体和分泌成分所组成，主要存在于初乳、唾液、泪液、胃肠液、支气管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌型IgA通过与相应的病原微生物(如脊髓灰质炎病毒)结合，阻抑其吸附到易感细胞上，分泌型IgA还可中和毒素如霍乱弧菌毒素和大肠杆毒素等。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染可能与IgA合成不足有关。慢性支气管炎发作与分泌型IgA的减少也有一定关系。产妇可通过初乳将分泌型IgA传递给婴儿，这也是一种重要的自然被动免疫。嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞表达FcαR,血清型单体IgA可介导调理吞噬和ADCC作用。此外，分泌型IgA具有免疫排除功能，即分泌型IgA结合饮食中大量的可溶性抗原以及肠道正常菌群或病原微生物所释放的热原物质，防止它们进入血液。
汞(Mercury，Hg)是一种无处不在的重金属，广泛应用于工业、农业、医药业，是一种非常重要的环境污染物。2011年，美国毒物和疾病登记署(UHgtedStates Agency for Toxic Substances and Disease Registry，ATSDR)已将其列入物质优先列表内(Substance Priority List)，而世界卫生组织(World HealthOrgaHgzation，WHO)也早已将其列为10大最易引起健康问题的化学品之一。在美国，Cr与Hg、Hg、Pb被认为是四大环境污染物，严重影响着人们的身体健康。常见的汞职业暴露人群包括从事金属冶炼、开采金矿、烧煤、电产业和木材生产的人群，而对于普通人群主要通过食入汞污染的海鲜、饮入汞污染水源、吸入燃料燃烧或蒸发的汞蒸气。此外，含汞化妆品的接触、填充汞合金牙科填充物、接触疫苗防腐剂中的乙基汞、含汞杀虫剂的接触都是常见的汞暴露方式，汞与人们的生活密切相关。2009年，国家健康与营养测试调查中发现(NationalHealth and Nutrition Examination Study,NHANES)，2％的美国育龄期妇女体内的汞都超标，可见汞污染是一个亟待解决的问题。
汞一般含有三种形态：金属汞元素、无机汞、有机汞，人们主要接触有机汞及金属汞元素，但是这两种形式的汞均可在生物活体内装换成无机汞。金属汞通常以吸入的方式进入体内，可以被氢—过氧化氢—过氧化氢酶途径被氧化，然后形成无机汞。在脑中，无机汞附着于硒化物以形成硒化汞，硒化汞是不可溶的，将长年停滞于脑内，长期将造成严重的脑损伤。无机汞，通常很难被摄入体内，只有在极少数情况下，会有高达40％的汞通过胃肠道吸收。一旦无机汞进入血流，便分布于各种组织，其不易透过血脑屏障及胎盘屏障，主要在肾脏组织中沉积，因此长期易造成肾脏损害。与无机汞相比，有机汞最容易通过胃肠道吸收。随着有机汞种类的不同，其通过皮肤吸收的效果不同，二甲基汞能迅速经皮肤吸收，而甲基汞则较难。多数有机汞都具有较强的毒性，例如甲基汞(Methylmercury，MeHg)易通过血脑屏障及胎盘屏障，目前认为其有可能导致胎儿学习能力障碍，认知能力低下，抑制胎儿免疫系统，导致胎儿患神经系统疾病等。
汞与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。随着对汞毒性研究的深入，人们逐渐认识到汞与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的角色，被认为是了解汞的毒性机理的关键所在，因此，对汞和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于汞与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与汞之间的关系还不清楚，因而加强对于汞与蛋白质之间的关系至关重要。
发明内容
针对汞污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种汞-IgA螯合物及其制备方法，并建立汞-IgA螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测汞-IgA螯合物在评价一个地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中汞-IgA螯合物可以间接反映这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这个地区汞污染程度。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种汞-IgA螯合物，汞离子与IgA通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
本发明还提供一种上述的汞-IgA螯合物的制备方法，包括以下步骤：
A)汞与IgA的螯合反应：在提纯源于人体的IgA或按照生物学方法重组的IgA中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶液；
B)纯化汞-IgA螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgA以及多余的汞离子，即得汞-IgA螯合物。
其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使汞-IgA螯合物复溶；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgA特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上柱，IgA与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；
(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；
(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
(10)收集：收集洗脱液Ⅱ；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得汞-IgA螯合物。
其中，上述汞-IgA螯合物的制备方法，还包括步骤C)：对汞-IgA螯合物的鉴定；
其中，步骤C)中具体如下：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的汞-IgA螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
(4)检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有汞以及检测汞的含量。
本发明还提供一种如上述的汞-IgA螯合物在制备检测人体内汞-IgA螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种至少包括如上述的汞-IgA螯合物作为标准品的试剂盒。
优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获IgA的物质或捕获汞的物质。
本发明还提供一种定量检测汞-IgA螯合物的方法，以已知含量的上述的汞-IgA螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯汞-IgA螯合物与酶联免疫结合法、提纯汞-IgA螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯汞-IgA螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
实施本发明的汞-IgA螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
1.本发明首次体外合成汞-IgA螯合物；
2.本发明首次提出汞-IgA螯合物可用于制备检测血样中汞-IgA螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
3.本发明建立了汞-IgA螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测汞-IgA螯合物在评价一个地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中汞-IgA螯合物可以间接反映这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这个地区汞污染程度。本发明建立的汞-IgA螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。
附图说明
图1为本发明所述的汞-IgA螯合物的非变性电泳条带图；
图2为本发明所述的汞-IgA螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式获得：
磷酸盐溶液为0.05-0.1mol/L Na2HPO4溶液或0.5-1mol/L Na2HPO4溶液；
提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等(采用PEG法)；
胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
捕获IgA的物质购买自艾美捷科技有限公司的型号为Abcam ab8508的兔Anti-人类IgA H&L；其中，本发明所述与IgA特异性结合的物质、抗IgA抗体、抗IgA抗体均为捕获IgA的物质；
捕获汞的物质为巴傲得生物科技有限公司生产的型号为AP7014的抗汞抗体；其中，本发明所述与汞特异性结合的物质、Hg抗、抗Hg抗体、抗汞抗体均为捕获汞的物质；
酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
底物为甲基联苯胺(TMB)溶液；
洗涤液为含有KH2PO40.2mg/ml、Na2HPO4·12H2O 2.90mg/ml、NaCl8.0mg/ml、KCl 0.2mg/ml、0.5％Tween-20的pH为7.4的0.15M PBS溶液；
封闭液为1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
稀释缓冲液为含1.5mg/mL Na2CO3、2.93mg/ml NaHCO3的PH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；
酶标抗体为HRP酶标抗体；
终止液为：将21.7ml的2M H2SO4定容至200ml的ddH2O中；
洗脱液为含木瓜蛋白酶的PH为8.0的0.1mol/L Tris-HCL缓冲液；
酸化剂为硝酸；
上样缓冲液为含有1M Tris-HCl(pH 6.8)15.5mL、1％溴酚蓝2.5mL、ddH2O7mL、甘氨酸25mL的Sample buffer(5X)；
电泳缓冲液为含Tris 3mg/ml、甘氨酸14.4mg/ml的PH为6.8的ddH2O溶液；
本发明提供一种汞-IgA螯合物，汞离子与IgA通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
本发明还提供一种汞-IgA螯合物的制备方法，包括以下步骤：
A)汞与IgA的螯合反应：在人源的IgA中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶液；
B)纯化汞-IgA螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgA以及多余的汞离子，即得汞-IgA螯合物，具体步骤如下：
(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使汞-IgA螯合物复溶；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgA特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；所述能与IgA特异性结合的填料为含抗IgA抗体的硅胶或树脂；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上柱，IgA与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；
(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；
(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；所述能与汞特异性结合的填料为含抗汞抗体的硅胶或树脂；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
(10)收集：收集洗脱液Ⅱ；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用2升ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得汞-IgA螯合物；
C)对汞-IgA螯合物的鉴定，具体步骤如下：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的汞-IgA螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
(4)检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有汞以及检测汞的含量。
本发明还提供一种至少包括如上述的汞-IgA螯合物作为标准品的试剂盒。
优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获IgA的物质或捕获汞的物质。
在本发明中，能实现本发明目的的试剂盒可以列出以下几种，但并不限于此。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括含有捕获IgA的物质的包被液、封闭液、洗涤液、作为二抗的可捕获汞的物质、酶标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括含有捕获IgA的物质的包被液、封闭液、洗涤液、洗脱液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括含有捕获IgA的物质的包被液、封闭液、洗涤液、洗脱液、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括作为提纯血浆中IgA所需提取试剂、复溶液、含有捕获汞的物质的包被液、封闭液、洗涤液、酶标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括作为提纯血浆中IgA所需提取试剂、复溶液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括作为提纯血浆中IgA所需提取试剂、复溶液、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括作为提纯血浆中IgA的提取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含汞的蛋白条带所需液体、含有捕获汞的物质的包被液、封闭液、洗涤液、酶标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括作为提纯血浆中IgA所需提取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含汞的蛋白条带所需液体、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中汞-IgA螯合物的试剂盒，包括作为提纯血浆中IgA所需提取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含汞的蛋白条带所需液体、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
上述几种试剂盒中，所述阳性对照为标准品，即螯合有重金属汞的IgA螯合物或螯合有重金属汞的BSA螯合物；所述阴性对照为不含有标准品的稀释缓冲液。
上述试剂盒用于检测螯合汞的IgA，以提高检测的准确性，重复性，并使之在临床中得到推广。
本发明还提供一种定量检测汞-IgA螯合物的方法，以已知含量的上述的汞-IgA螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯汞-IgA螯合物与酶联免疫结合法、提纯汞-IgA螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯汞-IgA螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。在本发明中，用检测汞-IgA螯合物的方法可以列出的有以下几种，但并不限于以下几种。
其中，上述定量检测汞-IgA螯合物的方法中采用的试剂如下：
方法一：酶联免疫法(ELISA法)检测汞-IgA螯合物，按照如下步骤检测：
1)将能够捕获IgA的物质，如抗IgA抗体(抗IgA Ab)包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗IgA Ab至稀释500-4000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)从循环系统取血浆，作待检样品，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgA螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
5)加入可以捕获汞的物质，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释至2500-20000倍的抗Hg Ab，37℃作用1-2小时，使抗Hg Ab与IgA上的金属汞反应形成抗原抗体复合物；
6)酶结合物温育：移去抗汞抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，使稀释的酶标抗体的浓度为2μg/mL，37℃作用1-2小时，使其与酶标抗体反应；
7)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟；
8)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
9)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取待检样品和标准品的OD值，通过绘制标准曲线，求得待检样品的含量(也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测)。
该方法利用ELISA原理，可以将血浆中的特异性IgA提取出来，提取出来的IgA上部分螯合有重金属汞，而这部分IgA上的汞被抗汞抗体所捕获，之后可以再被辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获(该抗体不识别包被蛋白)，捕获上的抗体在显色剂及终止液的作用下，可以在仪器下读出OD值，而不含有螯合金属汞的IgA，则不会被抗汞的特异性抗体所捕获，也不会与辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获，而所用试剂中也不含有金属汞(阴性对照组结果为阴性)，因而当所读取的OD值结果显示为阳性时，即可证明检测出IgA上螯合的金属汞。
方法二：酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法)检测汞-IgA螯合物按照如下步骤检测：
1)将能够捕获IgA的物质，如抗IgA抗体(抗IgA Ab)包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗IgA Ab稀释至500-4000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)从循环系统取血浆，作待检样品，1000rpm离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgA螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱液，在37℃下洗脱1-3小时。
6)检测：从ELISA板的微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于IgA上的汞，并绘制标准曲线，读出数值；
该方法利用ELISA原理的基础上结合原子吸收光谱(AAS)原理，利用原子吸收光谱仪检测螯合于IgA上的汞，由于溶液中仅含有IgA，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出IgA上螯合的金属汞。
方法三：酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法(ELISA法+ICP-MS法)检测汞-IgA螯合物按照如下步骤检测：
1)将能够捕获IgA的物质，如抗IgA抗体(抗IgA Ab)包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗IgA Ab稀释至500-4000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)从循环系统取血浆，作待检样品，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgA螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱液，在37℃下洗脱1-3小时。
6)酸化：在步骤5)中的溶液中加入酸化剂对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
7)检测：从步骤6)的ELISA板的溶液中取0.5ml液体，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于IgA的汞，并绘制标准曲线，读出数值。
该方法在利用ELISA原理的基础上，结合感耦合等离子体质谱(ICP-MS)原理，用电感耦合等离子体质谱仪检测螯合于IgA上的汞，由于溶液中仅含有IgA，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出IgA上螯合的金属汞。
方法四：提纯汞-IgA螯合物与酶联免疫结合法(提纯法+ELISA法)检测汞-IgA螯合物，按照如下步骤检测：
1)从血浆中提取IgA：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝胶过滤等方法从血浆提取纯化血液中的IgA，并将IgA复溶于溶液中，得到IgA溶液；
2)将抗Hg Ab包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗Hg Ab稀释至2500-20000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：从步骤1)的溶液中取样，作待检样品；以已知含量的汞-IgA螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
5)酶结合物温育：移去步骤4)中的待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，使稀释的酶标抗体的浓度为2μg/mL，37℃作用1-2小时，使其与酶标抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟；
7)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取待检样品和标准品的OD值，通过绘制标准曲线，求得待检样品的含量(也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测)。
方法五：提纯汞-IgA螯合物与原子吸收光谱结合法(提纯法+AAS法)检测血样中汞-IgA螯合物，按照如下步骤检测：
1)从血浆中提取IgA：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝胶过滤等方法从血浆提取纯化血液中的IgA，并将IgA复溶于溶液中，得到IgA溶液；
2)检测：从步骤1)得到的溶液中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于IgA上的汞，并绘制标准曲线，读出数值。
方法六：提纯汞-IgA螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法(提纯法+ICP-MS法)检测汞-IgA螯合物，按照如下步骤检测：
1)从血浆中提取IgA：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝胶过滤等方法从血浆提取纯化血液中的IgA，并将IgA复溶于溶液中，得到IgA溶液；
2)酸化：从步骤1)得到的溶液中取样，在溶液中加入酸化剂(如硝酸)对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
3)检测：从步骤2)得到的溶液中取0.5ml液体，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于IgA上的汞，并绘制标准曲线，读出数值。
方法七：电泳与酶联免疫法或原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱结合法(电泳法-ELISA法/AAS法/ICP-MS法)检测汞-IgA螯合物，按照如下步骤检测：
1)从血浆中提取IgA：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝胶过滤等方法从血浆提取纯化血液中的IgA，并将IgA复溶于溶液中，得到IgA溶液；
2)制备胶床：根据需要选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶或SDS-聚丙烯酰胺凝胶等作为介质，按照常规方法制备好胶床；
3)加样：取步骤1)得到的溶液8μL加入2μL上样缓冲液，混匀，短暂离心；(注意此处步骤不能煮)
4)电泳：连接电泳板，进行电泳分离；
5)检测：在胶床上找出含有汞的蛋白条带，将该条带取出，经过处理后将该蛋白条带溶于液体之中，然后再分别利用ELISA或ICP-MS或AAS检测溶于液体中的汞含量。此外，还可以利用此方法检测螯合汞的IgA的等电点、分子量及含量等。
方法七中的IgA可以用多种方法提纯出来(例如超速离心法或高压液相层析法或凝胶过滤层析法或凝胶电泳法或ELISA方法等)，将提纯出来的IgA复溶于溶液中，取一定量的IgA，利用电荷移动原理，进行电泳(electrophoresis，EP)，在凝胶板(可根据需要采用不同介质)上可根据分子量、等电点等不同跑出不同的条带，寻找出富含汞的相应条带，将凝胶中的蛋白质复溶于溶液中，即可以在特定波长下检测相关IgA的含量，也可以利用ELISA、AAS、ICP-MS等原理检测出螯合于IgA上的汞含量，由于溶液中仅含有IgA，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出IgA上螯合的金属汞。
实施例1：汞-IgA螯合物的制备方法，包括以下步骤：
A)汞与IgA的螯合反应：在人源的IgA中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶液；
试剂配制：
1)硼酸盐缓冲液(0.01M)：称取0.31g硼酸溶于400ml超纯水中，用0.1M的NaOH调节pH至9.0，定容至500mL。
2)IgA溶液：称取4.0mg IgA溶于4.0mL 0.01M pH9.0硼酸盐缓冲液中，充分振荡溶解，配制成1.0mg/mL的蛋白溶液；
3)EDTA-NaHCO3混合溶液：称取EDTA·2H2O 1.86g、NaHCO316.8g溶于900mL超纯水中，用1.0M NaOH调整pH至8.0定容至1000ml，高压灭菌，室温保存；
4)ITCBE购买自日本同仁化学研究所，货号为M030；
5)透析袋购自Bioshop Inc，截留分子量14000。
汞-IgA螯合物的螯合步骤：
1)透析袋的处理：将透析袋放入500ml的EDTA-NaHCO3混合溶液中，煮沸10min；倾弃EDTA/NaHCO3液，用超纯水轻轻漂洗，再用500ml的5mmol/LEDTA溶液煮沸10min；弃掉煮沸液，用超纯水彻底清洗，加入超纯水浸泡透析袋4℃过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋，用超纯水彻底冲洗其内外表面；
2)取2.0mg ITCBE溶于2ml DMSO中；
3)取4.0mg IgA溶于4.0ml硼酸盐缓冲溶液中；
4)缓慢将步骤2)配制的液体加入步骤3)配制的IgA溶液中，边滴加边震荡，置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgA结合的ITCBE；
5)将步骤4)所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴加80μl的1mmol/L汞离子溶液，边滴加边振荡，以免汞离子使蛋白变性沉淀；
6)将步骤5)所得的溶液置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应2h，用透析袋进行透析24h；
7)将步骤6)透析后的液体于-20℃分装保存，得到反应溶液。
B)纯化汞-IgA螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液(即步骤7)得到的反应溶液)中未反应的IgA以及多余的汞离子，即得汞-IgA螯合物，具体步骤如下：
(1)溶解样品：向经过步骤7)得到的反应溶液中加入生理盐水使汞-IgA螯合物复溶；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgA特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上柱，IgA与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；
(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；
(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
(10)收集：收集洗脱液Ⅱ；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用2升ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得汞-IgA螯合物；
C)对汞-IgA螯合物的鉴定，具体步骤如下：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中8μL提取纯化得到的汞-IgA螯合物，加入2μL上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，加入电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流，环境温度为4℃；电泳至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳；
(4)检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有汞以及检测汞的含量。
D)检测结果
(1)石墨炉原子吸收光谱法(AAS)初步测定IgA中重金属含量：结果见表1
表1 为IgA中重金属含量(μg/L)
样本名 Hg(μg/L)
IgA 134.48
(NH4)2SO4 0.369
N.S 0
N.S 0
(2)电泳结果：
其中，图1为本发明所述的汞-IgA螯合物的非变性电泳条带图。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，因此左边泳道M为变性Marker，只用于检测，没有标记作用，泳道3为IgA的条带。
(3)同步辐射X荧光分析：
蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机(BEPC)的4W1"同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2.2GeV，束流强度100mA。样品移动台(TSA200型，北京卓立汉光公司)可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移动以改变入射光斑位置，移动步长为0.0025mm。从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器(PGT Inc.LS 30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信号用PGT多道分析仪(MCA4000)获取输出。用11.5keV的单色同步辐射光激发样品，调节入射光斑(1mmx3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均匀缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AX IL软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶膜的荧光谱。
图2为本发明所述的汞-IgA螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图，图中横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带各金属能量(含量)值。
本发明一种定量检测汞-IgA螯合物的方法的检测条件的确定：
1.抗IgA抗体、抗汞抗体最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的确定
步骤如下：
(1)将抗IgA Ab用稀释缓冲液按照抗IgA Ab与稀释缓冲液的质量体积比为1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行稀释，加入ELISA板微孔中，将抗IgAAb包被于固相载体上，每个浓度包被三排，4℃过夜18小时；
(2)移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2％牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
(3)待检样品按待检样品与稀释缓冲液的质量体积比为1:10、1:20、1:40进行稀释，加入微孔中，按照上述包被的抗IgA Ab浓度，同一个浓度的抗IgA Ab的分别加入不同稀释度血浆，37℃作用1小时；
(4)移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入抗Hg Ab，抗Hg Ab按抗Hg Ab与稀释缓冲液的质量体积比为1:2500、1:5000、1:10000、1:20000进行稀释，按照每一个相同抗IgA Ab、血浆稀释浓度，不同浓度抗Hg Ab各加2孔，37℃作用1小时，使抗Hg Ab与IgA上的金属汞反应；
(5)酶标抗体选择最适工作浓度，即2μg/mL，移去抗Hg抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释HRP酶标抗体，37℃作用1小时，使HRP酶标抗体与汞-IgA螯合物反应；
(6)移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟；
(7)将终止液滴加至每一微孔；
(8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取各孔OD值。根据各孔OD值数值，选择抗IgA Ab、抗Hg Ab的最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数。
试验中同时以所制标准品作为阳性对照，选择抗IgA Ab+封闭+抗Hg Ab+酶标+底物(即不加待检样品)作为阴性对照1；抗IgA Ab+封闭+血浆+酶标+底物(即不加抗Hg Ab)作为阴性对照2；抗IgA Ab+封闭+酶标+底物(即不加待检样品和抗Hg Ab)作为阴性对照3；抗IgA Ab+封闭+血浆+抗Hg Ab+底物(即不加酶标)作为阴性对照4；封闭+血浆+抗Hg Ab+酶标+底物(即不加抗IgA Ab捕获IgA)作为空白对照1；只加底物作为空白对照2及PBS作为空白对照3。检测结果见表2-3。
表2：棋盘滴定法确定抗IgA Ab、抗Hg Ab的
最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的数据(每个数据皆为平均值)
表3：ELISA阳性对照及阴性对照ELISA检测结果
由表2-3数据显示，我们可以看出当抗IgA Ab的稀释度为1:500、血浆稀释度为1:20、Hg抗稀释度为1:2500时，OD值最大，所以选此值所对应的浓度作为最佳工作浓度。
2.定量检测汞-IgA螯合物的方法中方法二、三中洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间的确定
步骤如下：(1)包被：将抗Hg Ab用稀释缓冲液稀释至2500倍(质量体积比)，加入ELISA板微孔中，37℃水浴3小时，储存冰箱；
(2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2％牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
(3)移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，酶标抗体稀释至浓度为2μg/mL，37℃作用2小时，使其与抗Hg Ab反应；
(4)准备洗脱液：将木瓜蛋白酶用pH 8.0,0.1mol/L Tris-HCI缓冲液配制成100ng/ml，再加入1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)37℃孵育30min；
(5)移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中的木瓜蛋白酶的浓度与酶标抗体的浓度之比为1:80、1:40、1:20、1:10、1:5(其中每个浓度作3个复孔)，分别放置于37℃温度下洗脱1h、2h、3h；
(6)移去洗脱液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟；
(7)将终止液滴加至每一微孔；
(8)取405nm波长，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取每组OD值，通过与PBS缓冲液组比较，比较出洗脱液的最适浓度及洗脱时间，具体结果参见表4。
表4：ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
从表4中我们可以发现，当洗脱液中的木瓜蛋白酶的浓度与酶标抗体的浓度之比＝1:20时，各组OD值均低于其他几组，说明该浓度洗脱液洗脱效果最优(即将ELISA孔壁上结合的抗Hg Ab-酶标复合物洗脱程度达到最大，因而OD值最低)；而洗脱时间不管是1h、2h、3h，各组OD值变化均不大，可见随着时间的延长，酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的情况下，延长消化时间并不能提高消化率，所以本试验中洗脱液的洗脱时间为1-3h皆可。
应用实施例1
取采用ELISA法检测100份标本血浆中的汞-IgA螯合物，按照以下步骤进行检测：酶联免疫法(ELISA法)检测汞-IgA螯合物，按照如下步骤检测：
1)将抗IgA Ab包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗IgA Ab稀释至500倍，加入ELISA板微孔中，37℃水浴1小时，储存冰箱；
2)从循环系统取血浆，作待检样品，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加2％牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgA螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37℃作用1小时；
5)加入可以捕获汞的物质，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释2500倍，37℃作用1小时，使抗HgAb与IgA上的金属汞反应；
6)酶结合物温育：移去抗汞抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37℃作用1小时，使其与酶标抗体反应；
7)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟；
8)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
9)取波长为405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取待检样品OD值(也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测)，具体检测值如表5所示。
表5：100份血样标本中汞-IgA螯合物的ELISA检测结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
OD405 0.327 0.446 0.399 0.579 0.553 0.449 0.435 0.54 0.525 0.461
编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
OD405 0.403 0.484 0.346 0.367 0.41 0.602 0.355 0.576 0.402 0.42
编号 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
OD405 0.483 0.463 0.49 0.422 0.461 0.516 0.412 0.343 0.494 0.478
编号 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
OD405 0.536 0.503 0.35 0.341 0.408 0.573 0.375 0.444 0.579 0.425
编号 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
OD405 0.5 0.519 0.374 0.312 0.518 0.488 0.352 0.631 0.391 0.516
编号 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
OD405 0.522 0.554 0.42 0.326 0.438 0.372 0.628 0.486 0.571 0.312
编号 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
OD405 0.635 0.604 0.584 0.582 0.344 0.338 0.463 0.319 0.328 0.508
编号 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
OD405 0.595 0.421 0.388 0.451 0.304 0.458 0.467 0.445 0.427 0.548
编号 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
OD405 0.427 0.351 0.583 0.599 0.452 0.554 0.562 0.437 0.507 0.601
编号 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
OD405 0.303 0.451 0.471 0.442 0.331 0.59 0.443 0.602 0.474 0.348
应用实施例2
采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法)检测100分标本血样中的汞-IgA螯合物，按照如下步骤检测：
1)将能够捕获IgA的物质，如抗IgA抗体(抗IgA Ab)包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗IgA Ab稀释至500倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜18小时；
2)从循环系统取血浆，作待检样品，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgA螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释将待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37℃作用1小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入木瓜蛋白酶浓度为100ng/ml的洗脱液，洗脱1-3小时；
6)检测：从ELISA板的微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于IgA上的汞，检测值如表6所示。
表6：100份血样标本中汞-IgA螯合物的AAS检测结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
μg/L 0.003 0.044 0.05 0.041 0.067 0.074 0.032 0.051 0.018 0.017
编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
μg/L 0.032 0.047 0.072 0.029 0.062 0.066 0.055 0.055 0.002 0.011
编号 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
μg/L 0.077 0.054 0.053 0.006 0.048 0.008 0.019 0.04 0.045 0.057
编号 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
μg/L 0.061 0.074 0.024 0.042 0.071 0.019 0.009 0.057 0.023 0.073
编号 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
μg/L 0.058 0.044 0.037 0.051 0.077 0.043 0.033 0.004 0.052 0.043
编号 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
μg/L 0.071 0.039 0.047 0.025 0.045 0.019 0.011 0.002 0.003 0.062
编号 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
μg/L 0.037 0.005 0.033 0.077 0.07 0.015 0.006 0.066 0.059 0.002
编号 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
μg/L 0.009 0.047 0.059 0.036 0.059 0.013 0.022 0.003 0.002 0.06
编号 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
μg/L 0.004 0.072 0.067 0.003 0.043 0.014 0.073 0.043 0.035 0.065
编号 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
μg/L 0.031 0.042 0.037 0.031 0.004 0.029 0.058 0.073 0.017 0.013
应用实施例3
采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法(ELISA法+ICP-MS法)检测100分标本血样中的汞-IgA螯合物含量，按照如下步骤检测：
1)将能够捕获IgA的物质，如抗IgA抗体(抗IgA Ab)包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗IgA Ab稀释至500倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜18小时；
2)取100份标准血样作为待检样品，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2％牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgA螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37℃作用1小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入木瓜蛋白酶浓度为100ng/ml的洗脱液，洗脱1-3小时；
6)酸化：在步骤5)中的溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
7)检测：从步骤6)得到的溶液中取样，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于IgA的汞，检测值如表7所示。
表7：100份血样标本中汞-IgA螯合物的ICP-MS检测结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
μg/L 0.038 0.032 0.06 0.08 0.014 0.058 0.054 0.059 0.078 0.001
编号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
μg/L 0.023 0.031 0.044 0.026 0.003 0.051 0.018 0.054 0.029 0.057
编号 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
μg/L 0.033 0.043 0.074 0.006 0.075 0 0.033 0.052 0.008 0.012
编号 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
μg/L 0.036 0.023 0.017 0.026 0.058 0.075 0.025 0.005 0.032 0.004
编号 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
μg/L 0.057 0.063 0.043 0.057 0.018 0.023 0.076 0.035 0.079 0.047
编号 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
μg/L 0.033 0.007 0.059 0.037 0.03 0.024 0.039 0.002 0.025 0.019
编号 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
μg/L 0.026 0.061 0.03 0.071 0.035 0.065 0.029 0.017 0.021 0.005
编号 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
μg/L 0.027 0.026 0.06 0.011 0.001 0.021 0.056 0.069 0.072 0.004
编号 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90
μg/L 0.007 0.067 0.07 0.034 0.01 0.021 0.011 0.055 0.055 0.002
编号 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
μg/L 0.069 0.058 0.033 0.07 0.01 0.014 0.052 0.027 0.054 0.048
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种汞-IgA螯合物，其特征在于，汞离子与IgA通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
2.一种如权利要求1所述的汞-IgA螯合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A）汞与IgA的螯合反应：在提纯源于人体的IgA或按照生物学方法重组的IgA中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶液；
B）纯化汞-IgA螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgA以及多余的汞离子，即得汞-IgA螯合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤B）具体如下：
（1）溶解样品：向经过步骤A）得到的反应溶液中加入生理盐水使汞-IgA螯合物复溶；
（2）平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgA特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
（3）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1）中样品，然后上柱，IgA与填料特异性结合；
（4）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；
（5）收集：收集洗脱液Ⅰ；
（6）透析：将步骤（5）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；
（7）平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
（8）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6）中样本，然后上柱；
（9）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
（10）收集：收集洗脱液Ⅱ；
（11）透析：将步骤（10）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得汞-IgA螯合物。
4.根据权利要求2所述的汞-IgA螯合物的制备方法，其特征在于，还包括步骤C）：对汞-IgA螯合物的鉴定；
其中，步骤C）中具体如下：
（1）制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
（2）加样：取步骤B）中提取纯化得到的汞-IgA螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
（3）电泳：连接电泳板，进行电泳；
（4）检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有汞以及检测汞的含量。
5.一种如权利要求1所述的汞-IgA螯合物在制备检测血样中汞-IgA螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
6.一种至少包括如权利要求1所述的汞-IgA螯合物作为标准品的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括包被液，该包被液含有捕获IgA的物质或捕获汞的物质。
8.一种定量检测汞-IgA螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的权利要求1所述的汞-IgA螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯汞-IgA螯合物与酶联免疫结合法、提纯汞-IgA螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯汞-IgA螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
CN201510412223.3A 2015-07-14 2015-07-14 一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用 Pending CN104987408A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510412223.3A CN104987408A (zh) 2015-07-14 2015-07-14 一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510412223.3A CN104987408A (zh) 2015-07-14 2015-07-14 一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104987408A true CN104987408A (zh) 2015-10-21

Family

ID=54299323

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510412223.3A Pending CN104987408A (zh) 2015-07-14 2015-07-14 一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104987408A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006123343A2 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Biologically active metal-coated proteins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006123343A2 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Biologically active metal-coated proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘冬等: "《生物分离技术》", 31 December 2007 *
吴士良等: "《生物化学与分子生物学实验教程》", 28 February 2009 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104987411A (zh) 一种镉-IgA螯合物及其制备方法和应用
CN104987412A (zh) 一种砷-IgE螯合物及其制备方法和应用
CN104987408A (zh) 一种汞-IgA螯合物及其制备方法和应用
CN105004684A (zh) 一种镍-IgE螯合物及其制备方法和应用
CN105004685A (zh) 一种汞-IgE螯合物及其制备方法和应用
CN104987413A (zh) 一种砷-IgA螯合物及其制备方法和应用
CN104987406A (zh) 一种镍-IgA螯合物及其制备方法和应用
CN105037536A (zh) 一种镉-IgE螯合物及其制备方法和应用
CN104987400A (zh) 一种汞-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用
CN104987410A (zh) 一种铅-IgE螯合物及其制备方法和应用
CN105037537A (zh) 一种铅-IgA螯合物及其制备方法和应用
CN105137059A (zh) 一种汞螯合型免疫复合物及其制备方法和应用
CN104987409A (zh) 一种铅-IgG螯合物及其制备方法和应用
CN105044004B (zh) 一种汞‑IgM螯合物及其制备方法和应用
CN105001321A (zh) 一种汞-纤维蛋白原螯合物及其制备方法和应用
CN105044005B (zh) 一种铬-IgA螯合物及其制备方法和应用
CN105037533A (zh) 一种砷-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用
CN105044006A (zh) 一种汞-IgG螯合物及其制备方法和应用
CN104987414A (zh) 一种镍-IgM螯合物及其制备方法和应用
CN104987401A (zh) 一种镉-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用
CN104987405B (zh) 一种砷‑IgG螯合物及其制备方法和应用
CN104987402A (zh) 一种铅-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用
CN105153299A (zh) 一种铅-IgM螯合物及其制备方法和应用
CN104987389A (zh) 一种砷-白蛋白螯合物及其制备方法和应用
CN105004683B (zh) 一种铬-IgE螯合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151021