CN104983735B

CN104983735B - Estrone在制备抗卵巢癌和/或乳腺癌产品中的应用

Info

Publication number: CN104983735B
Application number: CN201510386061.0A
Authority: CN
Inventors: 师咏勇; 宋智健
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2018-09-14
Anticipated expiration: 2035-06-30
Also published as: CN104983735A

Abstract

本发明公开了Estrone在制备抗卵巢癌和/或乳腺癌产品中的应用。本发明提供了Estrone在制备治疗卵巢癌和/或乳腺癌产品中的应用。本发明的实验证明，本发明对FDA,CFDA已获批准的药物Estrone进行肿瘤药物重定位，根据肿瘤不同的细胞系(组织类型)以及突变位点对适应症不是抗肿瘤的药物进行筛选，发现Estrone抗卵巢癌和/或乳腺癌这种新用途，实现旧药新用。

Description

Estrone在制备抗卵巢癌和/或乳腺癌产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Estrone在制备抗卵巢癌和/或乳腺癌产品中的应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的最常见也是最严重的一种疾病，研发高效抗肿瘤药物对延长患者的生存周期至关重要。近年来，随着肿瘤基因组学学和分子药理学的飞速发展，新型抗肿瘤药物的研发取得了不错的成果，但由于新药研发投入大，周期长等瓶颈无法克服，以及肿瘤个体遗传变异大等特征，导致许多传统抗肿瘤药物效果不加，新药价格昂贵，副作用未明。

Barabasi AL等研究者在2011年发表于《Nature Reviews Genetics》的论文中指出，基于GWAS研究结果和互作组学(interactome)策略开展的分子网络分析有望揭示复杂疾病新的药物靶点和分子标志物，并最终形成对疾病发病机制和治疗方案全新的认识。更值得注意的是，药物重定位(drug repositioning)研究发现，GWAS研究锁定的易感基因及与其有蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)的基因更容易成为药物间接的靶点，这一发现有助于解释现有药物的作用机制并指导新药的研发。2014年，OkadaY等研究者在《Nature》上发表的论文中显示GWAS研究结果整合分析得到的类风湿性关节炎的101个易感基因中有98个目前正用于治疗类风湿性关节炎药物的直接或间接靶标，而且还通过药物重定位研究，他们还发现了数十个已获批准用于其他适应症的药物也可用于治疗类风湿性关节炎。

发明内容

本研究正是通过整合癌症组学Cosmic version72数据库的癌症基因谱CancerGene Census以及蛋白质相互作用STRING version 10数据库和DrugBankversion4.2中FDA批准的药物数据库，获得的候选重定位药物，对肿瘤细胞系进行筛查实验，筛选出新的抗肿瘤药物。做肿瘤细胞系筛选的候选肿瘤抑制药物见如下:

Nicardipine,Promethazine,Estrone,Estrone,Sunlidac,Estrone,Etonogestrel,Levonorgestrel,Mesalazine,Indomethacin,Sulfasalazine,Balsalazide,Irbesartan,Ibuprofen,Isoprenaline,Pentosan Polysulfate。

本发明的一个目的是提供Estrone的新用途。

本发明提供的Estrone在制备治疗卵巢癌和/或乳腺癌产品中的应用。

本发明的第二个目的是提供Estrone的新用途。

本发明提供了Estrone在制备抑制卵巢癌细胞和/或乳腺癌细胞增殖产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供Estrone的新用途。

本发明提供了Estrone在制备降低卵巢癌细胞和/或乳腺癌细胞IC50值产品中的应用。

上述应用中，所述卵巢癌细胞为SKOV-3；所述乳腺癌细胞为HCC1395。

上述应用中，所述产品为药物或试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分为Estrone；所述产品具有如下至少一种功能：

1)治疗卵巢癌和/或乳腺癌；

2)抑制卵巢癌细胞和/或乳腺癌细胞增殖；

3)降低卵巢癌细胞和/或乳腺癌细胞IC50值。

上述产品中，所述卵巢癌细胞为SKOV-3；所述乳腺癌细胞为HCC1395。

上述产品中，所述产品为药物或试剂盒。

本发明的实验证明，本发明对FDA,CFDA已获批准的药物Estrone进行肿瘤药物重定位，根据肿瘤不同的细胞系(组织类型)以及突变位点对适应症不是抗肿瘤的药物进行筛选，发现Estrone抗卵巢癌和/或乳腺癌这种新用途，实现旧药新用。

附图说明

图1为96孔培养板药筛药物板型分布。

图2为Estrone对卵巢癌敏感；EC50＝16.4284；IC50＝21.5327；R²＝0.9875。

图3为Estrone对乳腺癌敏感；EC50＝74037.5043；IC50＝67.9510；R²＝0.9909。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中待测药物为Estrone，其化学结构式如下：

其为drug bank产品，产品目录号为DB00655。

下面实施例中的卵巢癌细胞SKOV-3、人肺癌细胞NCI-H1437和大细胞肺癌细胞NCI-H460、乳腺癌细胞HCC1395的出处如下：

SKOV-3 ATCC HTB-77

NCI-H1437 ATCC CRL-5872

NCI-H460 ATCC HTB-177

HCC1395 ATCC CRL-2324

下面实施例中的主要的仪器及耗材

DMSO(from Sigma,Cat.No.D4540)

96-well白色底透细胞培养板(from Corning,Cat.No.3610)

CellTiter Glo试剂盒(from Promega,Cat.No.G7573)

Doxorubicin阳性药(from MCE,Cat.No.HY-15142)

Fetal Bovine Serum(from Gibco,Cat# 10099141)

100mm培养皿(from Corning,Cat# 430167)

RPMI-1640medium(from Gibco,Cat# A1049101)

DMEM medium(from Gibco,Cat# 11995081)

DMEM/F12medium(from Gibco,Cat# 11330057)

EMEM medium(from Gibco,Cat# 10370021)

Mutidrop 384细胞分液器(Thermo,Cat# 5840150)

EnSpire多功能读板机(Perkin Elmer,Cat# 2300-001M)

实施例1、CELLTITER-GLO检测Estrone抗卵巢癌和/或乳腺癌

一、待测孔板的制备

1、细胞铺板

a)配制各个细胞所需完全培养基。

b)实验开始前，确认标记在100mm培养皿上的药筛细胞名字，培养基以及传代时间，代次等信息，确保实验无误。

c)贴壁细胞操作参考步骤d)到i),悬浮细胞操作参考步骤j)到l)。

d)无菌操作时利用真空泵吸取细胞培养基。

e)用2ml的无菌PBS溶液润洗细胞表层，再用真空泵吸出PBS废液。

f)向培养皿轻轻加入1ml 0.25％(w/v)Trypsin-0.038％(w/v)EDTA溶液消化细胞，轻轻混匀几下，溶液覆盖住细胞表层，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，在细胞将要脱落时终止胰酶消化作用。

g)向培养皿中加入5ml 37℃预热好的完全培养基，用移液管轻轻吹打细胞，使其从培养皿底部脱落下来。

h)将此细胞悬液转移到15ml或50ml无菌离心管中，1000rpm离心5min。

i)利用真空泵无菌操作吸出上清培养基。加入5ml 37℃预热好的完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀。

j)用移液管轻轻吹打细胞，使其从培养皿底部完全脱落下来。

k)将此细胞悬液转移到15ml或50ml无菌离心管中，1000rpm离心5min。

l)利用真空泵无菌操作吸出上清培养基。加入5ml 37℃预热好的完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀。

m)用细胞计数仪对细胞悬液进行计数，调整细胞悬液至合适密度接板进行细胞铺板实验。

将SKOV-3细胞按照上述方法进行，得到SKOV-396孔细胞培养板。

SKOV-3细胞，完全培养基为McCOY'S 5A，为life产品，16600082，接板密度(cells/well)为12000。

2、待测药物Estrone配制和加药(200X终浓度):

1)待测药物Estrone母板配制

a)用DMSO将待测药物Estrone稀释到20mM待用。

b)取a)步骤中配置好的20mM待测药物79μL加入稀释板第一行第一孔中，随后加入54μL的DMSO溶剂到第一行第二孔至第九孔中，从第一孔中取25μL溶液到第二孔中，混匀后从第二孔中取25μL溶液到第三孔中，依次类推到第九孔，保证药物逐次进行3.16倍倍比梯度稀释。

2)阳性药Doxorubicin(MCE,Cat.No.HY-15142)母板配制

a)用DMSO将阳性药Doxorubicin稀释到6mM待用。

b)将6mM阳性药Doxorubicin溶液加入稀释板中，DMSO溶液1:3.16倍倍比梯度稀释该待测药物。

3、药物工作板配制及加药

a)待测药物及阳性药加样模板如下图1所示，其中，S1208:阳性药Doxorubicin,DMSO:阳性对照孔,Cpd 1,2,3:待测药物,DMSO终浓度为0.5％(DMSO兼容性)。

b)向工作板中加入95μl细胞特定的完全培养基，每个药物对应9个孔，用多道排枪从待测药物和阳性药doxorubicin母板中分别依次转移5μl一系列(9个孔)倍比稀释好的溶液(10X终浓度)，得到含有不同浓度药物的细胞培养基。

c)从培养箱中取出步骤1制备SKOV-396孔细胞培养板，按图1加药板型排列方式(图1)分别向SKOV-396孔细胞培养板中加入10μl上述b)制备的含有不同浓度药物的细胞培养基(10X终浓度)，放入到CO₂培养箱37℃培养72h，得到SKOV-3的96孔药筛板。

以不加任何药物的作为对照孔。

上述待测药物、阳性药Doxorubicin和对照孔在96孔板中的终浓度及加药情况如下：

待测药物在图1的2-10孔中的终浓度(μM)依次为:100、31.64557、10.01442、3.16912、1.002886、0.317369、0.100433、0.031783、0.010058；

阳性药Doxorubicin在图1的2-10孔中的终浓度(μM)依次为:30、9.493671、3.004326、0.950736、0.300866、0.095211、0.03013、0.009535、0.003017；

此外，96孔板中S1208孔(E1-H1和A12-D12):10μl终浓度100μMDoxorubicin溶液(溶剂为包含0.5％DMSO的完全培养基溶液),DMSO孔(A1-D1,E12-H12和A11-H11):10μl包含0.5％DMSO的完全培养基溶液。

二、CELLTITER-GLO荧光细胞活性检测系统检测

1、CellTiter-Glo试剂配制

a)使用前，将CellTiter-Glo试剂Buffer融化，平衡到室温使用。

b)使用前，将CellTiter-Glo试剂冻粉底物融化，平衡到室温使用。

c)取100ml平衡好的CellTiter-Glo Buffer加入到瓶装CellTiter-Glo试剂冻粉底物中，使其充分重悬形成酶/底物混合物，也就是所谓的CellTiter-Glo检测试剂。

d)轻轻混匀涡旋，并反复倒置获得均匀的溶液。一般来说，1分钟内CellTiter-Glo底物试剂就会充分溶解，分装，避光保存在-20℃备用，避免反复冻融。

2、检测

a)检测前，将上述一的3得到的SKOV-3的96孔药筛板在室温中平衡20-30分钟。

b)倒置显微镜观察每块培养板的细胞形态及死亡情况，标记出异常情况并复测一次。

c)向所有药筛孔中加入100μl上述1制备的CellTiter-Glo试剂，混匀。

d)在96孔微孔板振荡器上充分震荡混匀2分钟，使细胞完全裂解。

e)避光室温放置15分钟后进行冷光信号检测，保证信号的稳定性。

f)使用EnSpire多功能读板机570nm时读取冷光信号。

g)分析处理数据。

SKOV-3的96孔药筛板结果如图2所示。

计算IC50值，结果如表1所示。

采用同样的方法检测Estrone作用乳腺癌细胞HCC1395，细胞的IC50值，结果如表1和图3。

乳腺癌细胞HCC1395完全培养基为RPMI-1640，为life产品，A1049101，接板密度(cells/well)为6000。

采用同样的方法检测Estrone作用人肺癌细胞NCI-H1437和大细胞肺癌细胞NCI-H460，细胞的IC50值，结果如表1。

可以看出，Estrone对卵巢癌细胞增殖具有特异抑制作用，可以用来作为治疗卵巢癌的药物。

表1 为不同细胞在Estrone药物作用下的IC50值

Claims

1.Estrone在制备治疗卵巢癌和/或乳腺癌产品中的应用；

所述卵巢癌细胞为SKOV-3；所述乳腺癌细胞为HCC1395。

2.Estrone在制备抑制卵巢癌细胞和/或乳腺癌细胞增殖产品中的应用；

所述卵巢癌细胞为SKOV-3；所述乳腺癌细胞为HCC1395。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或试剂盒。