CN104974213A

CN104974213A - 五环三萜化合物结构衍生物的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104974213A
Application number: CN201410143568.9A
Authority: CN
Inventors: 王宏林; 白晶
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2034-04-10
Also published as: CN104974213B

Abstract

本发明涉及了6种用于治疗银屑病的新化合物及其制备方法和应用，本发明所述的6种化合物是母化合物acetyl-11-keto-β-boswellic acid（AKBA）通过水解和酯化反应修饰得到系列衍生物。与化学修饰前的母化合物AKBA相比，化合物结构式（II-VII）所示的6种化合物在体外试验中能够更有效抑制角质形成细胞的分裂、增殖，活体试验中能够更有效治疗小鼠的“银屑病”。可用于制备治疗银屑病的药物。

Description

五环三萜化合物结构衍生物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及具有治疗银屑病用途的新化合物，具体说是11羰基-β-乙酰乳香酸（acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA）经过化学修饰得到的新衍生物。

背景技术

银屑病是一种常见的慢性、复发性、炎症性的皮肤病，其特征是在红斑上反复出现多层银白色干燥鳞屑。中医古称之为“白疕”，古医籍亦有称之为松皮癣。西医称为银屑病，俗称牛皮癣，其特征是出现大小不等的丘疹，红斑，表面覆盖着银白色鳞屑，边界清楚，好发于头皮、四肢伸侧及背部。春冬季节容易复发或加重，而夏秋季多缓解。据调查据调查，银屑病的发病率占世界人口的0.1％-3％，黄种人发病率约为0.3％，我国有患者约500万。该病在人群中的发病率白种人明显高于黄种人，黑种人次之。我国每年要花费大量外汇用于进口治疗牛皮癣药物，尤其是价格昂贵的小分子生物类药物。因此，研究开发我国自主知识产权的治疗银屑病药物势在必行。申请者多年的研究结果表明：与正常人的皮肤相比，牛银屑病患者的表皮和真皮内核酸转录因子NF-kappa-B的过度活化，导致了TNF-alpha、IL-23以及IL-17等炎症因子的大量释放，过量的TNF-alpha IL-23以及IL-17等炎症因子诱发了人类的银屑病。

目前，治疗银屑病的药物中有一种肿瘤坏死因子制剂etanercept(依那西普)是美国FDA批准用于银屑病治疗的生物制剂。这种药物为人源化抗体，它的作用机理是阻隔肿瘤坏死因子的受体。由于肿瘤坏死因子在基体正常免疫反应中不可缺少，这种人源化抗体没有选择性地阻挡肿瘤坏死因子会导致用药后的副作用，甚至停药后疾病容易反弹。而且，由于这种药物是抗体、生产成本高、价格昂贵、普通病人很难能承受。

另外，乌特津单抗（ustekinumab）用于中和IL-23的单克隆抗体在临床上对银屑病有很好的治疗效果，但是生产成本高、价格昂贵。

11羰基-β-乙酰乳香酸的英文全名是:acetyl-11-keto-β-boswellic acid，简称AkβBA，是植物卡式乳香树的胶状树脂-乳香含有的重要成分之一。从天然乳香树提取物中富集纯化AKBA已经描述于国际专利申请WO03/0746，美国专利20030199581以及国际专利申请WO03/077860。更高纯度的产品可以通过色谱分离以及重结晶而获得。

乳香提取物已经在传统的医药中被用作抗炎剂，如对关节炎以及溃疡性结肠炎患者的治疗。另外乳香酸由于其抗增殖作用而受到关注，乳香酸在体外可以抑制几种白血病细胞株，黑素瘤的生长和细胞凋亡。对乳香酸的研究表明，11羰基-β-乙酰乳香酸显示最显著的5-LOX抑制活性（British J Pharmacology，1996，117，615-618）。

申请人多年来一直致力于银屑病发病机理和治疗方法的研究。申请人已运用银屑病小鼠模型明晰了AKBA治疗银屑病的分子免疫学机理。申请人将此研究结果于2009年10月发表在The Journal of Immunology（Wang,et al.,2009,183(7):4755-63），该创新性的研究成果一经发表就受到国际同行的高度关注，并被2009年12月出版的国际权威杂志Nature Reviews Rheumatology作为科研亮点报道。最近，申请人又发现通过对AKBA化学修饰得到的新化合物具有更显著的抑制小鼠银屑病模型以及在体外和体内抑制肿瘤生长的作用。

总的来说，已有的治疗银屑病药物生产成本高、靶向性差，11羰基-β-乙酰乳香酸具有巨大潜在优良用途，申请人通过化学修饰在乳香酸原有生物学功效上更大幅度地提高了化合物在小鼠体内抑制银屑病和肿瘤的能力。所以，本发明将提供一种11羰基-β-乙酰乳香酸经过化学修饰得到的新化合物，以所述新化合物为活性组分的组合物，以及上述化合物、组合物在制备治疗银屑病和肿瘤的药物中的应用。

发明内容

本发明提供了一类新型化合物为AKBA衍生物，具有分子式（II-VII）。简称为：M1、M2、M3、M4、M5、M6。

本发明所述的分子式如（II-VII）所示的AKBA类衍生物在制备治疗银屑病药物中的用途，按下列步骤进行：

a、以AKBA的含量约为60%的市售商品化乳香提取物为原料，加入浓度为100%的甲醇重结晶4-5次；

b、将重结晶产品用二氯甲烷溶解，用硅胶色谱进行吸附，用乙酸乙酯-石油醚洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，点板，合并洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得AKBA，以HPLC测得含量不低于98%；

c、将步骤b得到的AKBA加入双口瓶中，加入KOH，在氮气保护下加入异丙醇作为溶剂，加热回流反应约6小时，待反应体系冷却至室温，使用旋转蒸发仪旋干溶剂，得到白色固体，加入二氯甲烷后加入稀盐酸调节混合体系pH值至酸性。用二氯甲烷萃取水相3次，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥，旋干溶剂得到棕色油状产物，使用乙烷：乙酸乙酯（90：10）作为洗脱剂用柱层析法提纯，得到白色固体KBA。

d、将步骤c得到的KBA溶于二氯甲烷（含有2mol%4-二甲基吡啶），加入1.5当量的三乙胺和1.2当量的酰化试剂，冰浴过夜。反应完全后，用10%的碳酸氢钠溶液处理，并用二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷溶剂，用无水硫酸镁干燥混合物，旋干溶剂得到白色固体，用乙烷：乙酸乙酯（90：10）作为洗脱剂用柱层析法提纯，得到酰化产物即AKBA衍生物。

在实施本方法中6种有效化合物包括：M1，3-O-乙氧乙二羰基-11-酮-β-乳香酸；M2，3-O-丙酰基-11-酮-β-乳香酸；M3，3-O-丁酰基-11-酮-β-乳香酸；M4，3-O-戊酰基-11-酮-β-乳香酸；M5，3-O-苯乙酰基-11-酮-β-乳香酸；M6，3-O-单甲酯丙二酰基-11-酮-β-乳香酸。

本发明中M1、M2、M3、M4、M5、M6化合物分别按常规制药方法，用药学上可以接受的辅料组成外用剂型。其中所述的M1、M2、M3、M4、M5、M6化合物的重量含量为0.1%-1%。

本发明所述的M1、M2、M3、M4、M5、M6化合物制备治疗银屑病的药物，是从含有60%AKBA的商品化试剂中重结晶、纯化得到AKBA，采用易得、低毒、低污染的原料，再经过水解和酯化得到6种AKBA衍生物，最后将这6种AKBA衍生物按常规制药方法分别制成外用制剂。

本发明针对银屑病发病机制，采用相关的药理学实验方法进行了M1、M2、M3、M4、M5、M6化合物治疗银屑病的体内外药效实验，分别从NF-kappa B炎症信号通路活性、角质形成细胞分裂增殖、真皮淋巴细胞浸润、表皮厚度等方面进行药效研究，说明M1、M2、M3、M4、M5、M6化合物在用于治疗银屑病方面的药物用途。

本发明所述M1、M2、M3、M4、M5、M6化合物在制备治疗银屑病药物中的用途，实验表明使用M1、M2、M3、M4、M5、M6化合物后，可以抑制NF-kappaB炎症信号通路的活性，降低银屑病小鼠模型的表皮厚度，减少银屑病小鼠模型真皮中淋巴细胞的浸润，改善小鼠银屑病表型。

附图说明

图1：具有分子式（II-VII）的化合物抑制NF-kappa B的活化试验。

A，8组试验小鼠代表性照片；B，8组试验小鼠荧光强度统计。^***p<0.001，Student’s T test。

图2：具有分子式（II-VII）的化合物在体外试验中抑制角质形成细胞的增殖试验。

图3：具有分子式（II-VII）的化合物治疗“银屑病”的小鼠表型分析。

图4：具有分子式（II-VII）的化合物治疗“银屑病”小鼠的表皮厚度及炎症细胞侵润分析。

A，表皮厚度分析；B，炎症细胞侵润分析。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，Student’s T test。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明，下面以具体实施例对本发明作详细说明，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。本发明所用AKBA衍生物为本课题组自制得到，纯度>98%。

实施例1：具有分子式（II-VII）的化合物的凝胶的制备

取一定量的具有分子式（II-VII）的化合物中的任何一种按下列配方制成凝胶：

分子式为（II-VII）的化合物中的任何一种100毫克

卡波姆400毫克

甘油550毫克

丙二醇650毫克

防腐剂100毫克

三乙醇胺200毫克

加水至5毫升。

制备方法：

称取处方量的分子式为（II-VII）的化合物中的任何一种至烧杯中，称取处方量的卡波姆加入其中，过夜使其充分溶胀，再按照处方量加入甘油、丙二醇、防腐剂、水和三乙醇胺，搅拌均匀，使组合物pH值为5.8。

实施例2：分子式为（II-VII）的化合物体内抑制NF-kappa B通路的试验（图1）

NF-kappa B的Luciferase（荧光素酶）转基因小鼠每组6只，共8组Control（Ctr，空白凝胶组）、M1治疗组、M2治疗组、M3治疗组、M4治疗组、M5治疗组、M6治疗组和AKBA治疗组。先用咪喹莫特诱导小鼠7天。从第8天始用0.5%M1-M6和0.5%AKBA凝胶治疗“银屑病”小鼠4次（每天1次）后，用小动物活体成像系统成像。通过分析得出0.5%的分子式为（II-VII）的化合物比0.5%AKBA更有效抑制了NF-kappa B的活化。

实施例3：具有分子式（II-VII）的化合物体外抑制角质形成细胞生长的试验（图2）

取对数生长期的原代小鼠细胞种96孔板，每孔2×10⁴个细胞，分别加入呈梯度浓度的AKBA衍生物和AKBA，总体积为100μl，对照组加入终浓度为0.25%的DMSO，空白对照孔仅加入100μl培养基，每组均设三个复孔。细胞培养箱培养24小时后，每孔加入CCK-8溶液10μl，将培养板放置于培养箱（37℃，5%CO₂条件下）避光孵育4小时取出。酶标仪测定450nm波长处的O.D.值。计算抑制率：抑制率=【1-（实验组O.D.值/对照组O.D.值）】×100%。其中分子式为（II-VII）的化合物比AKBA能更加有效地抑制角质形成细胞的分裂、增殖。

实施例4：分子式为（II-VII）的化合物凝胶治疗小鼠类银屑病的试验（图3-4）

取6-8周龄的Balb/C小鼠若干只，分8组。分别为Control（Ctr，空白凝胶）、M1治疗组、M2治疗组、M3治疗组、M4治疗组、M5治疗组、M6治疗组和AKBA治疗组。每组9-11只试验小鼠。每天使用咪喹莫特（62.5mg/只/天）涂于小鼠背部造小鼠“银屑病”模型连续7天，8-14天每天治疗1次，第15天给小鼠的“银屑病”皮损处拍照。随后引颈处死小鼠，剪取皮损处皮肤，4%多聚甲醛固定，制作HE病理切片。从疾病表型及病理切片中表皮面积和真皮炎性细胞的浸润观察，得出分子式为（II-VII）的化合物和AKBA都能有效缓解小鼠银屑病表型，其中分子式为（II-VII）的化合物比AKBA能更加有效地治疗小鼠的“银屑病”。

Claims

1.化合物acetyl-11-keto-β-boswellic acid，具有分子式（Ⅰ）：

的衍生物：M1，3-O-乙氧乙二羰基-11-酮-β-乳香酸；

M2，3-O-丙酰基-11-酮-β-乳香酸；

M3，3-O-丁酰基-11-酮-β-乳香酸；

M4，3-O-戊酰基-11-酮-β-乳香酸；

M5，3-O-苯乙酰基-11-酮-β-乳香酸；

M6，3-O-单甲酯丙二酰基-11-酮-β-乳香酸。

。

2.权利要求1所述的化合物衍生物的制备方法，该方法由下列步骤组成：

a、以acetyl-11-keto-β-boswellic acid的含量约为60%的市售商品化乳香提取物为原料，加入浓度为100%的甲醇重结晶4-5次；

b、将重结晶产品用二氯甲烷溶解，用硅胶色谱进行吸附，用乙酸乙酯-石油醚洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，点板，合并洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得acetyl-11-keto-β-boswellic acid，以HPLC测得含量不低于98%；

c、将步骤b得到的acetyl-11-keto-β-boswellic acid置于含有KOH的异丙醇中，加热回流得到KBA；

d、将步骤c得到的KBA置于含有三乙胺的二氯甲烷中，和酰化试剂反应得到acetyl-11-keto-β-boswellic acid的6种衍生物，即M1、M2、M3、M4、M5、M6。

3.权利要求1所述化合物衍生物在制备治疗银屑病药物中的应用。

4.一种由权利要求1所述的化合物衍生物和药学上可以接受的辅料组成的药物组合物，其中所述的化合物的重量含量为0.1%-1%。

5.如根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物是外用剂型。