CN104971363A - 靶向抑制hotair的小rna在制备抗前列腺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用。编码HOTAIR基因的DNA序列位于12号染色体的HOXC11基因与HOXC12基因之间。HOTAIR是长度为2158nt、迭接的多聚核苷酸转录产物。编码HOTAIR的序列中包括5个短外显子和1个长外显子。本发明包含多种序列的siRNA，这些小RNA能通过靶向下调前列腺癌细胞中HOTAIR基因的表达，诱导细胞周期阻滞，抑制细胞侵袭迁移能力，进而可以应用于前列腺癌药物的制备。本发明siRNA制备简单，成本低，用量少，50nM的转染浓度即可达到良好的抑制效果，抑制作用确切；且siRNA抑制基因表达不会破坏基因组的完整性。

Description

靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用。

背景技术

近年来一些研究表明非编码RNA(ncRNAs)与多种细胞途径有关，尤其是与肿瘤相关的增殖、凋亡以及转移等过程。microRNA是其中一类大约22个碱基左右的目前研究最多的非编码RNA，可以在转录及转录后水平发挥调控作用。长链非编码RNA(LncRNA)则是另一类目前被研究较多的非编码RNA。LncRNA为一类长度大于200个碱基的非编码RNA，参与了几乎与mRNA相关的所有过程，从转录到mRNA拼接，RNA降解和翻译。LncRNA的调节异常与人类疾病关系密切，尤其是肿瘤，它可能通过调节染色质修饰从而影响表观遗传学信息和肿瘤进展。

Hox基因的反义基因间RNA(Hox transcript antisense intergenicRNA，HOTAIR)是目前研究较多的一种lncRNA，由Rinn研究小组首次发现并定义。HOTAIR长约2158个碱基，以反式沉默的方式发挥作用。有研究表明HOTAIR能重塑染色质并且促进肿瘤的转移，在多个肿瘤中，HOTAIR被证明高表达，包括胰腺癌、大肠癌、肝癌、胃癌等。HOTAIR的高表达与表观遗传学有关，在胃癌中，它通过招募多聚梳抑制复合体(PolycombRepressive Complex 2，PRC2)，使组蛋白H3的K9和K27位点发生甲基化，从而调控靶基因的表达。而目前对于HOTAIR在前列腺癌中的研究国内尚属空白，本研究证明了HOTAIR在前列腺癌细胞中表达上调，表明前列腺癌的发生发展可能与HOTAIR有关。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用。本发明包含多种序列的siRNA，这些小RNA能通过靶向抑制前列腺癌细胞中的HOTAIR表达，诱导肿瘤周期阻滞，抑制其侵袭迁移能力，进而可以应用于抗前列腺癌药物的制备。

所述靶向抑制HOTAIR的小RNA的核苷酸序列如下：

si-HOTAIR1:5’-UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

si-HOTAIR2:5’-AAUUCUUAAAUUGGGCUGG-3’，如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的抗前列腺癌药物还可以包括制剂允许的赋形剂。

本发明的有益效果是：

本发明采用小RNA即si-HOTAIR1或si-HOTAIR2通过靶向抑制前列腺癌细胞中的HOTAIR表达，操作简单，成本较低；用量较少，50nM的转染浓度即可达到良好的抑制效果，抑制作用确切。

附图说明

图1A是HOTAIR在正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)和前列腺癌细胞(PC3、DU145)中的相对表达量；图1B是用siRNA抑制HOTAIR表达后HOTAIR的表达水平。数据均来源于3次独立实验的平均值和标准差；

图2是siRNA抑制HOTAIR表达后前列腺癌细胞的周期改变；数据均来源于3次独立实验的平均值和标准差；

图3是siRNA抑制HOTAIR表达后前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力的改变；数据均来源于3次独立实验的平均值和标准差。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的分析。

实施例1：siRNA下调HOTAIR的表达并抑制前列腺癌细胞的生物学功能，实施方案：

1.细胞系：人正常前列腺上皮细胞RWPE-1，前列腺癌细胞系PC3，前列腺癌细胞系DU145(均来自于中科院上海细胞所)。

2.siRNA合成：siRNA均有上海吉凯生物技术有限公司化学合成。

3.实验分组：siRNA组(si-HOTAIR1、si-HOTAIR2)，对照组(si-Control)

4.细胞培养：上述三种细胞用RPMI-1640培养基，然后在RPMI-1640培养基中加入10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素，置于37℃，含5％CO₂的恒温培养箱中培养。

5.qRT-PCR检测：利用qRT-PCR技术检测3株细胞系中HOTAIR的表达水平。使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，使用PrimeScript反转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qRT-PCR分析，结果使用磷酸甘油酸脱氢酶(GAPDH)进行标准化。

所述的HOTAIR的PCR引物如下：上游引物：5'-CATGGATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3’，如SEQ ID NO.3所示,下游引物：5’-ACTCTCGAGCCACACACACACACACCTACAC-3’，如SEQ ID NO.4所示；GAPDH引物如下：上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，如SEQID NO.5所示，下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'，如SEQ ID NO.6所示。

PCR反应条件为：94℃变性4min；按下列参数循环28次：94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸10min；4℃停止反应。

使用ABI7500fast进行qRT-PCR和数据收集，采用2-ΔΔCt进行数据分析。

6.细胞转染：HOTAIR(si-HOTAIR1:5’-UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3’，如SEQ ID NO.1所示；si-HOTAIR2:5’-AAUUCUUAAAUUGGGCUGG-3’，如SEQID NO.2所示)，si-Control(5’-CUACAACAGCCACAACGUC[dT][dT]-3)。将si-HOTAIR1、si-HOTAIR2及si-Control经过脂质体Lipofectamine 2000包裹后转入细胞，以6孔板为例(其余培养器皿根据底面积之间的比例调整试剂量)，每孔取7.5ul 20nM siRNA及siControl储存液和5ul脂质体分别溶于250ul无血清培养基，5分钟后混合，室温静置20分钟后加入培养板中，补充含血清培养基使其终浓度为50nM，置于六孔板培养48小时后收集进行后续实验。

7.细胞周期检测：细胞种植在六孔板中，按上述转染后收集细胞，用PBS洗2遍，每遍800g离心5分钟。用75％乙醇在4℃固定1小时，PBS洗一遍，重悬后加入碘化丙啶(PI)试剂和RNA酶抑制剂，室温避光孵育30分钟。使用FC500流式细胞仪(BI bioscience)进行检测。实验独立重复4次。

8.细胞侵袭实验：细胞种植在六孔板中，按上述转染后收集细胞，用无血清培养基重悬后细胞计数。在Transwell小室上室加入0.2ml悬液(约40000个细胞)，置于24孔板中，并在24孔板的孔中加入0.6ml含血清培养基。孵育24小时后收集小室，甲醇固定5分钟，PBS清洗2遍，0.1％结晶紫染色5分钟后显微镜下观察。实验独立重复3次。

9.统计学分析：应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料两组之间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果如下：

1.前列腺癌细胞中HOTAIR表达上调

如图-1A所示，2株前列腺癌细胞株(PC3、DU145)与人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)相比，HOTAIR表达相对上调。PC3上调约3.2倍，DU145上调约5.4倍(*,P<0.05；**,P<0.01)。si-HOTAIR干扰后，HOTAIR表达水平下调约至40％。见图-1B。(**,P<0.01)

2.HOTAIR对前列腺癌细胞周期的影响

流式细胞术结果(图-2)显示，在si-HOTAIR下调HOTAIR的表达水平后，2株前列腺癌细胞都出现了G2期阻滞，同时伴有G1期的下调。(*,P<0.05)。

3.HOTAIR对前列腺癌细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果(图-3)表明，在si-HOTAIR下调HOTAIR的表达水平后，前列腺癌细胞株的侵袭能力受到了明显的抑制。(**,P<0.01)

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

<110>  浙江大学

 

<120>  靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用

 

<130>  1

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

uuuucuacca ggucgguac                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  RNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

aauucuuaaa uugggcugg                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

catggatcca cattctgccc tgatttccgg aacc                                 34

 

 

<210>  4

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

actctcgagc cacacacaca cacacctaca c                                    31

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

gggagccaaa agggtcat                                                   18

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

gagtccttcc acgataccaa                                                 20

 

 

Claims (2)

1.一种抑制长链非编码RNA-HOTAIR表达的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用，所述的靶向抑制HOTAIR的小RNA的核苷酸序列为如下的任意一种：

si-HOTAIR1:5’-UUUUCUACCAGGUCGGUAC-3’， 如SEQ ID NO.1所示；

si-HOTAIR2: 5’-AAUUCUUAAAUUGGGCUGG-3’， 如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种靶向抑制HOTAIR的小RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用，其特征在于所述的药物还可包括制剂允许的赋形剂。