CN104946718A

CN104946718A - 一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法

Info

Publication number: CN104946718A
Application number: CN201410117001.4A
Authority: CN
Inventors: 许赣荣; 黄艳; 毛鹏; 张薄博; 贾虎斌
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2034-03-26
Also published as: CN104946718B

Abstract

本发明公开了一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法，属于发酵工程领域。本发明方法以新颖的红曲菌液态发酵培养基为基础，由不溶于水的萃取相和基本培养基所组成发酵体系，一方面阻断橙色素向红曲红、黄色素的转化，从而提高红曲橙色素的转化率和产量；另一方面，双液相萃取发酵偶联体系有助于提高溶氧水平，保证红曲菌的正常生长和发酵，促进红曲色素分泌到细胞外，降低红曲发酵产物的负反馈抑制作用。采用本发明提供的方法，可在较短的发酵周期时间内实现红曲橙色素的高效生物合成、释放及萃取，从而能够显著提高红曲橙色素的产率及产量，并简化后续的色素提取纯化工艺，萃取剂还可重复回收使用，大大提高生产效率，降低生产成本。

Description

一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法

技术领域

本发明涉及一种天然红曲橙色素的发酵方法，尤其是一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法，属于发酵工程领域。

背景技术

食用橙色素具有广泛的用途，在面包、饼干、糕点、饮料、食用油、酱、肉、方便面等方面应用甚广。食用橙色素分为合成橙色素和天然橙色素。天然橙色素分为植物提取物和微生物发酵产物。从植物提取橙色素如胭脂树橙色素所需的生长周期长，且提取率低，工艺相对复杂。目前具有大规模生产潜力的是微生物发酵产生的天然橙色素比如红曲橙色素。红曲橙色素分为二种，一种是红曲玉红素（Monascorubrine）和红斑红曲素（Rubropunctatine）。红曲玉红素的最大吸收峰的波长为464nm。

然而红曲橙色素目前在国内外仅限于小样试制，尚未实现大规模生产，在食品及其它领域的应用目前也未得到充分的开发研究。利用红曲菌微生物发酵法生产天然红曲橙色素是当前红曲色素行业的研究开发重点。如何提高红曲橙色素生产水平上的关注点，国内外文献报道的论文或专利主要集中在高产红曲菌种的诱变筛选及改善发酵工艺条件这二个方面，但收效不大。例如徐伟等人通过诱变选育得到了红曲橙色素产生菌Monascus purpureus W5S8，液态发酵产橙色素色价仅达到16.38U/mL，许赣荣等人先前采用常规的液态发酵法，发酵液橙色素色价不到100U/mL。从已有的资料看来，液态发酵法橙色素生产水平较低，无法达到工业化生产的要求。国外仅有用红曲固态发酵生产含红曲橙色素的红曲米报道，但橙色素生产水平较低，且发酵时间长达15天。

因此，为实现微生物发酵法生产天然红曲橙色素的工业化，当前最重要的是提高天然红曲橙色素的发酵水平和效率，即提高发酵液中橙色素的色价，并缩短发酵时间；而要达到这二个目标，必须根据红曲菌所产的橙色素的合成代谢途径及橙色素的特性，采用更为新颖的发酵培养基及液态发酵方法。

发明内容

本发明针对常规液态发酵生物合成的红曲橙色素产量低问题，提供一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法，是将红曲菌种子接入发酵培养基中，发酵培养产红曲橙色素；所述发酵培养基是水相和萃取相组成的双液相萃取发酵体系，所述水相是含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基，所述萃取相含有甘油酯类物质。

所述基本培养基的成分是：木薯淀粉30-80g/L，酵母膏0.1-6g/L，玉米浆粉0.1-6g/L，硫酸铵8-12g/L，硝酸钠5-10g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L。

所述红曲菌种是能够产红曲橙色素的红曲菌。

所述萃取相中的甘油酯类物质作为萃取剂，有提高溶氧的作用，且难溶于水，可将附着在红曲菌球表面色素萃取富集到萃取剂相中或富集在油水分界层，以降低高浓度的胞外产物对产物分泌的抑制作用，大幅度提高红曲液态发酵合成橙色素产物的效率。

所述甘油酯类物质为甘油三酯类物质，体积占基本培养基体积的5-30%。

所述甘油酯类物质除甘油三酯类物质，还包括甘油二酯类物质、甘油单酯类物质或其混合物。

所述甘油二酯类物质、甘油单酯类物质的添加时间为红曲种子液接种24-72h之后。单独添加甘油二酯类物质或甘油单酯类物质时，添加的体积占基本培养基体积的0.1-5%；混合添加时，总体积占基本培养基体积的0.1-5%。

所述甘油三酯类物质为三辛酸甘油酯、三异辛酸甘油酯、植物油或其混合物。所述植物油是大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、棉籽粕油、茶籽油或其他食用油及其混合物。

所述甘油二酯类物质是1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯、二辛酸甘油酯或其混合物。

所述萃取相中的甘油单酯类物质是单辛酸甘油酯。

所述发酵培养产红曲橙色素的条件优选将处于对数生长期的红曲菌种子以体积比5-10%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为80～180r/min，温度26～32℃条件下，摇瓶发酵培养4-6d。甘油二酯和甘油单酯的添加时间为红曲种子液接种后24～72h。

采用本发明偶联原位萃取发酵技术，将红曲菌液态发酵生物合成的天然红曲橙色素萃取富集到萃取相中，红曲橙色素的色价可达250-460U/mL。

本发明在培养基氮源的组成上，主要采用复合氮源，尤其是增加无机氮源的浓度，有效降低发酵液中氨基酸的浓度，能大大减少红曲橙色素向红曲红色素的转化，从而提高红曲橙色素的产量；其次采用普通的植物油作为双液相发酵体系的萃取剂，在保证细胞正常生长高效萃取色素的同时，还具有两方面的优点：其一，采用油脂作为萃取相，因油脂有增加溶解氧的作用，这对于保证供氧、提高色素的产量有益；其二，采用植物油作为萃取剂，有利于色素作为油脂专用的着色剂。

本发明通过多管齐下，有效控制红曲菌生物合成色素的途径，使红曲菌所生成的橙色素得到积累，不再转化为红曲红、红曲黄色素，可在下述三个方面取得明显的经济效率：首先是可大幅度提高红曲橙色素的产量，红曲橙色素的纯度较高（根据吸收峰值所对应的波长而定）；缩短发酵时间，从而达到高效、高产红曲橙色素，提高经济效益的目的；其次，由于萃取相不溶于水，而红曲橙色素又溶于萃取相中，发酵结束后，可通过比现有红曲色素分离提取法更为简便的分离方法，将萃取相和水相发酵液有效分离，而富集在萃取相中的红曲橙色素可通过更为简便的方式转移到其它溶剂中得到进一步的分离纯化；不溶于水的萃取相以及水相发酵液中的红曲菌丝体都可回收重复利用，从而达到提高企业整体经济效益的综合目的，在红曲橙色素生产领域具有工业化实用价值。

附图说明

图1红曲菌红曲橙色素全波长扫描图

具体实施方式

红曲橙色素色价的测定及计算方法：

（1）发酵液的处理

发酵液重量和体积的测定及比例系数的确定：对发酵三角瓶（加塞）本身及加培养基（包括油相）后的三角瓶称重（分别记录为W₀,W₂），得出培养基重量(记录为W₁)；量取培养基体积(V₁)；计算体积与培养基重量之比例系数（mL/g）。

发酵结束后，对发酵瓶及发酵液称重，用水补足至发酵前的重量。将红曲菌发酵液（含油相）全部转移到磨浆机中，磨成匀浆。取一烧杯和一把金属勺合并称重，用金属勺取相当于10mL左右的发酵液，再将烧杯+金属勺及样品称重，得出样品的实际重量，并换算成发酵液的体积。取无水酒精约20mL，加入到烧杯中，将发酵液搅拌均匀后，转移到50mL比色管中，再分别二次各取10无水乙醇洗涤烧杯，将烧杯内的残余发酵液全部转移到比色管中，并定容到50mL，55℃水浴萃取1h，中间间歇摇2次，水浴结束后冷却至室温。根据需要取10mL上述发酵液的酒精稀释液按照上述方法再进行一次稀释。

（2）色价测定与计算

用无水乙醇对上述稀释液根据要求再稀释适当倍数（将OD值控制在0.2-0.8之间），并以无水乙醇为空白对照在200-600nm范围内进行全波长扫描，以确定是否为单一峰及其峰值所对应的波长。在465nm测定OD值。

橙色素色价=OD₄₆₅×总稀释倍数（U/mL）

种子培养条件：将红曲菌种转接到斜面培养基中培养，培养温度30℃，培养1周，得红曲菌斜面菌种。无菌操作，用一定量无菌水从斜面上洗下孢子，制备孢子悬浮液，以体积比10%的接种量接入装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于30℃恒温摇床中，转速为120r/min，培养2-3d，得到处于生长对数期的红曲种子液。

斜面培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L。

液体种子培养基：木薯淀粉20g/L，黄豆粉2.5g/L，硫酸铵3g/L，NaNO₃6g/L，酵母膏2g/L，玉米浆粉2g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾0.6g/L。

实施例1

红曲菌种是红曲菌JJLY-4A（Monascus sp.JJLY-4A），发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉30，硫酸铵10，NaNO₃6，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油5%，玉米油8%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始24h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比6%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养4d。结束后测得红曲橙色素的色价为200-210U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例2

以红曲菌JJLY-4A为摇瓶发酵菌种。与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是：发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉60，硫酸铵10，NaNO₃6，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油5%，玉米油8%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比6%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为300-310U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例3

与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是：以红曲菌9903（Monascus sp.）9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉60，硫酸铵5，NaNO₃5，酵母膏5，玉米浆粉5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油5%，玉米油8%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始24h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比8%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为330-340U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例4

与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是：以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉60，硫酸铵10，NaNO₃6，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油8%，玉米油8%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始72h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比7%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为390-400U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例5

与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是：以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉60，硫酸铵10，NaNO₃6，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油10%，玉米油10%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比8%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为400-410U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例6

与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是：以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉60，硫酸铵10，NaNO₃6，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油5%，玉米油5%、二辛酸甘油酯2%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为320-330U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例7

与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是：以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉60，硫酸铵10，NaNO₃6，酵母膏0.5，玉米浆粉0.5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油10%，玉米油10%、三辛酸甘油酯1%、二辛酸甘油酯1%、辛酸甘油酯1%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比8%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为410-420U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例8

与上述实施例1菌种培养及发酵过程步骤相同，所不同的是：以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制，基本培养基（g/L）：木薯淀粉70，硫酸铵8，NaNO₃6，酵母膏0.2，玉米浆粉0.2，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油10%、玉米油10%、三辛酸甘油酯1%、二辛酸甘油酯1%、辛酸甘油酯1%。萃取相中除大豆油和玉米油外，其余的甘油酯类物质均在发酵开始48h后加入培养基。

处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比10%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为450-460U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例9

以红曲菌9903为摇瓶发酵菌种。发酵培养基按以下配比进行配制：基本培养基（g/L）：木薯淀粉70，硫酸铵8，NaNO₃6，酵母膏0.2，玉米浆粉0.2，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（占基本培养基的体积比）：大豆油20%。处于对数生长期的红曲菌液体种子以体积比8%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为180r/min，温度30℃条件下，摇瓶发酵培养5d。结束后测得红曲橙色素的色价为390-400U/mL（折合到基本培养基体积）。

实施例10普通发酵方式产红曲橙色素

红曲橙色素液态发酵过程：PDA斜面→制成孢子悬浮液→接种至种子液→培养48h，接入发酵培养基，接种量为5%→培养5天后，发酵液预处理，测色价。

斜面培养基（PDA培养基）：马铃薯200g加水煮沸30min，葡萄糖20g，琼脂15～20g，定容1000mL，自然pH。

种子培养基（g/L）：玉米淀粉40，硫酸铵4，KH₂PO₄，2.0；K₂HPO₄，2.0；MgSO₄·7H₂O，0.5；CaCl₂，0.1；FeSO₄·7H₂O，0.01；ZnSO₄·7H₂O，0.01；MnSO₄·H₂O，0.03；NaNO₃，2.0；pH5.0。

液态摇瓶发酵培养基（g/L）：玉米淀粉，60.0；硫酸铵，4.0；KH₂PO₄，2.0；K₂HPO₄，2.0；MgSO₄·7H₂O，0.5；CaCl₂，0.1；FeSO₄·7H₂O，0.01；ZnSO₄·7H₂O，0.01；MnSO₄·H₂O，0.03；NaNO₃，2.0；起始pH值为5.0；发酵时间为4.0d。

孢子悬浮液的制备：取斜面菌种一只，加入适量无菌水和少量玻璃珠，充分振荡后用无菌滤纸过滤，再以血球计数板计数，使孢子浓度达到10⁶个/mL。

红曲菌种子培养：250mL三角瓶装液量45mL，接种量：孢子悬浮液2mL。30℃往复式摇床，行程10cm，100r/min振荡培养48h。

红曲菌摇瓶液态培养：装液量100mL（500mL三角瓶），接种量5%。30℃，往复式摇床100r/min，培养时间4天左右。摇瓶发酵液色价值：79.53U/mL。

由上述实施例可知，在偶联原位萃取发酵红曲橙色素的双液相发酵方法中，培养基各成分的比例对红曲菌发酵产橙色素有较大的影响。在培养基配比方面，较高碳源浓度、较高的无机氮源浓度可提高橙色素色价，有机氮源浓度过高则减少橙色素的产量。发酵培养基中添加较多量的萃取剂时能显著提高橙色素色价。当以木薯淀粉70，硫酸铵8，NaNO₃6，酵母膏0.2，玉米浆粉0.2，硫酸镁1，磷酸二氢钾1；萃取相（基本培养基的体积比）：大豆油10%、玉米油10%、三辛酸甘油酯1%、二辛酸甘油酯1%、辛酸甘油酯1%时，色价最高可达到450-460U/mL。这种新的发酵方法，适用于能够产红曲橙色素的各种红曲菌（紫色红曲菌Monascus purpureus CICC5022，红色红曲菌Monascus rubber CICC40711），通过在发酵产生产物的同时通过萃取剂将产物红曲橙色素及时分泌到菌丝体外，一方面减少红曲橙色素进一步向红曲黄色素或红曲红色素的转化，一方面降低红曲色素产物的负反馈抑制作用，进一步又对橙色素进行萃取富集。此外，由于萃取相（油相）的存在该双液相体系不但能大大提高培养基溶氧。而在后期色素分离过程中，可简化色素的提取纯化工艺，萃取剂可回收重复利用，从降低了生产成本。综上，本发明中的这种方法是一种高效、经济、具备创新性的发酵方法，在红曲橙色素生产领域具有工业化实用价值。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种偶联原位发酵萃取红曲橙色素的双液相发酵方法，其特征在于，是将红曲菌种子接入发酵培养基中，发酵培养产红曲橙色素；所述发酵培养基是水相和萃取相组成的双液相萃取发酵体系，所述水相是含有红曲菌生长所需营养成分的基本培养基，所述萃取相含有甘油酯类物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基本培养基含有木薯淀粉30-80g/L，酵母膏0.1-6g/L，玉米浆粉0.1-6g/L，硫酸铵8-12g/L，硝酸钠5-10g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质是甘油三酯类物质，添加的体积占基本培养基体积的5-30%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油三酯类物质为三辛酸甘油酯、三异辛酸甘油酯、植物油或其混合物。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质还包括甘油二酯类物质，是在红曲种子液接种24-72h之后添加，添加的体积占基本培养基体积的0.1-5%。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质还包括甘油单酯类物质，是在红曲种子液接种24-72h之后添加，添加的体积占基本培养基体积的0.1-5%。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘油酯类物质还包括甘油二酯类物质和甘油单酯类物质，甘油二酯和甘油单酯的总体积占基本培养基体积的0.1-5%，添加时间为红曲种子液接种24-72h之后。

8.根据权利要求5或7所述的方法，其特征在于，所述甘油二酯类物质是1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯、二辛酸甘油酯或其混合物。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述甘油单酯是单辛酸甘油酯。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物油是大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、棉籽粕油、茶籽油或其他食用油及其混合物。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养产红曲橙色素的条件是将处于对数生长期的红曲菌种子以体积比5-10%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在转速为80～180r/min，温度26～32℃条件下，摇瓶发酵培养4-6d。