CN104945511A - 一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明以血红蛋白为生物分子模板，以二价金属盐Mg(NO3)2和三价金属盐Al(NO3)3混合溶液为金属离子来源，以氢氧化钠溶液为碱源，在血红蛋白模板分子诱导下，采用T型微反应器共沉淀法制得了小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物。本发明所述纳米复合物中，血红蛋白分子均匀地吸附在类水滑石粒子表面，并保持了其蛋白质原有的二级结构；其形貌呈海绵状和不定型的小颗粒状，具有大的比表面积；平均粒径小于40nm，厚度小于5nm；Zeta电位在+16mV到+30mV之间；所述血红蛋白/类水滑石纳米复合物具有很高的热稳定性能，在90℃高温条件下催化邻苯二胺时的酶活保持率在31～63.5％之间，远高于游离的血红蛋白的7.28％和大颗粒类水滑石固定血红蛋白复合物的21.44％。
Description
技术领域：
本发明涉及一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物；本发明还涉及所述纳米复合物的制备方法及其催化邻苯二胺的应用。
背景技术：
蛋白质与无机纳米粒子的组装在生物催化、生物医学诊断和生物传感器等领域具有广泛的基础和应用研究价值。生物无机界面组装涉及到范德华力、疏水亲合作用、静电相互作用和氢键等作用。虽然无机纳米粒子固定蛋白质后会提高它们的性能，但被固定的蛋白质可能由于一些不合适的界面组装条件而变性失活。为了使固定的蛋白质保持其原有的二级结构和生物活性，寻找生物相容性好、活性位点多的无机纳米材料显得尤为重要。
类水滑石是一类二维纳米阴离子粘土，又叫层状双金属氢氧化物(Layered DoubleHydroxides,LDH)，组成通式可表示为[M1-x 2+Mx 3+(OH)2]x+(An-)x/n·mH2O，其中M(OH)6八面体共用棱而呈现开放的片层堆积结构，每个八面体单元由六配位的中心金属离子M和位于顶点的OH-形成，由于部分M2+被M3+取代会使片层带结构正电荷，层间存在可交换的阴离子使电荷达到平衡。与其他无机材料相比，类水滑石不仅容易被人工合成，原料来源非常丰富，而且具有表面积大、离子交换容量高、插层空间和电荷密度可调、生物相容性好、热稳定性和化学稳定性高等特点，是氨基酸、DNA、核苷单磷酸酯、多糖、蛋白质、多肽和酶等生物分子良好的绿色固定材料[Liu C X,Hou W G,Li L F,Li F,Liu S J.Synthesis and characterization of 5-fluorocytosineintercalated Zn–Al layered double hydroxide.J.Solid State Chem.,2008,181,1792-1797.]。但研究表明，类水滑石上述性能及应用与其粒径大小和粒径分布范围有着密切关系[Choy J-H,Kwak S-Y,Park J-S,Jeong Y-J,Portier J.Intercalative Nanohybrids of Nucleoside Monophosphates and DNA in Layered MetalHydroxide.J.Am.Chem.Soc.,1999,121,1399–1400.]，其中小粒径均一分散的类水滑石纳米粒子能更好地固定生物分子，并能保持其结构和生物活性，提高其潜在的应用价值。
传统共沉淀法合成类水滑石纳米粒子时，可通过调节金属离子浓度、过饱和度、滴料方式等方法对成核过程施加影响。由于盐和碱的混合通过搅拌方式实现，通常混合很不充分，反应界面小，存在浓度梯度，反应速度和扩散速度慢，即先期形成晶核的生长与后期晶核的形成共存，导致产物的粒径分布较大，难以控制粒径大小，且有聚集现象。目前制备单分散、尺寸可调的类水滑石纳米粒子的方法主要有：向晶化介质中加入有机溶剂，改变固-液界面张力，制备小粒径纳米粒子；采用微乳液反胶团法，通过控制微乳反应器的水核半径控制晶粒大小；采用成核和晶化过程分开法制备粒径分布范围窄的类水滑石纳米颗粒。但是这些方法要么增加了新的原料，要么步骤繁琐，操作复杂，与绿色化学的要求仍有很大距离。利用T-形微反应器限域效应和反应物间快速充分混合的特性，便可以有效克服传统方法的不足，通过简便的实验操作，得到粒径分布范围窄，颗粒较小，分散性好纳米粒子[Ying Y,Chen G W,Zhao Y C,et al.A highthroughput methodology for continuous preparation of monodispersed nanocrystals in microfludic reactors.ChemEng J,2008,135:209-215.]。
生物分子模板诱导法是制备生物无机杂化物的常用方法之一。一般情况下，生物分子首先与金属阳离子结合，形成蛋白质-金属离子配合物的形式，金属离子在生物分子上作为成核位点，在生物分子诱导和模板作用下与阴离子反应生成生物分子-无机纳米杂化物。如Ge Jun等以牛血清蛋白为诱导分子，先通过蛋白分子中的氨基与Cu2+形成配位键，所得配合物作为无机纳米初晶成核的位点，在生物分子诱导下，磷酸根慢慢与Cu2+结合生长成了生物分子纳米初晶的聚集体，聚集体表面的磷酸铜初晶在生物分子的诱导下可控生长，形成了单独的花瓣，最后生物分子诱导小花瓣形成了花瓣分支，同时它作为分子胶将这些花瓣连接起来[Ge J,Lei J,Zare R N.Protein–inorganic hybrid nanoflowers.Nature Nanotechnology.2012,7(7):428-432.]。所得生物酶-无机纳米复合粒子的生物催化活性得到了明显提高。因此，生物分子模板诱导法制备有机无机纳米粒子具有粒径和形貌可控、比表面积大、生物相容性好等优点。但目前还未见以氧化还原蛋白质为生物分子模板，采用T型微反应器共沉淀法制备小粒径蛋白质/类水滑石纳米复合物及其生物催化方面的报道。
发明内容：
针对现有技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本发明的目的是提供一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物及其制备方法和催化邻苯二胺的应用。
本发明所提供的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，是以血红蛋白为生物分子模板，以二价金属盐Mg(NO3)2和三价金属盐Al(NO3)3混合溶液为金属离子来源，以氢氧化钠溶液为碱源，在血红蛋白模板分子诱导下，采用T型微反应器共沉淀法制得的，其制备方法如下：
分别称取MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，加入去离子水，配制总金属离子浓度为5～50mmol/L的MgCl2和AlCl3混合盐溶液，向其中加入一定量的血红蛋白，混合均匀后记为溶液A；配制一定浓度的氢氧化钠溶液，记为溶液B；打开T型微反应器，将溶液A、溶液B分别加入T型微反应器的盐液管和碱液管中，控制流速，保持反应混合液的pH在9.0左右，在混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状物。
其制备方法中所述的MgCl2和AlCl3混合盐溶液中MgCl2和AlCl3的摩尔比为3：1；血红蛋白加入量控制在使其浓度为0.2g/L；配制的氢氧化钠溶液浓度为0.02mol/L；所述T形微反应器的微通道尺寸分别为宽0.3mm，高0.2mm，长20mm，流速为10mL/min；低温是指0～10℃的冰盐浴条件。
所述的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，其形貌呈海绵状和不定型的小颗粒状，具有大的比表面积；平均粒径小于40nm，厚度小于5nm；Zeta电位在+16mV到+30mV之间。
所述的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，血红蛋白分子均匀地吸附在类水滑石粒子表面，并保持了蛋白质原有的二级结构。
所述的小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物催化邻苯二胺的应用，特别是高温条件下催化邻苯二胺的应用。
本发明以血红蛋白为生物分子模板，以二价金属盐Mg(NO3)2和三价金属盐Al(NO3)3混合溶液为金属离子来源，以氢氧化钠溶液为碱源，在血红蛋白模板分子诱导下，采用T型微反应器共沉淀法制备了一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，本发明与现有技术相比，主要的有益效果和优点在于：
1)本发明所述的血红蛋白模板分子诱导下，T型微反应器共沉淀制备小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物的方法，具有粒径小、粒径分布范围窄、比表面积大等特点，解决了传统共沉淀法制备生物酶-类水滑石纳米复合物时存在的聚集、粒径大、粒径分布范围宽、比表面积小等缺陷，所得血红蛋白/类水滑石纳米粒子呈海绵状和不定型的小颗粒，其粒径小于40nm。
2)本发明所述的小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物制备方法，不引入新的介质，仅利用T-形微反应器限域效应和反应物间快速充分混合的特性，就得到了粒径分布范围窄，颗粒较小，分散性好的血红蛋白/类水滑石纳米粒子，具有操作简单、条件温和、制备成本低等优点，符合绿色化学的要求。
3)本发明所述的小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物中，血红蛋白分子均匀地吸附在类水滑石粒子表面，并保持了血红蛋白质原有的二级结构。
4)本发明所述的小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，在高温时具有比游离血红蛋白、血红蛋白-大颗粒类水滑石复合物更高的生物催化活性。
附图说明：
图1为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)和对比例1所得血红蛋白/类水滑石纳米复合物(e)的XRD衍射图。
图2为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)和游离血红蛋白(Hb)分别在25℃(图2A)和90℃(图2B)时的紫外吸收光谱图。
图3为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)、游离血红蛋白(Hb)和血红素(hemin)分别在25℃(图3A)和90℃(图3B)时的荧光发射光谱图。
图4为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)和对比例1所得血红蛋白/类水滑石纳米复合物(e)的SEM图片，实施例4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物透射电镜图片(f)。
具体实施方式：
为进一步理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不以任何方式限制本发明。
实施例1：
分别称取MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，加入去离子水，配制总金属离子浓度为6mmol/L的MgCl2和AlCl3混合盐溶液，向其中加入血红蛋白使其浓度为0.2g/L，混合均匀后记为溶液A；配制浓度为0.02mol/L的氢氧化钠溶液，记为溶液B；打开T型微反应器，将溶液A、溶液B分别加入T型微反应器的盐液管和碱液管中，控制流速，保持反应混合液的pH在9.0左右，在混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状物，记为Hb-LDHC6。
实施例2：
分别称取MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，加入去离子水，配制总金属离子浓度为12mmol/L的MgCl2和AlCl3混合盐溶液，向其中加入血红蛋白使其浓度为0.2g/L，混合均匀后记为溶液A；配制浓度为0.02mol/L的氢氧化钠溶液，记为溶液B；打开T型微反应器，将溶液A、溶液B分别加入T型微反应器的盐液管和碱液管中，控制流速，保持反应混合液的pH在9.0左右，在混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状物，记为Hb-LDHC12。
实施例3：
分别称取MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，加入去离子水，配制总金属离子浓度为24mmol/L的MgCl2和AlCl3混合盐溶液，向其中加入血红蛋白使其浓度为0.2g/L，混合均匀后记为溶液A；配制浓度为0.02mol/L的氢氧化钠溶液，记为溶液B；打开T型微反应器，将溶液A、溶液B分别加入T型微反应器的盐液管和碱液管中，控制流速，保持反应混合液的pH在9.0左右，在混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状物，记为Hb-LDHC24。
实施例4：
分别称取MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，加入去离子水，配制总金属离子浓度为48mmol/L的MgCl2和AlCl3混合盐溶液，向其中加入血红蛋白使其浓度为0.2g/L，混合均匀后记为溶液A；配制浓度为0.02mol/L的氢氧化钠溶液，记为溶液B；打开T型微反应器，将溶液A、溶液B分别加入T型微反应器的盐液管和碱液管中，控制流速，保持反应混合液的pH在9.0左右，在混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状物，记为Hb-LDHT48。
对比例1：
分别称取MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，加入去离子水，配制总金属离子浓度为48mmol/L的MgCl2和AlCl3混合盐溶液，向其中加入血红蛋白使其浓度为0.2g/L，混合均匀后记为溶液A；配制浓度为0.02mol/L的氢氧化钠溶液，记为溶液B；将溶液A、溶液B分别滴加到反应瓶中，保持反应混合液的pH在9.0左右，在混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状物，记为Hb-LDHC48。
图1为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)和对比例1所得血红蛋白/类水滑石纳米复合物(e)的XRD衍射图。采用T型微反应器制备的Hb-LDH杂化物中，Hb-LDHT12、Hb-LDHT24和Hb-LDHT48与传统共沉淀法得到的Hb-LDHC48样品都出现了类水滑石所有的特征衍射峰(JCPDS card No.51-1528)，表明杂化物具有类水滑石的晶形结构。上述四个样品在低2θ处出现的三个峰型尖锐的衍射峰，分别对应于003、006和009晶面的衍射峰，在高2θ处存在强度较弱的衍射峰，对应110晶面衍射峰，为类水滑石的特征衍射峰。从图中可以看出，随着金属盐浓度的逐渐增大，所得杂化物的峰强度变大，结晶度增高，晶面生长的有序度较高，结晶性较好。然而Hb-LDHT6样品只在低衍射角处出现了一个来自于玻璃样品台的很宽的衍射峰，表明了片层结构堆积较少，只是由几层类水滑石片堆积而成。所得四种Hb-LDHT的d003在0.938～0.784nm之间，而NO3 -插层的类水滑石的层间距通常为0.79nm，血红蛋白的三维尺寸为6.5nm×5.4nm×5.3nm，所以可判断血红蛋白只是吸附在杂化物的表面。
图2为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)和游离血红蛋白(Hb)分别在25℃(图2A)和90℃(图2B)时的紫外吸收光谱图。图2A显示，当采用T型微反应器共沉淀法将血红蛋白固定在类水滑石上，血红蛋白与类水滑石之间存在较强的相互作用，在25℃相较于游离血红蛋白在404nm处较强的吸附峰，这种作用力使固定后血红蛋白的Soret峰非常弱，但是仍然出现在400nm左右。图2B显示，当将游离血红蛋白和Hb-LDHT杂化物经90℃高温处理后，游离血红蛋白的Soret峰完全消失，证明高温使血红蛋白发生了变性，然而Hb-LDHT杂化物仍在395nm处存在微弱的Soret峰，证明血红蛋白得到了类水滑石无机层状纳米片的保护，其二级结构并没有改变。
图3为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)、游离血红蛋白(Hb)和血红素(hemin)分别在25℃(图3A)和90℃(图3B)时的荧光发射光谱图。图3A显示，T型微反应共沉淀法将血红蛋白固定在类水滑石上，杂化物中血红蛋白在25℃时荧光发射光谱最大波长(λmax)基本稳定，与游离血红蛋白的λmax同处在330nm左右，但是其荧光强度都比游离血红蛋白的大，且随着金属离子的增加而减弱，表明血红蛋白固定后其折叠的肽链有一定展开，当金属离子浓度增大时，类水滑石晶形和有序度升高，血红蛋白与类水滑石作用力减小，肽链展开程度变小，所以其荧光强度变弱。然而图3B显示，90℃处理后，Hb-LDH杂化物上的荧光强度随金属离子的增加而增强，荧光λmax也随着金属盐浓度的增大从330nm红移到了337nm，这表明经高温处理后肽链展开程度变大，更大程度显露在亲水环境中，致使其荧光λmax发生了红移，但是金属离子浓度较低时由于血红蛋白与类水滑石作用力较强，加热处理过程中血红蛋白受到了较好的保护，肽链变化反而较小，表现出了较弱的荧光强度；相反金属离子浓度较高时由于血红蛋白与类水滑石作用力较弱，加热处理过程中类水滑石对血红蛋白的保护较弱，肽链变化反而较大，表现出了较强的荧光强度。
图4为实施例1～4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物(a～d)、对比例1所得血红蛋白/类水滑石纳米复合物(e)的SEM图片和实施例4所得小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物透射电镜图片(f)。可以看出，当金属离子浓度较低时，得到的血红蛋白/类水滑石纳米粒子通过生物分子胶连接在一起呈海绵状，当金属离子浓度大于24mmol/L时，复合纳米粒呈颗粒状，但它们的粒径都小于40nm。Hb-LDHT48的TEM显示，复合物中类水滑石纳米片呈随机排列，与血红蛋白分子互相嵌插，类水滑石纳米片均匀地分散在复合物中，其平均厚度小于5nm。
实施例5应用效果试验例
试验对象：实施例1-4和对比例1制得的产品，游离血红蛋白；
试验目的：考察本发明实施例1-4制得的产品和游离血红蛋白催化邻苯二胺的效果。
试验分组：
试验1组：实施例1制得的产品Hb-LDHT6；
试验2组：实施例2制得的产品Hb-LDHT12；
试验3组：实施例3制得的产品Hb-LDHT24；
试验4组：实施例4制得的产品Hb-LDHT48；
对比试验组1：对比例1制得的产品Hb-LDHC48；
对比试验组2：游离Hb。
试验方法：
25mL pH＝7的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，在一定温度下搅拌20min，加入本发明试验对象，使其中所含血红蛋白为1.0mg，在90℃温度条件下进行搅拌10min，加入77μL浓度为30％的过氧化氢溶液，测定不同反应时间溶液在426nm(生成物2,3-二氨基吩嗪)处的紫外吸光度。
血红蛋白的转化常数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或每分子血红蛋白所能转换的底物分子数。本实验中采用10分钟内的血红蛋白的转化数来衡量血红蛋白的活性。
酶活保持率(％)：样品在某个条件下的活性与Hb在25℃下pH＝7缓冲溶液中的活性比值。
试验结果：
表1：Hb与Hb-LDH杂化物在90℃水相中对邻苯二胺的催化活性
小结：通过表2的试验结果可以看出：
Hb-LDHT纳米杂化物在90℃反应10分钟后，酶活保持率逐渐降低，但均远远优于游离酶(7.28％)；同样它们的酶活保持率也均优于传统共沉淀法制得的Hb-LDHC48(21.44％)。这些结果表明：血红蛋白通过T型微反应器共沉淀法组装到类水滑石无机纳米片上，高温处理时类水滑石纳米片对血红蛋白起到很好的保护作用。我们认为：采用T型微反应器制备的Hb-LDH杂化物具有粒径分布范围窄、分散性高、类水滑石纳米片薄等特点是根本原因。而随着金属盐浓度的逐渐增大，Hb-LDHT纳米杂化物高温时的酶活和转化常数Kcat都呈下降趋势，这主要因为金属盐浓度较低时得到的Hb-LDHT纳米杂化物呈无定型或海绵状，类水滑石基本处于初晶状态，与血红蛋白相互作用力强，保护作用明显，加热时不容易破坏。而随着金属盐浓度的增加，类水滑石晶粒逐渐变大，与血红蛋白相互作用力变弱，保护作用削弱，加热时容易破坏。这一现象同样从与传统共沉淀法制得的Hb-LDHC48样品的活性数据也能得到验证。因此，将生物酶固定在均匀分散的小粒径层状纳米材料上，可提高酶的热稳定性。
Claims (5)
1.一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，其特征在于所述的血红蛋白/类水滑石纳米复合物是以血红蛋白为生物分子模板，以二价金属盐Mg(NO3)2和三价金属盐Al(NO3)3混合溶液为金属离子来源，以氢氧化钠溶液为碱源，在血红蛋白模板分子诱导下，采用T型微反应器共沉淀法制得的，其制备方法如下：
分别称取MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，加入去离子水，配制总金属离子浓度为5～50mmol/L的MgCl2和AlCl3混合盐溶液，向其中加入一定量的血红蛋白，混合均匀后记为溶液A；配制一定浓度的氢氧化钠溶液，记为溶液B；打开T型微反应器，将溶液A、溶液B分别加入T型微反应器的盐液管和碱液管中，控制流速，保持反应混合液的pH在9.0左右，在混合液出口处接收反应产物；反应混合液在N2保护条件下，低温搅拌24h，结束后将混合液12000rpm下离心10min，超纯水将沉淀洗涤3次，得血红蛋白/类水滑石纳米复合物胶状物。
2.根据权利要求1所述的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，其特征在于制备方法中所述的MgCl2和AlCl3混合盐溶液中MgCl2和AlCl3的摩尔比为3：1；加入一定量的血红蛋白后，使其浓度为0.2g/L；配制的氢氧化钠溶液浓度为0.02mol/L；所述T形微反应器的微通道尺寸分别为宽0.3mm，高0.2mm，长20mm，流速为10mL/min；低温是指0～10℃的冰盐浴条件。
3.根据权利要求1所述的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，其特征在于其形貌呈海绵状和不定型的小颗粒状，具有大的比表面积；平均粒径小于40nm，厚度小于5nm；Zeta电位在+16mV到+30mV之间。
4.根据权利要求1所述的一种小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物，其特征在于血红蛋白分子吸附在类水滑石粒子表面，保持了蛋白质原有的二级结构。
5.一种权利要求1所述的小粒径血红蛋白/类水滑石纳米复合物催化邻苯二胺的应用，特别是高温条件下催化邻苯二胺的应用。
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JUN GE等: "Protein-inorganic hybrid nanoflowers", 《NATURE NANOTECHNOLOGY》 * |
| XIUJIANG PANG等: "Synthesis of layered double hydroxide nanosheets by coprecipitation using a T-type microchannel reactor", 《JOURNAL OF SOLID STATE CHEMISTRY》 * |
| 郭鑫: "高分散型血红蛋白/水滑石杂化材料", 《中国优秀硕士学问论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108760844A (zh) * | 2018-08-30 | 2018-11-06 | 混隽雅 | 一种检测谷胱甘肽的光致电化学传感器制备方法及应用 |
| CN111115667A (zh) * | 2020-01-02 | 2020-05-08 | 陕西科技大学 | 一种以生物大分子为模板生长水滑石的方法 |
| CN115466519A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-12-13 | 浙江理工大学 | 角蛋白协同层状双金属氢氧化物纳米阻燃剂及其制备方法 |
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