CN104931697A - Cd248+cd8+t细胞亚群在人升主动脉瘤病变过程中的作用 - Google Patents

Cd248+cd8+t细胞亚群在人升主动脉瘤病变过程中的作用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CD248+CD8+T细胞亚群在人升主动脉瘤病变过程中的作用。本发明提供了CD248在制备用于诊断主动脉瘤的制剂或试剂盒中的应用，分离出了CD248+CD8+T细胞亚群，与对照组相比，该亚群在主动脉瘤患者外周血中比例降低，在主动脉瘤组织局部升高。该亚群细胞的促炎因子IF-1β，IFN-γ等表达降低，而抑炎因子IL-10表达增高。本发明首次发现了CD248+CD8+细胞在对照组和主动脉瘤组中表达的差异，并从新的角度揭示了该亚群细胞对主动脉瘤患者的潜在保护作用，即升主动脉瘤病变发生时，CD248+CD8+细胞亚群可能从外周血募集到瘤体局部，通过降低炎性反应，抑制内皮细胞迁移减轻升主动脉瘤的病变进程。这一发明对临床诊治主动脉瘤患者有重要的意义。

Description

CD248+CD8+T细胞亚群在人升主动脉瘤病变过程中的作用
技术领域
本发明涉及一种新的细胞亚群在人升主动脉瘤病变过程中的作用。属于生物医药，细胞生物学，心脏大血管外科领域。
背景技术
胸主动脉瘤是指胸部主动脉部分异常扩张，变形，呈瘤样突出，可发生在主动脉根部、升主动脉、主动脉弓或降主动脉等部位。本病早期多无症状和体征，后期瘤体增大后压迫周围组织出现症状，瘤体一旦破裂，十分危重，死亡率高。胸主动脉瘤的发病机制非常复杂，除染色体缺陷所致的马凡氏综合征之外，可能涉及血流动力学变化、透壁炎症反应等，但具体发病机制尚无定论。目前研究表明，升主动脉瘤(ATAA)的病理学特征主要有血管增生、慢性炎症以及细胞外基质的退化几方面。
CD248又名内皮唾液酸蛋白，也被称为肿瘤内皮标志物-1(tumorendothelial marker-1)，是一种跨膜糖蛋白，在周细胞、成纤维细胞表面广泛表达，在炎性区域以及肿瘤新生血管中表达水平较高。已有文献指出，CD248在人类大部分肿瘤血管内皮表面都有所表达，但在正常组织血管内皮不表达。升主动脉瘤的病理过程涉及血管的增生，但目前尚无关于CD248在升主动脉瘤中作用的研究。
本发明首先阐明了CD248在对照组和主动脉瘤组中外周血和组织局部的表达差异，并将CD248定位于CD8+T细胞上，即发挥作用的主要是CD248+CD8+T细胞亚群。通过体外实验证明，该亚群细胞可以通过降低炎性反应，抑制内皮细胞迁移减轻升主动脉瘤的病变进程。
发明内容
本发明的目的在于提供CD248作为主动脉瘤诊断标志物的作用。
本发明的另一个目的在于提供一种新的细胞亚群即CD248+CD8+T细胞亚群在人主动脉瘤病变中的潜在保护作用。
为了达到上述目的，本发明提供了CD248在制备用于诊断主动脉瘤的制剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于诊断主动脉瘤的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CD248含量的试剂。所述的用于检测CD248含量的试剂为抗人CD248抗体以及抗人CD248 ELISA试剂盒中的至少一种。
优选地，所述的用于检测CD248含量为检测外周血或主动脉血管壁中CD248含量。
本发明还提供了一种CD248+CD8+T细胞亚群，其特征在于，其制备方法包括：收集健康人的外周血，用ficoll分离液，采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，用PBS缓冲液以及staining buffer洗涤，再用1％BSA溶液封闭，加入兔抗人CD248抗体，4℃孵育30mins，洗涤后，加入抗兔647荧光二抗以及抗人CD8-FITC流式抗体和抗人CD3-PE流式抗体，4℃避光孵育30mins后洗涤、重悬后上机，用流式分选仪分别收集CD248+CD8+T细胞亚群以及CD248-CD8+T细胞亚群。
本发明还提供了CD248+CD8+T细胞亚群在制备用于治疗主动脉瘤的制剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于治疗主动脉瘤的制剂或试剂盒，其特征在于，包含CD248+CD8+T细胞亚群。
本发明中所述的与对照组相比，CD248在主动脉瘤患者外周血中表达降低，组织局部表达升高，通过以下方法检测：(1)取对照组和主动脉瘤组患者外周血，分离出外周血单个核细胞，用流式细胞仪检测CD248表达量差异。(2)取对照组主动脉壁和主动脉瘤病灶区血管壁，提取RNA后PCR测定CD248表达量差异。
本发明所述的CD248+CD8+T细胞在人主动脉瘤病变中的潜在保护作用，通过下述步骤证明：(1)用流式细胞分选法，从对照组外周血单个核细胞中分选出CD248+CD8+T细胞与CD248-CD8+T细胞，将这两群细胞提取RNA，PCR分别检测促炎因子IF-1β，IFN-γ的表达，抑炎因子IL-10的表达。(2)将(1)中分选出的两群细胞分别与人主动脉内皮细胞共培养。将共培养后的内皮细胞提取RNA，用PCR测定内皮标志物CD31以及炎性因子ICAM1、VCAM1的表达。(3)按照(2)中方案共培养，共培养的内皮细胞进行划痕实验，测定共培养前、后内皮细胞迁移的距离。
本发明所述的健康人指的是非主动脉瘤患者。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次阐明了CD248在主动脉瘤患者和对照组中的表达差异。CD248作为一个肿瘤相关标志物，在炎性区域以及肿瘤新生血管中表达水平较高。人主动脉瘤虽涉及血管的增生，但有关CD248在人主动脉瘤中的表达情况以及所发挥的作用尚未见报道。
人主动脉瘤的发病机制非常复杂，除染色体缺陷所致的马凡氏综合征之外，可能涉及血流动力学变化、透壁炎症反应等，但具体发病机制尚无定论。本发明通过将CD248+/-CD8+T细胞与人主动脉内皮细胞共培养，并检测炎性的表达情况，从血管增生、炎症浸润以等方面，首次系统阐述了C248在该疾病病变过程中的作用。
附图说明
图1：A.流式细胞分析显示升主动脉瘤患者外周血中CD248+细胞数目明显降低。B.流式细胞分析显示部分CD248+细胞定位于CD3+CD8+T细胞上。C.PCR结果显示主动脉瘤病人外周血中CD248表达降低。
图2：PCR结果显示主动脉瘤病人组织局部的CD248表达明显升高。
图3：与CD248-CD8+T细胞相比，CD248+CD8+T细胞的促炎因子IF-1β，IFN-γ等表达降低，抑炎因子IL-10表达升高。
图4：与对照组相比，CD248-CD8+T细胞可使人主动脉内皮细胞的ICAM1、VCAM1表达升高，而CD248+CD8+T细胞可使其表达降低。
图5：人主动脉内皮细胞划痕实验显示，CD248+CD8+T细胞可显著抑制内皮细胞的迁移
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.检测主动脉瘤患者外周血中CD248的表达变化及细胞定位：
流式细胞术检测：分别收集对照组(健康人，来源为门诊体检病人，皆为非主动脉瘤患者)和主动脉瘤组患者的外周血(对照组10例，主动脉瘤组12例，每例抽2ml外周血)，用ficoll(Biosera，LM-T1702/500，法国)分离液，按照说明书步骤采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，用PBS缓冲液(pH＝7.2)以及staining buffer(用等体积的1％BSA和0.02％EDTA(Sigama，60004，美国)配制)洗涤，再用1％BSA(Sigma，A1933，美国)封闭，加入0.5μl兔抗人CD248抗体(abcam，ab67273，英国)，4℃孵育30mins，用PBS缓冲液洗涤后，加入0.5μl抗兔647荧光二抗(life technology，A-31573，美国)以及1μl抗人CD8-FITC流式抗体(BD，555634，美国)和1μl抗人CD3-PE流式抗体(BD，555333，美国)，4℃避光孵育30mins后用PBS缓冲液洗涤、用PBS缓冲液重悬后上机，用流式分选仪(BD FACSArial，美国)分别收集CD248+CD8+T细胞亚群以及CD248-CD8+T细胞亚群。
PCR方法检测：分别收集对照组(健康人，来源为门诊体检病人，皆为非主动脉瘤患者)和主动脉瘤组患者的外周血各2ml，用ficoll(Biosera，LM-T1702/500，法国)分离液，按照说明书步骤采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，用trizol(Takara，A9006-1，日本)提取RNA，反转录(Promega，017317，美国)为cDNA后PCR(Applied Biosystems，veriti 96well，美国)检测CD248的表达。PCR的具体步骤为：以β-actin为内参，每个检测孔中的体系：12.5μl Taq酶(Promega，T8410，美国)，前后引物各0.5μl，cDNA 0.5μl，水11.1μl，将体系混匀后放入PCR仪，35个循环，退火温度为60℃，β-actin的前后引物β-actin-F和β-actin-R以及CD248的前后引物CD248-F、CD248-R的序列见表1。
流式细胞术检测得，与对照组相比(图1A)，主动脉瘤病人外周血中CD248表达明显降低，并部分定位于CD3+CD8+T上(图1B)。PCR方法同样测得主动脉瘤病人外周血中CD248表达明显降低(图1C)。
2.检测主动脉瘤患者组织局部CD248的表达变化
取对照组(行冠脉搭桥术的患者主动脉打孔所得)和主动脉瘤组(行主动脉瘤切除手术所得)的血管壁，对照组10例，主动脉瘤组12例，用trizol(Takara，A9006-1，日本)提取RNA后，反转录为cDNA，用PCR检测组织局部CD248的表达差异。PCR的具体步骤为：以β-actin为内参，每个检测孔中的体系：12.5μl Taq酶(Promega，T8410，美国)，前后引物各0.5μl，cDNA 0.5μl，水11.1μl，将体系混匀后放入PCR仪，35个循环，退火温度为60℃，β-actin的前后引物β-actin-F和β-actin-R以及CD248的前后引物CD248-F、CD248-R的序列见表1。
与对照组相比，主动脉瘤病人组织局部的CD248表达明显升高(图2)。
3.CD248+CD8+T细胞的功能检测
将步骤1中分选得到的对照组的两群细胞(CD248+CD8+T细胞以及CD248-CD8+T细胞)用trizol提取RNA，反转录为cDNA后PCR检测炎性因子IL-1β，IFN-γ以及抑炎因子IL-10的表达。PCR的具体步骤为：以β-actin为内参，每个检测孔中的体系：12.5μl Taq酶(Promega，T8410，美国)，前后引物各0.5μl，cDNA 0.5μl，水11.1μl，将体系混匀后放入PCR仪，35个循环，退火温度为60℃，β-actin的前后引物β-actin-F和β-actin-R，IL-1β的前后引物IL-1β-F、IL-1β-R，IFN-γ的前后引物IFN-γ-F、INF-γ-R，IL-10的前后引物IL-10-F、IL-10-R的序列见表1。
与CD248-CD8+T细胞相比，CD248+CD8+T细胞的促炎因子IL-1β，IFN-γ等表达降低，抑炎因子IL-10表达升高(图3)。
4.24孔板培养原代人主动脉瘤内皮细胞(Promocell，C-1227，德国)移入24孔培养板，贴壁培养，37℃，CO25％，培养液为内皮细胞培养液(Promocell，C-22020，德国)，培养2天后，分为3组，一组与CD248+CD8+T细胞共培养，一组与CD248-CD8+T细胞共培养，培养方法为：用transwell小室放入24孔板的孔中，小室上面分别加入步骤1中分选得到的对照组的两群细胞CD248+/-CD8+T细胞，小室下面即为贴壁的内皮细胞，培养液为等体积的内皮细胞培养液(品牌货号同上)与RPMI 1640培养液(Gibco，12633012，美国)的混合，培养条件为37℃，CO25％，共培养16小时，每个小室内大约加入30000个CD248+/-CD8+T细胞)另外一组不做任何处理(对照组)，共培养16h后收集人主动脉内皮细胞，trizol(Takara，A9006-1，日本)提取RNA，反转录为cDNA后PCR检测CD31、ICAM1、VCAM1的表达。PCR的具体步骤为：以β-actin为内参，每个检测孔中的体系：12.5μl Taq酶(Promega，T8410，美国)，前后引物各0.5μl，cDNA 0.5μl，水11.1μl，将体系混匀后放入PCR仪，35个循环，退火温度为60℃，β-actin的前后引物β-actin-F和β-actin-R，ICAM1的前后引物ICAM1-F、ICAM1-R，VCAM1的前后引物VCAM1-F、VCAM1-R的序列见表1。
在体外与人主动脉内皮细胞共培养后，与对照组相比，CD248-CD8+T细胞可使人主动脉内皮细胞的ICAM1、VCAM1表达升高，而CD248+CD8+T细胞可使其表达降低(图4)，起到抑炎作用。故CD248+CD8+T细胞可能在主动脉瘤的病变中发挥潜在的保护作用。
5.将人主动脉内皮细胞(Promocell，C-1227，德国)移入24孔培养板，贴壁培养，37℃，CO25％，培养液为内皮细胞培养液(Promocell，C-22020，德国)，培养至至90％后，按照上述方法分为3组，用灭菌后的100微升tip头在每个孔垂直做出划痕，并在培养板孔底部画水平画线，与划痕十字交叉的地方即为以后要观察的部位。共培养前，测量出每孔划痕的宽度。按步骤4中的分组及培养方法共培养16h后，再次测量每个孔划痕的宽度。最后将共培养前后的划痕宽度相减，得出内皮细胞迁移的距离。
与不加处理的人主动脉内皮细胞相比，CD248+CD8+T细胞可显著抑制内皮细胞的迁移(图5)，故在人主动脉瘤的病变过程中，该细胞亚群可能抑制病理性的内皮细胞增生，从而对疾病起到保护作用。
表1：

Claims (7)

1.CD248在制备用于诊断主动脉瘤的制剂或试剂盒中的应用。
2.一种用于诊断主动脉瘤的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CD248含量的试剂。
3.如权利要求2所述的用于诊断主动脉瘤的试剂盒，其特征在于，所述的用于检测CD248含量为检测外周血或主动脉血管壁中CD248含量。
4.如权利要求2所述的用于诊断主动脉瘤的试剂盒，其特征在于，所述的用于检测CD248含量的试剂为抗人CD248抗体以及抗人CD248 ELISA试剂盒中的至少一种。
5.一种CD248+CD8+T细胞亚群，其特征在于，其制备方法包括：收集健康人的外周血，用ficoll分离液，采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，用PBS缓冲液以及staining buffer洗涤，再用1％BSA溶液封闭，加入兔抗人CD248抗体，4℃孵育30mins，洗涤后，加入抗兔647荧光二抗以及抗人CD8-FITC流式抗体和抗人CD3-PE流式抗体，4℃避光孵育30mins后洗涤、重悬后上机，用流式分选仪分别收集CD248+CD8+T细胞亚群以及CD248-CD8+T细胞亚群。
6.CD248+CD8+T细胞亚群在制备用于治疗主动脉瘤的制剂或试剂盒中的应用。
7.一种用于用于治疗主动脉瘤的制剂或试剂盒，其特征在于，包含CD248+CD8+T细胞亚群。
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