CN104922513A - 一种感冒清热颗粒的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种感冒清热颗粒的制备方法，由荆芥穗200g，薄荷60g，防风100g，柴胡100g，紫苏叶60g，葛根100g，桔梗60g，苦杏仁80g，白芷60g，苦地丁200g，芦根160g作为原料药制成，采用超临界萃取、微波萃取和微孔滤膜过滤制备而成，使得有效成分含量有很大提高，本发明还提供了感冒清热颗粒在制备抑制人淋巴瘤细胞U-937细胞增殖药物中的应用。

Description

一种感冒清热颗粒的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种感冒清热颗粒的制备方法及应用。

背景技术

感冒清热颗粒记载于《中华人民共和国药典》一部2010版第三增补本第90页，由荆芥穗200g，薄荷60g，防风100g，柴胡100g，紫苏叶60g，葛根100g，桔梗60g，苦杏仁80g，白芷60g，苦地丁200g，芦根160g作为原料药制成。以上十一味，取荆芥穗、薄荷、紫苏叶提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集;药渣与其余防风等八味加水煎煮二次，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并。合并液浓缩成相对密度为1.32〜1.35(50°C)的清膏，取清膏，加蔗糖、糊精及乙醇适量，制成颗粒，干燥，加入上述挥发油，混匀，制成1600g;或加人辅料适量，混匀，干燥，加入上述挥发油，混匀，制成800g(无蔗糖）；或将合并液减压浓缩至相对密度为1.08〜1.10(55°C)的药液，喷雾干燥，制成干膏粉，取干膏粉，加乳糖适量，混合，加入上述挥发油，混匀，制成颗粒400g，即得（含乳糖）。能疏风散寒，解表清热。用于风寒感冒，头痛发热，恶寒身痛，鼻流清涕，咳嗽咽干。

现有技术中，尚未有感冒清热颗粒在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而采用蒸馏、水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，提取率低，不能将某些高沸点，低挥发度的成分全部提取出来，而且长时间处于高温状态下，药物的挥发性成分容易逸散，某些易热解的物质或化学不稳定性成分也易被破坏，药材的有效成分损失巨大，严重影响了药物的疗效，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。因此，需要开发一种有效成分高、质量稳定可靠，适用于现代化生产感冒清热颗粒。

发明内容

发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种有效成分高、质量稳定可靠，适用于现代化生产感冒清热颗粒的制备方法。本发明的另一个目的在于提供一种感冒清热颗粒在制备抑制人淋巴瘤细胞U-937细胞增殖药物中的应用。

技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：

一种感冒清热颗粒的制备方法，由其特征在于，由以下重量百分比的原料组成荆芥穗200g，薄荷60g，防风100g，柴胡100g，紫苏叶60g，葛根100g，桔梗60g，苦杏仁80g，白芷60g，苦地丁200g，芦根160g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取荆芥穗、薄荷、紫苏叶、葛根加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3－5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10－20MPa，萃取时间45-75min，第二次萃取压力20－30Mpa，萃取时间45-75min，第三次萃取压力40－50Mpa，萃取时间30-60min，温度40－50℃，CO₂流量1－3m1/g生药·min，得超临界萃取物，备用；取防风、柴胡，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次10-15分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；取其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h,合并煎液，真空减压浓缩至相对密度1.05-1.10（50℃），0.22-1μm微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入乳糖和硬脂酸镁适量，混和，70%乙醇制颗粒，制成颗粒400g,即得。

上述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%。

上述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取10分钟。

上述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取采用等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间60min，第二次萃取压力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间45min，萃取温度45℃，CO₂流量2m1/g生药·min。

上述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述水煎煮取8倍水煎煮两次，每次2h,真空减压浓缩至相对密度1.10（50℃），0.45μm微孔滤膜滤过。

上述一种感冒清热颗粒在制备抑制人淋巴瘤细胞U-937细胞增殖药物中的应用。

现有技术中，感冒清热颗粒一次12g，一日2次，采用本发明制备成的感冒清热颗粒一次6g，一日服用2次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。

试验一、不同方法制备的感冒清热颗粒中葛根素含量的比较

1、仪器及试药本发明感冒清热颗粒：按实施例3方法制备，使用1180g原料药，经提取制成400g。原感冒清热颗粒，按《中华药典》2010版标准方法制备，使用1180g原料药，经提取制成400g。UltiMate3000高效液相色谱仪；BP211D电子分析天平；葛根素对照品(中国药品生物制品检定所)。

2、方法 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水（11：89）为流动相；检测波长为250nm。理论板数按葛根素峰计算，应不低于4500。

对照品溶液的制备：取葛根素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加30%甲醇制成每1ml含16μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本发明感冒清热颗粒和原感冒清热颗粒，研细，混匀，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kKz）20分钟，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3、结果

结果表明，本发明感冒清热颗粒中葛根素的含量为27.88mg/12g；而感冒清热颗粒中葛根素的含量为10.32mg/12g，在服用量减少的情况下，葛根素含量有很大提高。

上述研究表明，采用本发明制备的感冒清热颗粒，有效成分含量高于《中华人民共和国药典》2010版标准法制备的感冒清热颗粒。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

取荆芥穗、薄荷、紫苏叶、葛根加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10MPa，萃取时间45min，第二次萃取压力20Mpa，萃取时间45min，第三次萃取压力40Mpa，萃取时间30min，温度40℃，CO₂流量1m1/g生药·min，得超临界萃取物，备用；取防风、柴胡，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入6倍水煎煮两次，每次2h,合并煎液，真空减压浓缩至相对密度1.05（50℃），0.22μm微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入乳糖和硬脂酸镁适量，混和，70%乙醇制颗粒，制成颗粒400g,即得。

经检测，成品中葛根素的含量为27.42mg/15g。

实施例2

取荆芥穗、薄荷、紫苏叶、葛根加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力20MPa，萃取时间75min，第二次萃取压力30Mpa，萃取时间75min，第三次萃取压力50Mpa，萃取时间60min，温度50℃，CO₂流量3m1/g生药·min，得超临界萃取物，备用；取防风、柴胡，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次115分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入8倍水煎煮两次，每次2h,合并煎液，真空减压浓缩至相对密度1.10（50℃），1μm微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入乳糖和硬脂酸镁适量，混和，70%乙醇制颗粒，制成颗粒400g,即得。

经检测，成品中葛根素的含量为27.63mg/15g。

实施例3

取荆芥穗、薄荷、紫苏叶、葛根加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间60min，第二次萃取压力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间45min，温度45℃，CO₂流量2m1/g生药·min，得超临界萃取物，备用；取防风、柴胡，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；其余药材加入8倍水煎煮两次，每次2h,合并煎液，真空减压浓缩至相对密度1.10（50℃），0.45μm微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入乳糖和硬脂酸镁适量，混和，70%乙醇制颗粒，制成颗粒400g,即得。

经检测，成品中葛根素的含量为27.88mg/15g。

实施例4：感冒清热颗粒抑制人淋巴瘤细胞U-937细胞增殖的实验研究资料

1实验材料

1.1实验用细胞株

人淋巴瘤细胞U-937细胞增殖，上海酶联检测技术有限公司，DMEM+10%FBS常规培养。

1.2实验药物

研究药物：本发明感冒清热颗粒：按实施例3方法制备。

药液储液：称取100mg感冒清热颗粒，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。

1.3实验试剂

DMEM（卡迈舒（上海）生物科技有限公司批号：20141102）；胎牛血清FBS（广州蕊特生物科技有限公司批号：20141005）；NaHCO3（广州市昱浩贸易有限公司批号：20140505）；Trypsin（上海雅心生物技术有限公司批号：20140401）；EDTA（广州崇骏化工有限公司批号：2012/10）；Penicillin G Sodium Salt （大连美仑生物技术有限公司 批号：20110214）；Streptomycin Sulfate （上海浩然生物技术有限公司 批号：20130809）；无水乙醇（南阳市恒鑫光电物资有限公司 批号：140910145）；MTT(上海博谷生物科技有限公司批号：20141023);PBS（实验室自配）；

1.4实验器材

金相倒置显微镜（SEEPACK 型号：L-323）；可见-紫外光微孔板检测仪（德国Eppendorf型号：PlateReader AF2200）；CO2培养箱（启前型号：QQ-80A-II）；超净台（东莞市利安达环境科技有限公司型号：LCJT-2A）；纯水仪（超康 型号：CK）；精密移液器（BG-easyPIPET移液器S1000）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BP211D）；全自动高压灭菌锅（上海博迅公司型号：YXQ-LS-75SII）；台式电热鼓风干燥箱（苏州江东精密仪器有限公司型号：DHG-9123A）；液氮罐（四川山立低温设备有限公司型号：CMSH100）；低速离心机上海家舜玻璃仪器有限公司型号：TDL-40B）；0.2μm滤器（密理博:MPGP02001）；10cm培养皿(泰州市建军医疗用品厂)、96孔培养板（泰州市建军医疗用品厂）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。

2实验方法

1）U-937细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。

2）将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中（37℃，5%CO2）常规培养。

3）根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入感冒清热颗粒溶液，继续培养24h。

4）24h后加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

5）4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。

6）同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。

7）结果以药物对细胞的抑制率表示：

细胞增值抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值×100%。实验重复3次。

3统计处理

采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。

4实验结果

MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对PC-3细胞增殖抑制有差异（P<0.05），剂量在10mg/ml时该差异具有显著性（P<0.01），当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P<0.001）。

表1感冒清热颗粒对U-937细胞增殖抑制影响研究（X±SD）

组别	药物浓度(mg/ml)	抑制率（%）
			对照组	0	0
1	5	19.7±12.74
			2	10	24.8±13.68*
3	15	33.6±11.33**
			4	20	43.2±13.75**

注：与对照组比较，*P<0.01；**P<0.001

5实验结论

感冒清热颗粒可以抑制U-937细胞增殖，减少U-937细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。

Claims (6)

1.一种感冒清热颗粒的制备方法，由其特征在于，由以下重量百分比的原料组成荆芥穗200g，薄荷60g，防风100g，柴胡100g，紫苏叶60g，葛根100g，桔梗60g，苦杏仁80g，白芷60g，苦地丁200g，芦根160g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取荆芥穗、薄荷、紫苏叶、葛根加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为3－5%，等温正向加压法萃取，第一次萃取压力10－20MPa，萃取时间45-75min，第二次萃取压力20－30Mpa，萃取时间45-75min，第三次萃取压力40－50Mpa，萃取时间30-60min，温度40－50℃，CO₂流量1－3m1/g生药·min，得超临界萃取物，备用；取防风、柴胡，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次10-15分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集8倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；取其余药材加入6-8倍水煎煮两次，每次2h,合并煎液，真空减压浓缩至相对密度1.05-1.10（50℃），0.22-1μm微孔滤膜滤过，得滤液，备用；将上述超临界萃取物、微波提取物和滤液混合，加入乳糖和硬脂酸镁适量，混和，70%乙醇制颗粒，制成颗粒400g,即得。

2.根据权利要求1所述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%。

3.根据权利要求1所述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取10分钟。

4.根据权利要求1所述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取采用等温正向加压法萃取，第一次萃取压力15MPa，萃取时间60min，第二次萃取压力25Mpa，萃取时间60min，第三次萃取压力45Mpa，萃取时间45min，萃取温度45℃，CO₂流量2m1/g生药·min。

5.根据权利要求1所述一种感冒清热颗粒的制备方法，其特征在于所述水煎煮取8倍水煎煮两次，每次2h,真空减压浓缩至相对密度1.10（50℃），0.45μm微孔滤膜滤过。

6.根据权利要求1所述一种感冒清热颗粒在制备抑制人淋巴瘤细胞U-937细胞增殖药物中的应用。