CN104914277A

CN104914277A - 一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法

Info

Publication number: CN104914277A
Application number: CN201510266195.9A
Authority: CN
Inventors: 董明东; 张帅; 夏丹
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2015-09-16

Abstract

一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法，本发明属于生物医学技术领域，具体地说，本发明涉及一种利用特定仪器对于眼角膜相关疾病致病机理在纳米尺度上识别与分析的方法。本发明发展了一种利用定量纳米力学原子力显微镜在纳米尺度上从形貌和相关力学性质两方面提出于眼角膜相关疾病致病原因的辅助分析方法，并以福克斯内皮角膜营养不良疾病作为例子进行详细的阐述，以证明该方法在眼角膜相关疾病研究中的普适性。

Description

一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地说，本发明涉及一种利用特定仪器对于眼角膜相关疾病致病机理在纳米尺度上识别与分析的方法。

背景技术

众所周知，眼角膜是人类必不可少的功能组织，它是位于眼球前端的一层透明薄摸，由上皮细胞层，前弹力层，基质层，后弹力层和内皮细胞层组成；其在眼球的屈光和眼球的保护中起到重要的作用；正由于眼角膜的特殊结构和重要作用，眼角膜相关疾病对于人类的正常生产生活会产生巨大的影响，目前全世界投入了巨大的资源对于不同眼角膜疾病进行相关研究，虽然取得长足进步，但是对于许多眼角膜疾病微观层面致病机理仍知之甚少,比如常见的福克斯内皮角膜营养不良，致使眼角膜移植仍是主要的根治办法。

发明内容

基于上述的研究可知，开发微观尺度的眼角膜相关疾病的分析方法以寻找胶原蛋白纤维结构上的致病机理的重要性，本发明发展了一种利用定量纳米力学原子力显微镜在纳米尺度上从形貌和相关力学性质两方面提出于眼角膜相关疾病致病原因的辅助分析方法，并以福克斯内皮角膜营养不良疾病作为例子进行详细的阐述，以证明该方法在眼角膜相关疾病研究中的普适性。

本发明的目的在于，提供一种在纳米尺度上利用定量纳米力学原子力显微镜通过形貌和相关力学性质对眼角膜相关疾病致病机理的辅助研究方法，按照下述步骤进行：

（1）利用全飞秒激光微创手术获取相关病变眼角膜样本，并以健康眼角膜样本作为健康对照。

（2）将眼角膜样本平整铺与干净云母表面，氮气氛围干燥。

（3）利用定量纳米力学原子力显微镜在大气下峰值力轻敲模式下对干燥过后的病变眼角膜样本和对照样本进行表征，获得纳米分辨率的眼角膜胶原蛋白纤维形貌图和相对应的定量杨氏模量图。

比较形貌图中的不同特征形貌指纹和杨氏模量分布，确定病变样本中的疑似胶原蛋白纤维病变特征形貌，从而在纳米尺度上推断出眼角膜疾病病症及形成原因。

进一步地，在进行定量纳米力学原子力显微镜表征的前后，利用传统光学显微镜和透射电子显微镜对病变和对照样本切片进行辅助表征，以辅助辨别疑似病变胶原蛋白纤维的形貌特质。

进一步地，将生理盐水滴加在病变样本上，使该样本完全进入在生理盐水中，使得眼角膜处于近生理状态；在液相峰值力轻敲模式下原位重复定量纳米力学原子力显微镜表征，并将浸入生理盐水前后的形貌图和相对应的杨氏模量图进行对照，推断出病变眼角膜在纳米尺度上的致病原因。

步骤1-3是在大气中进行，所以眼角膜处于失水状态，这里是对找到的病变组织在近生理条件下（生理盐水中）进一步的确认，并对其在生理条件下的特点进行确认。

浸入生理盐水前的样品（即为大气下测量样品），先利用大气下峰值力轻敲模式进行纳米力学燕子力显微镜表征，然后同一眼角膜浸入生理盐水后再利用液相峰值力轻敲模式重新表征一次；由于表征时原子力显微镜的扫描探针也浸入在生理盐水中，所以使用的是液相峰值力轻敲模式；由于利用了眼角膜表面的特征形貌进行了标记，所以前后两次扫描的是眼角膜上的同一位置；为眼角膜上在浸入生理盐水前（大气中）和浸入生理盐水后的同一位置。

所述步骤（2）中氮气干燥的时间为24h。

所述干净云母表面是采用透明胶带新剥离过得到的云母表面；新剥离过得云母具有原子级别的平整度，使得云母基底不会在接下来的对眼角膜的原子显微镜测量引入假象；更重要的是新剥离过得云母表面呈超亲水状态而表面吸附有微量的水，此水层有助于使卷曲的1mm后的眼角膜平铺在云母基底上，极大有助于其后原子力显微镜的表征。

综上所述，本发明的目的在于发展一种全新的在纳米尺度上理解眼角膜相关疾病机理的辅助方法。

本发明至少具有以下有益效果：

本发明在纳米尺度上通过定量纳米力学原子力显微镜对比眼角膜主要主城成分的胶原蛋白纤维形貌和力学性能的变化来使人们从胶原蛋白纤维纳米形貌和力学性质的变化的角度，理解一系列眼角膜相关疾病的结构致病机理。

附图说明

图1是福克斯内皮角膜营养不良症中后弹力层增厚及产生水泡的宏观病症示意图和光学显微镜证据；其中插图则显示了利用全飞秒激光微创手术获得病变眼角膜样本的过程片段。

图2是健康眼角膜后弹力层和福克斯内皮角膜营养不良症中病变后弹力层在大气环境中形貌和杨氏模量的对比图；其中图A、B、C、D分别是就正常眼角膜后弹力层在投射电镜下的切片照片和定量纳米力学原子力显微镜的低分辨率、高分辨率和杨氏模量分布图；图E、F、G、H则是对应的福克斯内皮角膜营养不良症中病变后弹力层在投射电镜下的切片照片和定量纳米力学原子力显微镜的低分辨率、高分辨率和杨氏模量分布图；图中白色箭头标注出对比正常后弹力层，病变后弹力层所展现出来的特征变异结构。

图3是福克斯内皮角膜营养不良症中病变后弹力层在浸入生理盐水前后形貌和杨氏模量图的比较；图A和B分别为病变后弹力层同一位置加入生理盐水前后的形貌图，图C和D是从图B中不同放大倍数形貌图，图E为图D相对应的杨氏模量图，图F是图E的杨氏模量分布；灰色箭头之处判定原位扫描的参照物，白色箭头表明病变后弹力层所展现出来的特征变异结构完全吸水前后的位置，可见，浸入生理盐水后，特征变异结构的周期结构消失，转变为突起，特征变异结构相对于正常眼角膜纤维蛋白的杨氏模量减小，图E中的黑色结构，图F中左下角的曲线分布。

具体实施方式 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

1举例病症介绍

福克斯内皮角膜营养不良是一种比较常见的主要影响老年人的眼角膜疾病；主要病症表现为由于内皮细胞层的细胞大量死亡，导致后弹力层影响不良，最终增厚，浑浊，并形成刺痛水泡。最终视力下降甚至失明；虽然人们对该疾病在生理层面的致病原因已经达成共识，但是由于目前眼角膜相关疾病的诊断分析主要依赖于光学仪器，受光源能量和波长的局限，对于后弹力层增厚及产生水泡的微观层面原因仍所知甚少；众所周知眼角膜的主要组成成分是水分子和胶原蛋白纤维，由于胶原蛋白纤维的直径往往处于几十纳米到几百纳米范围，因此传统的光学分析无法对于病变的后弹力层中的胶原蛋白纤维进行分析，以找到后弹力层产生水泡的微观原因。（可参考 L.Dapena, L.Ham, G.R.J.Melles, Current Opinion in Ophthalmology 2009, 20: 299;H.Dlhalis, B.Azizi, U.V.Jurkunas, The Ocular Surface, 2010,4,173, X.Dan, S.Zhang, et al.）

2、具体方法

1）将具有特定病症的眼角膜和健康眼角膜保存在生理盐水中；眼角膜主要通过目前流行的飞秒激光手术方法剥离（如图1所示），剥离下来的眼角膜厚度平均在1mm左右；通过传统光学显微镜方法确认眼角膜相应病症。

图1解释了福克斯内皮角膜营养不良症的宏观眼角膜状态及病症；此外图1 举例了福克斯内皮角膜营养不良病症的眼角膜在光学显微镜下的宏观病症（突起）及飞秒激光手术方法剥离眼角膜的过程照片。

2）将剥离的眼角膜从生理盐水中去除，平铺在用透明胶带新剥离过得云母表面；新剥离过得云母具有原子级别的平整度，使得云母基底不会在接下来的对眼角膜的原子显微镜测量引入假象；更重要的是新剥离过得云母表面呈超亲水状态而表面吸附有微量的水，此水层有助于使卷曲的1mm后的眼角膜平铺在云母基底上，极大有助于其后原子力显微镜的表征。

3）将载有眼角膜的云母片放置在高淳氮气气流中干燥24小时。

4）将干燥后的载有眼角膜的云母片转移到样品台上后，利用商品化的多模式扫描探针显微镜（SPM，Nanoscope VIII型，Bruker公司，美国），实验条件为大气下峰值力轻敲模式，对病症眼角膜及对照眼角膜进行纳米制度的形貌和力学表征，得到AFM图像及对应的杨氏模量分布（如图2A-D和图2E-H所示）.

将病变眼角膜和对照眼角膜平铺于干净韵母表面，然后利用大气下峰值力轻敲模式进行扫描，原子力显微镜便会自动生成所扫描区域的形貌和对应的杨氏模量图。

5）另取刚刚移除的病症眼角膜及对照眼角膜置于含有2%戊二醛和0.1M二甲胂溶液中浸泡，利用透射电子显微镜（CM 100, Philips）获得眼角膜的电子显微镜数据，作为原子力显微镜数据的参考。

图2 分别为病症眼角膜和对照眼角膜的透射电镜图，和定量纳米力学原子力显微镜形貌图与杨氏模量分析；对比于对照眼角膜，病症眼角膜含有周期性的特征结构。

6）取100μl生理盐水滴在病症眼角膜上；由于眼角膜与云母基底均具有亲水的性质，生理盐水会铺展开，并将眼角膜浸没，等待半个小时使得眼角膜充分吸水；利用商品化的多模式扫描探针显微镜（SPM，Nanoscope VIII型，Bruker公司，美国），实验条件转换为液相峰值力轻敲模式，在眼角膜上同一位置重新记录形貌与杨氏模量图，并于之前大气下获得的形貌与杨氏模量图进行对比。

图3是病症眼角膜在浸入生理盐水前后的原位原子力形貌图和对应杨氏模量图与分析；通过对比我们发现，干态下，病症眼角膜中的周期性特征结构在生理盐水中消失，进而转变成较软的突起结构；结合目前医学界所认可的关于福克斯内皮角膜营养不良病症的理解，我们认为此种周期性胶原蛋白结构就是在纳米层面上福克斯内皮角膜营养不良病症的致病结构。

通过上述五个步骤，我们利用定量纳米力学显微镜成功在纳米尺度上表征并理解了眼角膜相关疾病：福克斯内皮角膜营养不良病症的致病结构和机理。并且我们开发的方法对于其他眼角膜疾病也具有普适性。

Claims

1.一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法，其特征在于按照如下步骤进行：

（1）利用全飞秒激光微创手术获取相关病变眼角膜样本，并以健康眼角膜样本作为健康对照；

（2）将眼角膜样本平整铺与干净云母表面，氮气氛围干燥；

（3）利用定量纳米力学原子力显微镜在大气下峰值力轻敲模式下对干燥过后的病变眼角膜样本和对照样本进行表征，获得纳米分辨率的眼角膜胶原蛋白纤维形貌图和相对应的定量杨氏模量图；

2.如权利要求1所述的一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法，其特征在于：在进行定量纳米力学原子力显微镜表征的前后，利用传统光学显微镜和透射电子显微镜对病变和对照样本切片进行辅助表征，以辅助辨别疑似病变胶原蛋白纤维的形貌特质。

3.如权利要求1所述的一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法，其特征在于：将生理盐水滴加在病变样本上，使该样本完全进入在生理盐水中，使得眼角膜处于近生理状态；在液相峰值力轻敲模式下原位重复定量纳米力学原子力显微镜表征，并将浸入生理盐水前后的形貌图和相对应的杨氏模量图进行对照，推断出病变眼角膜在纳米尺度上的致病原因。

4.如权利要求1所述的一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法，其特征在于：所述步骤（2）中氮气干燥的时间为24h。

5.如权利要求1所述的一种眼角膜相关疾病的致病机理分析方法，其特征在于：所述干净云母表面是采用透明胶带新剥离过得到的云母表面；新剥离过得云母具有原子级别的平整度，使得云母基底不会在接下来的对眼角膜的原子显微镜测量引入假象；更重要的是新剥离过得云母表面呈超亲水状态而表面吸附有微量的水，此水层有助于使卷曲的1mm后的眼角膜平铺在云母基底上，极大有助于其后原子力显微镜的表征。