CN104894260A - 一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法，结合链置换技术和滚环扩增放大技术，以miRNA作为“燃料”，构建DNA纳米机器，利用荧光放大的方法检测miRNA；miRNA催化DNA行走链沿着特定的DNA分子轨道有序行走，逐步改变其位置，并引发下一步的反应，通过滚环扩增反应和限制性内切酶酶切反应的双扩增技术，可以产生明显的荧光放大信号；本发明纳米机器采用miRNA作为动力，利用滚环扩增和限制性内切酶剪切的双扩增技术，可很好地用于miRNA的检测，特异性好、灵敏度高；同时，操作容易、选择性高，并在一定范围内呈现出线性关系，本发明有助于DNA纳米机器在生物分析、临床分析、环境分析等领域的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法。
背景技术
核酸，作为由许多核苷酸组成的生物大分子化合物，是生命的最基本物质之一。它们广泛存在于所有动植物，微生物等生物体当中，其主要功能是遗传信息的存储和转移。DNA分子不仅可以作为遗传信息载体，同时也是一种结构精巧的天然生物材料。DNA作为这种生物纳米材料，可塑性强、稳定性高，在生物分析、临床分析、环境分析等领域的应用方面具有很大的潜力。
根据碱基互补配对原则，腺嘌呤(Adenine)与胸腺嘧啶(Thymine)，或在RNA中与尿嘧啶(Uracil)配对，鸟嘌呤(Guanine)与胞嘧啶(Cytosine)配对，从而形成DNA双螺旋结构。DNA链置换反应是利用不同的单链DNA之间形成双螺旋结构的结合力不同，利用不同核酸序列对互补链的竞争，得到热力学稳定性高的双链DNA。链置换反应关键在于通过互补的单链区域(toehold)引发，该区域通常由多个碱基序列组成，然后通过分支迁移过程最终形成稳定性更高的结构。
自然界中，存在很多的分子马达，例如肌动蛋白和肌球蛋白。我们可以利用DNA作为一种结构精巧的生物纳米材料，构建仿生的DNA纳米机器。由于双链DNA具有刚性特征，可以作为分子轨道，加入适当的“燃料”DNA或RNA，就可以很好地驱动DNA分子机器沿着轨道向前移动。
DNA分子具有以下几个优点，合成方法简单，分子量小，存储简单，成本低廉，可以体外扩增，同时更加稳定，能更好地抵御化学物质的攻击。同时还可以具备一定的功能，例如功能性核酸，具有与特异性配体结合的能力以及催化活性。随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸(DNA或RNA)检测的诊断方法(如聚合酶链式反应、滚环扩增、转录介导的扩增技术)已大量建立并获得广泛应用，其在生物化学分析、检测，物质分离，生物传感器方面等有很大的潜力。
miRNA是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的RNA分子，可调节其他基因的表达。miRNA参与各种各样的调节途径，它在肿瘤发生过程中起非常重要的作用，其表达与多种癌症相关，因此特异性的检测miRNA具有很重要的意义。
滚环扩增是一种恒温扩增的方法，以环状DNA为模板，通过一个短链DNA引物(与模板链互补配对)，在phi29DNA聚合酶的催化下将脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)转化成长的单链DNA，该DNA产物由重复序列组成。滚环扩增直接对DNA进行扩增，用来进行信号放大，提高灵敏度。与传统的聚合酶链式反应相比，该方法是恒温，不需要复杂的温控系统，价格低廉。将DNA纳米机器与信号放大技术结合起来应用于传感器的构建，结合目标物或者体系的性质进行探索和尝试，建立高特异性，操作简便，成本低廉的新型生物传感器具有十分重要的意义。该发明表明了DNA纳米机器在实际功能开发方面有很大的潜力，可以作为一个很好的检测平台，通过特定的环境刺激响应，应用于生物分析、临床分析、环境分析等领域。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法，以miRNA作为“燃料”，利用荧光放大的方法检测miRNA，具有专一性识别以及信号放大的双重功能；另外，滚环扩增是一种恒温扩增技术，与传统的聚合酶链式反应等技术相比，具有无需循环控温、线性扩增等优势，该DNA纳米机器采用了miRNA作为动力，利用滚环扩增和限制性内切酶剪切的双扩增技术，可以很好地应用于miRNA的检测，同时作为一个很好的检测平台，通过特定的环境刺激响应，应用于生物分析、临床分析、环境分析等领域。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于测定miRNA的DNA纳米机器，包括DNA分子轨道和DNA行走链，在DNA纳米机器中注入miRNA，以miRNA为动力驱动DNA行走链在DNA分子轨道上向前移动。
该用于测定miRNA的DNA纳米机器的建立方法，将构成DNA纳米机器的所有DNA链在缓冲溶液中按照如下程序降温：90摄氏度，3分钟；65摄氏度，30分钟；45摄氏度，30分钟；37摄氏度，30分钟；25摄氏度，过夜；加入了DNA链之后的反应液总体积为20微升，DNA链的浓度为100纳摩尔每升，其中缓冲溶液的溶剂为去离子水，组份以及含量为：
三羟甲基氨基甲烷，33毫摩尔每升；
醋酸镁，10毫摩尔每升；
醋酸钾，66毫摩尔每升；
吐温20，体积浓度0.1％；
以及，二硫苏糖醇，1毫摩尔每升；
经过退火反应后，其中一部分DNA链组装形成分子轨道，另一部分DNA链作为DNA行走链，得到组装好的DNA纳米机器。DNA行走链可以在DNA分子轨道上向前移动。
在组装好的DNA纳米机器中注入miRNA，于25摄氏度反应2h，miRNA的加入作为“燃料”引发一系列链置换反应，驱动DNA行走链沿着DNA分子轨道向前运动，形成锁式探针(padlock probes)DNA；
然后加入60unit T4 DNA连接酶，将3微升的10×T4连接酶缓冲液混匀，于25摄氏度反应50分钟，使锁式探针DNA连接成环；其中缓冲液溶剂为去离子水，其溶液组份以及含量为：
三羟甲基氨基甲烷，400毫摩尔每升；
氯化镁，100毫摩尔每升；
二硫苏糖醇，100毫摩尔每升；
以及，腺嘌呤核苷三磷酸，5毫摩尔每升；
pH值为7.8。
其测定miRNA的方法，包括如下步骤：
1)进行滚环扩增反应和产物处理
滚环扩增反应：在锁式探针DNA连接成环后的反应溶液中加入1微升的滚环扩增引物，5微升的浓度为5毫摩尔每升的dNTPs和1微升的phi29DNA聚合酶，在37摄氏度反应20分钟，然后在90摄氏度加热10分钟使酶失活，反应停止；
产物处理：将50微升浓度为200纳摩尔每升的荧光标记的DNA底物溶液和10unit的限制性内切酶Nb.Mva1269I加入到滚环扩增反应后的溶液中，混合均匀，于37摄氏度反应60分钟，待荧光分析；
2)荧光检测
将上述待荧光分析的物质加入到96孔板中，利用EnVision多标记微孔板检测仪检测荧光强度，激发波长为495纳米，发射波长为520纳米，由于滚环扩增的产物能够和荧光标记的DNA底物溶液相结合，产生荧光，而且miRNA作为驱动力引发了滚环扩增反应，所以miRNA的量可以用荧光强度的增加来表示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)DNA本身可以作为一种生物纳米材料，可塑性强、稳定性高，在生物分析、临床分析、环境分析等领域的应用方面具有很大的潜力。
(2)滚环扩增是一种恒温扩增技术，与传统的聚合酶链式反应等技术相比，具有无需循环控温、线性扩增等优势。
(3)本发明采用双标记的荧光探针进行检测，整个检测过程简便，耗时短，检测的灵敏度好。
另外，该发明可以很好地应用于miRNA的检测，同时展示了DNA纳米技术在生物分析、临床分析、环境分析等领域的应用方面有很大的潜力。
附图说明
图1为不同含量的let-7a的荧光信号随浓度变化图，浓度变化由上到下分别为10纳摩尔每升，1纳摩尔每升，100皮摩尔每升，10皮摩尔每升，1皮摩尔每升，100飞摩尔每升。
图2为不同含量的let-7a在波长520纳米处的荧光峰值与浓度的关系和线性范围。
图3为相同含量的不同种类的miRNA，let7a，let7e，let7f，let7g的荧光信号图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。
实施例1：构建基于miRNA的DNA纳米机器用于检测let-7a，而对于let7e、let7f、let7g等的检测，与本实施例方法类同。
1)、DNA纳米机器的建立
为了DNA轨道的正确形成，DNA链需要在缓冲溶液中程序降温：90摄氏度(3分钟)，65摄氏度(30分钟)，45摄氏度(30分钟)，37摄氏度(30分钟)，25摄氏度(过夜)。反应总体积为20微升，DNA链的浓度为100纳摩尔每升，其中缓冲溶液的溶剂为去离子水，组份以及含量为：
三羟甲基氨基甲烷，33毫摩尔每升；
醋酸镁，10毫摩尔每升；
醋酸钾，66毫摩尔每升；
吐温20，体积浓度0.1％；
以及，二硫苏糖醇，1毫摩尔每升；
经过退火反应后，得到组装好的DNA纳米机器。
2)、DNA行走链沿着轨道运动并成环
在组装好的DNA样品中，加入let-7a，置于25摄氏度反应2h。miRNA的加入将引发一系列链置换反应，驱动DNA行走链沿着DNA分子轨道向前运动，形成锁式探针(padlock probes)DNA。
然后加入T4DNA连接酶，3微升的10×T4连接酶缓冲液混匀，于25摄氏度反应50分钟，使锁式探针DNA连接成环。
其中缓冲液溶剂为去离子水，其溶液组份以及含量为：
三羟甲基氨基甲烷，400毫摩尔每升；
氯化镁，100毫摩尔每升；
二硫苏糖醇，100毫摩尔每升；
以及，腺嘌呤核苷三磷酸，5毫摩尔每升；
pH值为7.8。
3)、滚环扩增反应和产物处理
滚环扩增反应：在锁式探针DNA连接成环后的反应溶液中加入1微升的滚环扩增引物，5微升的浓度为5毫摩尔每升的dNTPs和1微升的phi29DNA聚合酶，在37摄氏度反应20分钟，然后在90摄氏度加热10分钟使酶失活，反应停止；
产物处理：将50微升浓度为200纳摩尔每升的荧光标记的DNA底物溶液和10unit的限制性内切酶Nb.Mva1269I加入到滚环扩增反应后的溶液中，混合均匀，于37摄氏度反应60分钟，待荧光分析；
4)、荧光检测
将反应后的样品加入到96孔板中，利用EnVision Multilabel Plate Readers(PerkinElmer，USA)检测荧光强度。激发波长为495纳米，发射波长为520纳米。由于滚环扩增的产物能够和荧光标记的DNA底物溶液相结合，产生荧光，而且miRNA作为驱动力引发了滚环扩增反应，所以miRNA的量可以用荧光强度的增加来表示。
该DNA纳米机器可以很好地用于检测miRNA，且特异性较高。图1表明，随着miRNA浓度的增加，荧光强度明显增加。图2表明在100飞摩尔每升-1纳摩尔每升浓度范围内，let-7a浓度测定曲线表现出良好的线性关系。图3为相同含量的不同种类的miRNA，let7a，let7e，let7f，let7g的荧光信号图，表明该发明具有很强的特异性。总体上，本发明发明操作简单，为DNA纳米技术应用于生物分析、临床分析、环境分析等领域提供了很大的可能性。
Claims (3)
1.一种用于测定miRNA的DNA纳米机器，包括DNA分子轨道和DNA行走链，其特征在于，在DNA纳米机器中注入miRNA，以miRNA为动力驱动DNA行走链在DNA分子轨道上向前移动。
2.权利要求1所述用于测定miRNA的DNA纳米机器的建立方法，其特征在于，将构成DNA纳米机器的所有DNA链在缓冲溶液中按照如下程序降温：90摄氏度，3分钟；65摄氏度，30分钟；45摄氏度，30分钟；37摄氏度，30分钟；25摄氏度，过夜；加入了DNA链之后的反应液总体积为20微升，DNA链的浓度为100纳摩尔每升，其中缓冲溶液的溶剂为去离子水，组份以及含量为：
三羟甲基氨基甲烷，33毫摩尔每升；
醋酸镁，10毫摩尔每升；
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在组装好的DNA纳米机器中注入miRNA，于25摄氏度反应2h，miRNA的加入作为“燃料”引发一系列链置换反应，驱动DNA行走链沿着DNA分子轨道向前运动，形成锁式探针(padlock probes)DNA；
然后加入60unit T4DNA连接酶，将3微升的10×T4连接酶缓冲液混匀，于25摄氏度反应50分钟，使锁式探针DNA连接成环；其中缓冲液溶剂为去离子水，其溶液组份以及含量为：
三羟甲基氨基甲烷，400毫摩尔每升；
氯化镁，100毫摩尔每升；
二硫苏糖醇，100毫摩尔每升；
以及，腺嘌呤核苷三磷酸，5毫摩尔每升；
pH值为7.8。
3.权利要求2所述DNA纳米机器的测定miRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)进行滚环扩增反应和产物处理
滚环扩增反应：在锁式探针DNA连接成环后的反应溶液中加入1微升的滚环扩增引物，5微升的浓度为5毫摩尔每升的dNTPs和1微升的phi29DNA聚合酶，在37摄氏度反应20分钟，然后在90摄氏度加热10分钟使酶失活，反应停止；
产物处理：将50微升浓度为200纳摩尔每升的荧光标记的DNA底物溶液和10unit的限制性内切酶Nb.Mva1269I加入到滚环扩增反应后的溶液中，混合均匀，于37摄氏度反应60分钟，待荧光分析；
2)荧光检测
将上述待荧光分析的物质加入到96孔板中，利用EnVision多标记微孔板检测仪检测荧光强度，激发波长为495纳米，发射波长为520纳米，以荧光强度的增加表示miRNA的量。
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